張彥贈(zèng)，湯曉娟，林祥娜，紀(jì)艷青，賀紅軍，楊宏專，劉云國(guó)*

（1.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；3.臨沂惟一齋醬園，山東 臨沂 276000）

豆豉作為中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一，因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和爽膩的口感，受到了眾多人們的喜愛(ài)，被廣泛用作調(diào)味品和開(kāi)胃菜[1]。豆豉富含多種功能活性物質(zhì)，具有抗氧化活性、抗糖尿病活性和降壓活性等藥用特性[2-3]，成為了目前眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。通常豆豉按照制曲階段中主要發(fā)酵微生物的類型分為細(xì)菌型、毛霉型、曲霉型、根霉型豆豉，其中，細(xì)菌型豆豉是指在制曲過(guò)程中沒(méi)有采用人工發(fā)酵菌種接種于煮熟后的大豆，而是以散落在室內(nèi)空氣中的微生物進(jìn)行自然接種[4]。八寶豆豉就是細(xì)菌型豆豉的一種，是一種純自發(fā)的、完全依靠本地特有的微生物進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)品。相傳八寶豆豉起源于清朝，興起于山東臨沂，現(xiàn)已成為臨沂當(dāng)?shù)匾环N地方特色食品，是當(dāng)?shù)厝藗儽夭豢缮俚募页２恕：?jiǎn)單來(lái)說(shuō)八寶豆豉是集黑豆、茄子、鮮姜、花椒、紫蘇葉、杏仁、白酒、香油八種原料為一體，制作時(shí)先將大豆進(jìn)行初發(fā)酵，即所謂的制曲，同時(shí)將其他配料進(jìn)行初步的加工和腌制，并按一定的配方，將這八種原料進(jìn)行混合，在發(fā)酵缸中密封，進(jìn)行露天發(fā)酵，即進(jìn)入后發(fā)酵階段，經(jīng)過(guò)1年多的后發(fā)酵即可成熟。成熟的豆豉色澤亮麗，醇厚清香，食之開(kāi)胃，去膩爽口。由于集齊八種原料進(jìn)行發(fā)酵，故名八寶豆豉[5-6]。

就八寶豆豉制曲過(guò)程而言，利用當(dāng)?shù)靥赜械奈⑸镌陂_(kāi)放的曲房中對(duì)大豆初步分解，大豆中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪等進(jìn)行初步降解，形成小分子物質(zhì)，并產(chǎn)生各種酶類，為后發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行分解奠定基礎(chǔ)，也是決定后發(fā)酵產(chǎn)生各種功能成分和風(fēng)味優(yōu)劣的關(guān)鍵[7]。因此，制曲過(guò)程極大的影響著八寶豆豉產(chǎn)品的質(zhì)量。然而在這種開(kāi)放制曲的環(huán)境中，各種復(fù)雜微生物都會(huì)參與該過(guò)程，包括有利于發(fā)酵的，不利于發(fā)酵的，甚至對(duì)人體有害的，且這種純自發(fā)的方式，很容易受到來(lái)自氣候條件、工人的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)、本地的微生物等條件影響[8]，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量往往參差不齊，難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、安全化生產(chǎn)，亟需改進(jìn)傳統(tǒng)工藝，篩選出益酵菌株，進(jìn)行純種發(fā)酵。因此，獲得八寶豆豉制曲中的微生物群落演替信息具有重要的意義。李華等[9]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)八寶豆豉中的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分離和鑒定，結(jié)果顯示優(yōu)勢(shì)菌全部為芽孢桿菌屬（Bacillus）。然而傳統(tǒng)培養(yǎng)法在全面揭示豆豉微生物信息上局限性比較大[10]。近幾年，高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物菌群動(dòng)態(tài)研究。如王娜等[11]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)貴州3種不同類型的細(xì)菌型豆豉進(jìn)行研究，并鑒定出3類豆豉均以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬；馬上超等[12]同樣利用高通量技術(shù)對(duì)5種淡豆豉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究，并鑒定出5種優(yōu)勢(shì)菌屬?？梢?jiàn)相較于傳統(tǒng)培養(yǎng)，高通量測(cè)序技術(shù)研究微生物演替規(guī)律能夠更加全面和成熟。然而，針對(duì)于八寶豆豉的有關(guān)微生物演替的研究卻少有報(bào)道。

