王先桂，鄭 艷，曾 丹，許華杰，姚玉霖，張昌發(fā)，胡鵬剛

（1.茅臺(tái)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)教學(xué)中心，貴州 遵義 564501；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州 遵義 563000）

洛黨參因初產(chǎn)于貴州遵義市道真縣洛龍鎮(zhèn)而得名，為桔?？泣h參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）屬植物，是道真縣地方特色中藥材[1]。黨參屬植物具有多種藥理作用，如黨參多糖能夠起到降低血糖[2]、抗腫瘤等作用[3]；黨參乙醇提取物具有顯著的抑菌作用[4]，此外，黨參屬植物還具有抗應(yīng)激、抗氧化、消炎、改善生長(zhǎng)性能和提高記憶力等功能[4-5]。2014年04月08日，原國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)對(duì)洛黨參實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)，產(chǎn)地范圍為貴州省道真縣現(xiàn)轄行政區(qū)域[6]。關(guān)于洛黨參的研究目前主要集中在栽培技術(shù)[7-12]、貯藏保鮮[13]、質(zhì)量評(píng)價(jià)[14-15]和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[16]上，對(duì)提高洛黨參應(yīng)用價(jià)值的研究還較少。

超臨界流體萃取技術(shù)是一種新型萃取技術(shù)，具有選擇性強(qiáng)、萃取率高、能耗少、無試劑污染、活性成分保留完好等特點(diǎn)，特別適用于食材或藥材的提取[17]。劉同舉等[18-20]對(duì)超臨界CO2萃取黨參工藝進(jìn)行了相關(guān)研究，而目前利用超臨界CO2萃取洛黨參的工藝及萃取物應(yīng)用的研究較少。將洛黨參萃取物添加到醬香型白酒中一方面可以為洛黨參的應(yīng)用提供一個(gè)新的參考方向，另一方面可為其在醬香型白酒勾調(diào)技術(shù)應(yīng)用上提供一個(gè)新的選擇。

本研究以洛黨參為研究對(duì)象，使用超臨界CO2萃取技術(shù)對(duì)洛黨參進(jìn)行萃取，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化萃取工藝，并將洛黨參萃取物與醬香型基酒融合成露酒，為洛黨參的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)和一定的方向，有利于提高洛黨參產(chǎn)業(yè)附加值，拓寬應(yīng)用途徑，助力鄉(xiāng)村振興。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洛黨參：貴州省遵義市道真縣洛龍鎮(zhèn)；53%vol醬香型白酒半成品：茅臺(tái)鎮(zhèn)購(gòu)買；食品級(jí)CO2：遵義市望江氣體有限公司；無水乙醇（分析純）：重慶萬盛川東化工有限公司；黨參炔苷（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；乙腈（色譜級(jí)）：上海阿拉丁生化科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE-2超臨界CO2萃取系統(tǒng)：美國(guó)ASI公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Agilent公司；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW400A高速萬能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；TDL-80-2B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；CU-420恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇品相飽滿、無蛀蟲、無腐爛、干燥的洛黨參，清理干凈附著在其表面的殘留塵土，然后切成長(zhǎng)度1～2 cm的根塊，經(jīng)粉碎機(jī)破碎，過篩分級(jí)，通過不同目數(shù)的篩子得到相應(yīng)物料的粒徑，分裝待用。

1.3.2 洛黨參的萃取

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量、一定粒度的樣品裝入萃取釜中，裝填量為萃取釜的90%，在萃取溫度55 ℃、壓強(qiáng)25 MPa、CO2流速3 L/min的條件下萃取60 min，由于洛黨參為干燥樣品，故采用無水乙醇作為夾帶劑在0.2 mL/min的流速條件下進(jìn)行萃取，在超臨界CO2通過樣品的萃取作用下使洛黨參的成分被盡可能的萃取出來，最后減壓使之兩者分離得到萃取物，稱其質(zhì)量，計(jì)算萃取率[18]，其計(jì)算公式如下：

1.3.3 洛黨參萃取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

采用單因素輪換法依次考察物料粒度（10目、20目、40目、60目）、萃取溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、萃取壓強(qiáng)（20 MPa、25 MPa、30MPa、35MPa、40 MPa、45MPa）及萃取時(shí)間（40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min）對(duì)洛黨參物質(zhì)萃取率的影響。