因此，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)八寶豆豉制曲過(guò)程中的微生物群落演替規(guī)律進(jìn)行研究，進(jìn)而揭示制曲過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物。同時(shí)，由于制曲階段微生物所產(chǎn)的蛋白酶對(duì)賦予豆豉良好口味和功能活性具有重要作用[13]。因此，對(duì)制曲期間的蛋白酶活性，包括酸性、中性、堿性蛋白酶活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定，并通過(guò)皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析探索與高產(chǎn)蛋白酶活相關(guān)的潛在優(yōu)勢(shì)菌屬，旨在為探索符合制曲要求的優(yōu)勢(shì)菌屬，以及篩選高產(chǎn)蛋白酶的菌種提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豉曲：臨沂市唯一齋醬園；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit：上海索寶生物科技有限公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒：上海玉博生物科技有限公司；2×HieffRobust聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads：上海翊圣生物科技有限公司；Folin試劑、磷酸二氫鈉、三氯乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；干酪素、乳酸、硼砂（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；酪氨酸（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；乳酸鈉（分析純）：天津市鼎盛鑫有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)：Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)：上海復(fù)日科技有限公司；Q32866 Qubit3.0熒光計(jì)：Invitrogen；ETC 811 PCR儀：北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 八寶豆豉曲的制作

由于豆豉的制作受季節(jié)的影響較大，需在每年的6～7月進(jìn)行。制曲工藝流程[6]：

黑豆清洗→常壓蒸煮→晾曬→曲房制曲→晾曬洗曲→豉曲

操作要點(diǎn)：

常壓蒸煮：用清水進(jìn)行常壓蒸煮，料水比為1∶1（50 kg黑豆∶50 kg水），煮制黑豆八分熟，時(shí)間約30 min。

晾曬：將蒸煮完成的黑豆均勻攤曬在篩網(wǎng)上，在陽(yáng)光下瀝干水分。

曲房制曲：將晾曬好的黑豆均勻的分?jǐn)傇谇厣?，厚度約3 cm為宜，曲房溫度控制在35～37 ℃，必要時(shí)進(jìn)行加熱升溫或通風(fēng)降溫。發(fā)酵約5 d后，待黑豆上面布滿密集的“黃毛”，即制曲完成。

晾曬洗曲：將發(fā)酵好的黑豆均勻攤曬在篩網(wǎng)上，在陽(yáng)光下進(jìn)行晾曬、翻動(dòng)。待“黃毛”極易脫落，即曬至完成。后用篩網(wǎng)篩動(dòng)黑豆、搓掉“黃毛”，用涼透的開(kāi)水再洗去黑豆表面殘余的“黃毛”，盡快撈出，晾曬干備用。即得豉曲。

1.3.2 八寶豆豉曲的取樣

在曲房制曲中，從第一天進(jìn)行取樣，每隔24 h取一次樣，直至制曲結(jié)束。每次取樣時(shí)，分別取上、中、下位置，每個(gè)位置取3次，并充分混合，作為一個(gè)代表樣本。共計(jì)5個(gè)樣本，分別命名為D1、D2、D3、D4、D5，同時(shí)這些樣本也代表了制曲階段的5個(gè)不同時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)所用的豉曲取自臨沂市唯一齋醬園。

1.3.3 豉曲樣品微生物菌群的高通量測(cè)序

基因組DNA的提?。悍Q取3 g豆豉樣品，加入液氮研磨至細(xì)粉，稱取0.3 g細(xì)粉于樣品管，在組織破碎儀中進(jìn)行破碎，按照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒提取宏基因組DNA。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性以及Qubit定量檢測(cè)DNA樣本濃度。

PCR擴(kuò)增：以提取的基因組DNA為模板，選用正向引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3）'和反向引物805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3）'對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用正向引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）'和反向引物ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）'對(duì)真菌ITS1-ITS2區(qū)域基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第一輪PCR擴(kuò)增體系：2×HieffRobust PCR Master Mix 15 μL，正反向引物各1 μL，DNA模板25 ng，補(bǔ)雙蒸水（ddH2O）至總體系30 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃、3min；94 ℃、30 s，45℃、20 s，65 ℃、30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。第二輪PCR擴(kuò)增體系：2×HieffRobust PCR Master Mix 15 μL，正反向引物各1 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，補(bǔ)ddH2O至總體積30 μL；PCR擴(kuò)增條件：95 ℃、3 min；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，5個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)文庫(kù)大小以及Qubit定量檢測(cè)文庫(kù)樣本濃度。

高通量測(cè)序：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工有限公司，采用Illumina MiseqTM平臺(tái)進(jìn)行二代測(cè)序。

1.3.4 蛋白酶活的測(cè)定

參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》[14]中的福林法測(cè)定蛋白酶活性。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Illumina MiSeq PE300對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，按照97%的相似性進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析、物種注釋、Alpha多樣性分析。細(xì)菌通過(guò)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）和GTDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//gtdb.ecogenomic.org/）進(jìn)行分類；真菌使用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)UNITE（http：//unite.ut.ee/index.php）數(shù)據(jù)庫(kù)。采用R語(yǔ)言（V 4.0.0）繪制稀釋曲線、香農(nóng)指數(shù)曲線、主坐標(biāo)和層級(jí)聚類圖；采用Origin2021（v 9.8.0.200）繪制蛋白酶活變化曲線圖；采用聯(lián)川生物平臺(tái)（https：//www.omicstudio.cn/tool）繪制皮爾森相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 八寶豆豉制曲階段微生物菌群高通量測(cè)序結(jié)果及Alpha多樣性分析結(jié)果

為了解每個(gè)樣本測(cè)序信息是否具有代表性，對(duì)樣本的有效序列進(jìn)行稀釋曲線分析和香農(nóng)曲線分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，細(xì)菌和真菌菌群的稀釋曲線和香農(nóng)曲線都隨著測(cè)序量的增大逐漸趨于平緩，細(xì)菌和真菌菌群的多樣性也不會(huì)隨著測(cè)序量的增加而變化[15-16]，說(shuō)明本次測(cè)序量合理，足夠代表整個(gè)樣本的微生物多樣性信息，并可以進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)。對(duì)八寶豆豉制曲過(guò)程中5個(gè)不同時(shí)期的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序后，按照97%以上的相似水平對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，并進(jìn)行α-多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 八寶豆豉制曲階段細(xì)菌及真菌菌群的稀釋曲線（a、c）和香農(nóng)曲線（b、d）Fig.1 Dilution curves (a,c) and Shannon curves (b,d) of bacterial and fungal flora during the koji-making process of Ba-bao Douchi

由表1可知，通過(guò)高通量測(cè)序共獲得260 317條細(xì)菌、264 408條真菌序列，按照97%以上的相似水平對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分，得到67個(gè)細(xì)菌OTUs和105個(gè)真菌OTUs。Chao1指數(shù)是用來(lái)衡量一個(gè)群落中物種豐度的指標(biāo)，且與物種豐度變化呈正相關(guān)[17]。在整個(gè)制曲階段，細(xì)菌菌群的Chao1指數(shù)以及OTUs整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并且整體變化較穩(wěn)定。值得注意的是，在制曲第4天時(shí)，細(xì)菌群落達(dá)到最高的豐度，說(shuō)明第4天的細(xì)菌菌群微生物豐度最高。而真菌菌群與細(xì)菌菌群相反，真菌菌群在第4天達(dá)到了最低的物種豐度。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來(lái)衡量群落多樣性的指數(shù)，其中Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正比關(guān)系，而Simpson指數(shù)與群落多樣性呈反比關(guān)系[18]。制曲期間，細(xì)菌菌群的Shannon指數(shù)遠(yuǎn)高于真菌菌群，說(shuō)明在制曲階段，細(xì)菌菌群的多樣性高于真菌菌群的多樣性[19]。同時(shí)值得注意的是，在制曲第4天，細(xì)菌和真菌菌群的多樣性最低?？偟膩?lái)說(shuō)，在整個(gè)制曲過(guò)程中，細(xì)菌和真菌菌群的豐度和多樣性均發(fā)生了明顯的變化。推測(cè)這可能是因?yàn)榄h(huán)境如發(fā)酵酸度及營(yíng)養(yǎng)條件如水分等因素發(fā)生變化，以及某些微生物，與其自身及其他微生物存在一定的競(jìng)爭(zhēng)作用等[20-21]。