1.3.4 洛黨參萃取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以物料粒度（A）、萃取溫度（B）、萃取壓強(qiáng)（C）、萃取時(shí)間（D）為自變量，以萃取率（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 10.0.7軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[21-23]，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 洛黨參超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for supercritical CO2 extraction technology optimization of Luolong Codonopsis pilosula

1.3.5 洛黨參萃取物醬香露酒的制備

以53%vol醬香型白酒為基酒，稱取洛黨參萃取物0.407 g溶于50 mL基酒，離心去除不溶性物質(zhì)后得到質(zhì)量濃度為8.140mg/mL的洛黨參萃取物配制液，按表2的比例將洛黨參萃取物配制液和基酒行進(jìn)配制得到洛黨參萃取物醬香露酒。

表2 洛黨參萃取物配制液與基酒的比例Table 2 Ratio of preparation liquid of Luolong Codonopsis pilosula extracts and base liquor

1.3.6 洛黨參萃取物醬香露酒的感官評(píng)定

參考GB/T 27588—2011《露酒》[24]設(shè)計(jì)洛黨參萃取物醬香露酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在白酒專業(yè)品酒室，由3名省級(jí)白酒評(píng)委和2名長(zhǎng)期從事品酒工作的人員組成品評(píng)組，對(duì)洛黨參萃取物醬香露酒的外觀、香氣、口感及風(fēng)格進(jìn)行感官評(píng)定，滿分100分，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 洛黨參萃取物醬香露酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards of Luolong Codonopsis pilosula extracts sauce-flavor Lujiu

1.3.7 洛黨參萃取物醬香露酒品質(zhì)分析

根據(jù)GB/T 27588—2011《露酒》[24]要求測(cè)定洛黨參萃取物醬香露酒的理化和衛(wèi)生指標(biāo)，并采用高效液相色譜法測(cè)定露酒中黨參炔苷含量[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2萃取洛黨參工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 物料粒度對(duì)萃取率的影響

不同物料粒度對(duì)洛黨參萃取率的影響見圖1。由圖1可知，在物料粒度10～40目范圍內(nèi)，洛黨參萃取率會(huì)隨著物料粒度目數(shù)的增大而增大，分析原因可能是，隨著洛黨參顆粒越來越小，萃取時(shí)越有助于CO2流體進(jìn)入到顆粒的內(nèi)部，從而帶出更多的膏體物質(zhì)[18]；當(dāng)物料粒度＞40目時(shí)，萃取率開始下降，分析原因可能是，顆粒過小導(dǎo)致顆粒之間的間隙變小，增大了傳質(zhì)阻力反而不利于萃取[18]。當(dāng)物料粒度為40目時(shí)，洛黨參萃取物的萃取率最高，為1.681%，超過了劉同舉等[18]在該物料粒度條件下1.250%的黨參萃取率，因此，確定最佳的物料粒度為40目。

圖1 物料粒度對(duì)萃取率的影響Fig.1 Effect of material particle size on extraction rate

2.1.2 萃取溫度對(duì)萃取率的影響

CO2處于超臨界狀態(tài)時(shí)的臨界溫度是31.1 ℃，故試驗(yàn)的萃取溫度不能低于該溫度值，同時(shí)超臨界CO2萃取的物質(zhì)一般為熱敏感性物質(zhì)，萃取釜的溫度設(shè)置最好在35～60℃[27]。不同萃取溫度對(duì)洛黨參萃取率的影響見圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate

由圖2可知，在萃取溫度40～55 ℃范圍內(nèi)，升溫可以提高萃取率，但當(dāng)萃取溫度高于55 ℃之后，升溫反而會(huì)降低萃取率。分析原因可能是，升溫能提高萃取物的飽和蒸氣壓從而提高其在超臨界流體中的溶解度，同時(shí)增加了流體的擴(kuò)散速率利于傳質(zhì)，但萃取溫度過高會(huì)降低超臨界流體的密度從而影響其溶解能力，CO2流體與萃取物的結(jié)合能力和攜帶能力下降從而使得萃取率下降[18-19]。當(dāng)萃取溫度為55 ℃時(shí)，萃取率最高為1.694%，這與劉同舉等[18-20]的研究結(jié)果一致，因此，確定最佳萃取溫度為55 ℃。

2.1.3 萃取壓強(qiáng)對(duì)萃取率的影響

不同萃取壓強(qiáng)對(duì)洛黨參萃取率的影響見圖3。由圖3可知，壓強(qiáng)是影響超臨界萃取率的重要因素之一，萃取壓強(qiáng)增大有利于洛黨參的超臨界萃取，壓強(qiáng)太小，當(dāng)萃取壓強(qiáng)為20 MPa時(shí)，萃取率僅有1.522%；當(dāng)萃取壓強(qiáng)上升至30 MPa時(shí)，萃取率可以達(dá)到1.695%；壓強(qiáng)繼續(xù)增大，萃取率基本保持不變。這有可能是由于CO2流體的溶解能力與其密度有關(guān)，當(dāng)萃取溫度一定時(shí)，CO2流體的密度與壓強(qiáng)為正相關(guān)關(guān)系，壓強(qiáng)增大會(huì)使CO2流體密度增大，其溶解能力也就增強(qiáng)，所以萃取率逐漸升高[18-20]；當(dāng)萃取壓力增加到一定值時(shí)，CO2流體的溶解能力達(dá)到平衡，增加萃取壓強(qiáng)，萃取率將基本保持不變。當(dāng)萃取壓強(qiáng)為30 MPa時(shí)，萃取率已基本達(dá)到最高，萃取率為1.695%，超過了劉同舉等[18，20]在該條件下的黨參萃取率。綜合考慮經(jīng)濟(jì)合理、設(shè)備穩(wěn)定和實(shí)現(xiàn)最大產(chǎn)量3個(gè)方面，確定最佳萃取壓強(qiáng)為30 MPa。

圖3 萃取壓強(qiáng)對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction pressure on extraction rate

2.1.4 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響

萃取時(shí)間對(duì)洛黨參萃取率的影響見圖4。由圖4可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取率呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，分析原因可能是萃取時(shí)間＜60 min前，萃取物不斷累積，到60 min左右時(shí)到達(dá)萃取平衡狀態(tài)，萃取率達(dá)到最大值，萃取60 min之后萃取率基本保持不變；當(dāng)萃取時(shí)間為60 min時(shí)，萃取率已基本達(dá)到最高，萃取率為1.696%，超過了劉同舉等[18，20]在該條件下的萃取率。達(dá)到萃取平衡后繼續(xù)萃取可能對(duì)萃取物成分有所影響，同時(shí)增加CO2流體消耗，綜合考慮經(jīng)濟(jì)合理、工作效率和實(shí)現(xiàn)最大產(chǎn)量3個(gè)方面，故選擇最佳的萃取時(shí)間為60 min。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

2.2 洛黨參萃取條件優(yōu)化響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 洛黨參超臨界CO2萃取工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for supercritical CO2 extraction technology optimization of Luolong Codonopsis pilosula

續(xù)表

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

運(yùn)用Design Expert 10.0.7軟件對(duì)表4試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到萃取率響應(yīng)面的回歸方程為：

由表5可知，模型的P＜0.01，極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.507 1，不顯著；說明回歸模型擬合性好，用于分析萃取壓強(qiáng)、物料粒度、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)洛黨參萃取率的影響是有意義的。模型決定系數(shù)R2為0.979 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.991 0，說明該模型擬合程度較好。由表5亦可知，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AC、BC、BD、CD及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AD對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

各因素間交互作用對(duì)萃取率影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。由圖5可知，在交互作用中，萃取壓強(qiáng)與物料粒度、萃取壓強(qiáng)與萃取溫度、物料粒度與萃取溫度、萃取溫度與萃取時(shí)間交互作用對(duì)萃取率影響的響應(yīng)曲面走勢(shì)相對(duì)較陡，說明其影響顯著；萃取壓強(qiáng)與萃取時(shí)間交互作用對(duì)萃取率影響的響應(yīng)面走勢(shì)相對(duì)平滑，說明其影響不顯著；該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素間交互作用對(duì)萃取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on extraction rate

2.2.2 最佳條件確定及驗(yàn)證

通過Design Expert 10.0.7軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行求解，得出最優(yōu)萃取條件為：萃取壓強(qiáng)31.2 MPa、物料粒度53.8目、萃取溫度52.8 ℃、萃取時(shí)間63.5 min，預(yù)測(cè)的萃取率為1.691%。為便于實(shí)際操作，將最優(yōu)萃取條件修定為萃取壓強(qiáng)31 MPa、物料粒度50目、萃取溫度53 ℃、萃取時(shí)間64 min，為了驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際試驗(yàn)得到的結(jié)果是否一致，在最優(yōu)條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，得到的萃取率為1.698%，重復(fù)試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.391%，這與試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷念A(yù)測(cè)值相差不大，說明優(yōu)化結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.3 洛黨參萃取物醬香露酒品質(zhì)分析