表1 八寶豆豉制曲階段樣品的高通量測(cè)序結(jié)果及Alpha多樣性分析結(jié)果Table 1 Result of high-throughput sequencing and Alpha diversity analysis of Ba-bao Douchi samples during the koji-making process

2.2 基于屬水平八寶豆豉制曲階段微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

制曲階段，豆豉樣本中的微生物菌群在屬水平上共注釋到45個(gè)細(xì)菌屬和83個(gè)真菌屬，其中6個(gè)菌屬被確定為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（相對(duì)豐度＞1%），3個(gè)菌屬被確定為優(yōu)勢(shì)真菌屬（相對(duì)豐度＞1%）[22]，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在制曲階段，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）、亞硝化單胞菌屬（Streptophyta）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus），其中以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，平均相對(duì)豐度為57.22%。芽孢桿菌可產(chǎn)生大量的酶，如蛋白酶、淀粉酶，可以加速豆豉的發(fā)酵過(guò)程，并提供其他細(xì)菌所需的物質(zhì)[23]，因此，芽孢桿菌屬在制曲階段對(duì)物質(zhì)的分解和產(chǎn)酶方面具有關(guān)鍵的作用。另外其他優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度也有明顯的變化，如Streptophyta和Acinetobacter的相對(duì)豐度呈逐漸減少的趨勢(shì)，推測(cè)可能是由于這兩類菌屬對(duì)制曲環(huán)境適應(yīng)較弱的原因。Pseudomonas則整體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，至發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度達(dá)11.38%，該菌屬也是以往對(duì)豆豉的研究中較為常見(jiàn)的菌屬[24]。據(jù)報(bào)道，大部分Pseudomonas能產(chǎn)生更多種類的蛋白酶、脂肪酶和卵磷脂酶[25]，因此，其對(duì)于豆豉品質(zhì)的形成發(fā)揮著重要作用。

圖2 基于屬水平八寶豆豉制曲階段細(xì)菌（A）和真菌（B）群落組成Fig.2 Community composition of bacteria (A) and fungi (B) during the koji-making process of Ba-bao Douchi based on genus level

由圖2亦可知，在真菌微生物菌群組成中，菌屬較為單一，優(yōu)勢(shì)真菌屬包括曲霉屬（Aspergillus）、紅酵母屬（Rhodotorula）、根霉屬（Rhizopus），其中Aspergillus以絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)占據(jù)了整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，制曲結(jié)束時(shí)，相對(duì)豐度達(dá)到99.66%，說(shuō)明該菌屬是制曲階段真菌微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌屬，同時(shí)推測(cè)八寶豆豉在制曲時(shí)黑豆上逐漸布滿“黃毛”，這種“黃毛”的出現(xiàn)可能與該菌屬存在密切的關(guān)系。據(jù)研究報(bào)道，真菌微生物，尤其是曲霉屬，是蛋白酶的最重要來(lái)源，具有比較高的產(chǎn)蛋白酶活的能力，是導(dǎo)致發(fā)酵食品中蛋白質(zhì)發(fā)生降解的主要因素[26]。

2.3 八寶豆豉制曲階段微生物菌群結(jié)構(gòu)差異分析

基于屬水平，采用主坐標(biāo)分析和層級(jí)聚類分析對(duì)八寶豆豉制曲過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3a和3b可知，細(xì)菌菌群的PCoA1（52.08%）和PCoA2（27.08%）累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)79.16%，真菌菌群的PCoA1（94.8%）和PCoA2（5.12%）累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.92%，說(shuō)明都可以較好的代表不同樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析中，樣品D1和D3較為接近，樣品D4與D5較為接近，D2樣本則距離其他樣本較遠(yuǎn)。而真菌群落的主坐標(biāo)分析中，樣品D1、D2、D3均距離彼此較遠(yuǎn)，分散于不同象限中，只有樣品D4和D5位于同一象限，距離較為接近，說(shuō)明這兩個(gè)時(shí)期菌落結(jié)構(gòu)較為相似。

圖3 八寶豆豉制曲階段細(xì)菌及真菌菌群的主坐標(biāo)分析（a、b）和層級(jí)聚類分析（c、d）結(jié)果Fig.3 Result of principal coordinate analysis (a,b) and hierarchical cluster analysis (c,d) of bacterial and fungal flora during the koji-making process of Ba-bao Douchi

由圖3c可知，5個(gè)時(shí)期的樣本被聚類成3個(gè)階段，分別為D1和D3、D2、D4和D5，與主坐標(biāo)分析一致。由圖3d可知，樣品D1、D2、D3均處于不同的分支，樣品D4與D5處于同一分支，說(shuō)明隨著發(fā)酵的進(jìn)行，每個(gè)時(shí)期的樣本逐漸的發(fā)生變化，并在D4～D5時(shí)期趨向于穩(wěn)定，這也與主坐標(biāo)分析結(jié)果一致。

總體來(lái)說(shuō)，隨著制曲時(shí)間的變化，八寶豆豉的微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，尤其在前三個(gè)時(shí)期（D1、D2、D3）菌群結(jié)構(gòu)變化差異明顯，在后兩個(gè)時(shí)期（D4和D5），菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

2.4 八寶豆豉制曲階段蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化

八寶豆豉制曲過(guò)程中，蛋白酶活力的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。

圖4 八寶豆豉制曲階段3種蛋白酶活力的變化Fig.4 Change of three kinds of proteases activity during the koji-making process of Ba-bao Douchi

由圖4可知，在制曲過(guò)程中，中性蛋白酶在初期增長(zhǎng)較緩慢，而后期增長(zhǎng)較快，并在發(fā)酵5 d時(shí)達(dá)到最高，為（867.05）U/g。堿性蛋白酶在整個(gè)制曲過(guò)程中呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，并在發(fā)酵5 d時(shí)達(dá)到最高，為（606.46）U/g。而酸性蛋白酶活力則在前期增長(zhǎng)較緩慢，在發(fā)酵3～4 d時(shí)快速增加，而后出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，推測(cè)出現(xiàn)降低的原因可能是由于后期產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物不再適宜生長(zhǎng)。總體來(lái)說(shuō)，整個(gè)制曲階段，堿性和中性蛋白酶是制曲階段的主要酶，說(shuō)明豉曲微生物主要以產(chǎn)中性和堿性蛋白酶的微生物為主。索化夷等[27]研究發(fā)現(xiàn)，永川豆豉制曲階段的主要蛋白酶為中性和堿性蛋白酶，且永川豆豉也采用的是自然開(kāi)放式制曲的方式，不同的是永川豆豉八寶豆豉的制曲工藝存在較大差異；代麗嬌等[28]采用人工接種方式，將枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種于蒸煮后的大豆進(jìn)行制曲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制曲過(guò)程中以中性蛋白酶活為主，且遠(yuǎn)高于酸性蛋白酶活。