2.3.1 洛黨參萃取物醬香露酒的感官評(píng)定

洛黨參萃取物醬香露酒的感官評(píng)分見表6。

表6 洛黨參萃取物醬香露酒的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 6 Sensory evaluation results of Luolong Codonopsis pilosula extracts sauce-flavor Lujiu

由表6可知，在外觀色澤方面，1#露酒無色、清澈透明，2#～4#露酒呈清澈透明的微黃色，且隨著洛黨參萃取物含量的增加而逐漸加深，4#露酒呈現(xiàn)較為明顯的微黃色，4個(gè)露酒酒體均無沉淀和雜質(zhì)，無渾濁感；在香氣感官方面，1#露酒醬香濃郁，但帶有一點(diǎn)微弱的咸菜味，無洛黨參特征香氣，2#露酒醬香濃郁，同時(shí)還帶有一種植物特殊清香及洛黨參生青味，給酒體增加了清新感但洛黨參特征香氣不明顯，3#露酒醬香濃郁，洛黨參獨(dú)有藥香濃郁，香氣協(xié)調(diào)自然，4#露酒醬香濃郁，洛黨參藥香味則過于突出，不愉快感覺明顯，香氣不夠協(xié)調(diào)；在口感評(píng)價(jià)方面，4個(gè)酒體都具有醇厚感，1#露酒刺激感強(qiáng)烈，伴有輕微的苦澀味，2#露酒刺激感同樣強(qiáng)烈，但苦澀味減弱，3#和4#露酒刺激感有減弱，苦澀味感覺輕微，吞咽后柔和回甜；在風(fēng)格綜合評(píng)價(jià)方面，2#和3#露酒都很協(xié)調(diào)，但兩者側(cè)重點(diǎn)不同，2#露酒為醬香中帶有植物清香，3#露酒為醬香中帶有洛黨參獨(dú)特藥香，4#露酒回甜感較強(qiáng)但洛黨參藥香味過于突出顯得香氣不夠協(xié)調(diào)。

通過評(píng)定，綜合得分最高的為3#露酒，感官評(píng)分為93分，微黃透明、醬香濃郁，洛黨參香舒適，入口醇厚微甜，回味悠長(zhǎng)，風(fēng)格突出。露酒在香氣上賦予醬香酒特殊藥香味，增加了香氣的復(fù)雜性和層次感，在口感上增加了回甜可以減弱高度酒帶來的刺激感，使酒體更加協(xié)調(diào)。對(duì)于露酒的最佳配制方案可根據(jù)受眾人群偏好以3#露酒酒體為基礎(chǔ)圍繞洛黨參萃取物添加量進(jìn)行微調(diào)以達(dá)到不同人群的要求。

2.3.2 洛黨參萃取物醬香露酒的理化及衛(wèi)生指標(biāo)

由表7可知，1#～4#露酒酒體的理化指標(biāo)及衛(wèi)生指標(biāo)均符合GB/T 27588—2011《露酒》[24]要求，產(chǎn)品均合格，其中綜合得分最高的3#露酒，其洛黨參特征性指標(biāo)黨參炔苷含量為0.53 mg/L。

表7 洛黨參萃取物醬香露酒的理化及衛(wèi)生指標(biāo)Table 7 Physicochemical and hygiene indicators of Luolong Codonopsis pilosula extracts sauce-flavor Lujiu

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到超臨界CO2萃取洛黨參最優(yōu)工藝為：萃取壓強(qiáng)31 MPa、物料粒度50目、萃取溫度53 ℃、萃取時(shí)間64 min，在此條件下，洛黨參萃取率為1.698%。超臨界CO2萃取洛黨參得到的萃取物與醬香型基酒配制成萃取物質(zhì)量濃度為2.220 mg/mL的露酒，感官評(píng)分最高（93分），理化指標(biāo)及衛(wèi)生指標(biāo)均滿足國(guó)標(biāo)要求，黨參炔苷含量為0.53 mg/L，可以作為洛黨參較好的一個(gè)應(yīng)用方向。