據(jù)研究報(bào)道，蛋白酶活的種類會(huì)對(duì)豆豉的品質(zhì)有重要影響，若豆豉中性蛋白酶活力高，則得到的豉曲更易被后期微生物進(jìn)行降解，產(chǎn)生的風(fēng)味和口感較好；若以堿性和酸性為主，則生產(chǎn)出的豆豉偏苦和偏酸[29]。因此，若生產(chǎn)出豆豉出現(xiàn)偏苦的口感時(shí)，極有可能是與堿性蛋白酶分泌旺盛有關(guān)。

2.5 八寶豆豉優(yōu)勢(shì)微生物屬與蛋白酶活相關(guān)性分析

在利用高通量技術(shù)確定制曲階段優(yōu)勢(shì)微生物屬的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白酶活變化，利用皮爾森相關(guān)性分析建立了優(yōu)勢(shì)微生物屬與蛋白酶活的關(guān)系[30-31]，旨在探索與高產(chǎn)蛋白酶相關(guān)的菌屬，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 八寶豆豉制曲階段優(yōu)勢(shì)微生物屬與蛋白酶活的皮爾森相關(guān)性分析熱圖Fig.5 Heat map of Pearson correlation analysis of dominant microbial genera and protease activity during the koji-making process of Ba-bao Douchi

由圖5可知，中性蛋白酶活力主要與Bacillus、Aspergillus以及Staphylococcus呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)，說(shuō)明在產(chǎn)中性蛋白酶活方面，這3種菌屬可能具有一定的貢獻(xiàn)。酸性蛋白酶主要與Bacillus和Aspergillus呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，尤其是Bacillus，作為環(huán)境中較常見(jiàn)的細(xì)菌屬[32]，該菌屬可能在產(chǎn)酸性蛋白酶上具有一定的貢獻(xiàn)。堿性蛋白酶與Aspergillus呈現(xiàn)較為顯著的正相關(guān)（P＜0.05），因此，推測(cè)該菌屬可能在產(chǎn)堿性蛋白酶活方面要優(yōu)于其他菌屬。整體來(lái)說(shuō)，3種蛋白酶活主要與4種菌屬表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，分別是Bacillus、Aspergillus、Staphylococcus以及Pseudomonas，因此，推測(cè)這4種菌屬可能在蛋白酶活的產(chǎn)生上有重要作用。另外其他菌屬在制曲階段中呈現(xiàn)出與3種蛋白酶活負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，說(shuō)明這些優(yōu)勢(shì)菌屬可能在產(chǎn)蛋白酶活方面貢獻(xiàn)較小，甚至是無(wú)關(guān)菌屬。當(dāng)然，上述所提到與蛋白酶活性有關(guān)的菌屬是否具有確切的作用，仍然需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究了八寶豆豉制曲過(guò)程中的微生物菌群多樣性，結(jié)果顯示，制曲期間細(xì)菌菌群的多樣性高于真菌菌群多樣性，并且隨著制曲的進(jìn)行，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，發(fā)酵使得微生物演替較為劇烈。直到制曲階段后期（D4～D5）達(dá)到平穩(wěn)。在制曲階段，共確定出9種優(yōu)勢(shì)微生物屬（相對(duì)豐度＞1%），包括6種細(xì)菌屬，3種真菌屬，其中Bacillus和Aspergillus是占主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)微生物屬。蛋白酶活分析結(jié)果顯示，在制曲階段中，堿性和中性蛋白酶活均呈增加趨勢(shì)，且在制曲結(jié)束時(shí)達(dá)到最高活力，為制曲階段的主要蛋白酶活。優(yōu)勢(shì)微生物屬與蛋白酶活的皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Bacillus、Aspergillus、Staphylococcus以及Pseudomonas這4種優(yōu)勢(shì)菌屬與蛋白酶活性呈現(xiàn)正相關(guān)，而其他優(yōu)勢(shì)微生物均與蛋白酶活的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究為進(jìn)一步篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株以及揭示制曲階段發(fā)酵機(jī)理提供了基礎(chǔ)的理論，也為后期開(kāi)發(fā)優(yōu)良微生物資源、提高豆豉質(zhì)量和食用安全性提供了一定的指導(dǎo)。