黃宇然，張智敏，董婉潔，徐 良，韓于冰，郝 翔，匡翠方,3,4 ，劉 旭

（1. 浙江大學(xué) 光電科學(xué)與工程學(xué)院 現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310027；2. 之江實(shí)驗(yàn)室 智能芯片與器件研究中心, 浙江 杭州 311121；3. 浙江大學(xué) 寧波研究院, 浙江 寧波 315100；4. 山西大學(xué) 極端光學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心, 山西 太原 030006）

1 引 言

熒光顯微鏡是生命科學(xué)領(lǐng)域探索細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分析細(xì)胞生命活動(dòng)的重要工具。然而，由于阿貝衍射極限[1]的存在，熒光顯微鏡的分辨率被限制在半波長(zhǎng)左右，從而限制了對(duì)亞細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等更細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究。近年來(lái)，為了突破衍射極限的限制，一系列超分辨顯微成像技術(shù)被提出，其根據(jù)原理可分為3類：基于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）工程[2-3]、基于單分子定位[4-5]和基于頻域擴(kuò)展[6]。

在基于PSF工程的點(diǎn)掃描超分辨顯微技術(shù)中，受激輻射損耗顯微術(shù)（STimulated Emission Depletion microscopy, STED）[2]是最具代表性的一種，其基本原理是利用一束經(jīng)渦旋相位調(diào)制產(chǎn)生的高光強(qiáng)空心損耗光斑抑制位于實(shí)心激發(fā)光斑外圍的熒光分子的發(fā)射熒光，以獲得更窄的有效PSF。目前，STED技術(shù)已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用，但其生物成像能力仍受特異性染料需求及高損耗光強(qiáng)引起的光漂白和光毒性問(wèn)題的限制。

熒光輻射差分顯微術(shù)（Fluorescence Emission Difference microscopy, FED）[3]使用空心激發(fā)光斑掃描樣品，獲得空心光斑圖像；再與實(shí)心激發(fā)光斑掃描樣品獲得的圖像進(jìn)行差分，從而獲得背景噪聲更低且分辨率較共聚焦系統(tǒng)提升一倍的熒光顯微圖像。FED的空心光斑光強(qiáng)與實(shí)心激發(fā)光斑相近，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于STED中的損耗光，因此極大地緩解了光漂白和光毒性問(wèn)題，且對(duì)熒光染料高度普適。

由于FED需要進(jìn)行兩次掃描成像，近年來(lái)，本團(tuán)隊(duì)提出了一系列旨在提高FED成像速度的方法[7-9]。其中與并行探測(cè)相結(jié)合而形成的虛擬熒光輻射差分顯微術(shù)（virtual Fluorescence Emission Difference microscopy, vFED）[7]只使用空心激發(fā)光斑對(duì)樣品進(jìn)行單次掃描形成空心光斑圖像，再經(jīng)過(guò)光子重組形成虛擬的實(shí)心光斑圖像，兩者差分后得到vFED圖像。在這一方法的基礎(chǔ)上，本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出了飽和虛擬熒光輻射差分顯微術(shù)[10]，該方法利用熒光的非線性效應(yīng)將分辨率在vFED的基礎(chǔ)上又提升了34.5%。然而，這兩項(xiàng)工作主要進(jìn)行了原理與計(jì)算方面的研究，vFED方法的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證尚未完成。

本文在前述工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考慮了信噪比和背景噪聲的影響，提出了實(shí)驗(yàn)上可行的vFED成像模型，設(shè)計(jì)并搭建了一套三色虛擬熒光輻射差分顯微成像系統(tǒng)，并對(duì)系統(tǒng)性能進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 vFED系統(tǒng)及原理

2.1 系統(tǒng)光路

vFED系統(tǒng)相較于需要兩個(gè)激發(fā)光路的FED系統(tǒng)更加簡(jiǎn)化，只需單路即可實(shí)現(xiàn)超分辨成像，降低了光路的搭建和校準(zhǔn)難度。圖1為簡(jiǎn)化光路圖，激光由一單模保偏光纖出射后，經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直透鏡L1，并被渦旋相位板調(diào)制為渦旋光，從而在物鏡聚焦后產(chǎn)生甜甜圈形的空心光斑。用一個(gè)半波片和一個(gè)1/4波片聯(lián)合調(diào)整光束的偏振，以在焦面上獲得高質(zhì)量的圓偏振光。然后，通過(guò)一組4f透鏡組L2、L3對(duì)激發(fā)光進(jìn)行擴(kuò)束，在實(shí)現(xiàn)激發(fā)光充滿物鏡入瞳的同時(shí)，也起到了使渦旋相位板與物鏡入瞳共軛的作用。激發(fā)光照明樣品產(chǎn)生的熒光沿原光路返回，此時(shí)透鏡L3也同時(shí)用作探測(cè)光的收集透鏡；熒光透過(guò)二色鏡后被一19芯多模光纖束收集，光纖束中每根光纖的端面都起到了共聚焦顯微鏡中小孔的作用。光纖束將光信號(hào)分別導(dǎo)入19個(gè)雪崩光電二極管中，產(chǎn)生的電信號(hào)被采集卡采集并導(dǎo)入計(jì)算機(jī)中進(jìn)行分析，并實(shí)時(shí)成像。本文使用488 nm、561 nm、640 nm 3個(gè)波段的激發(fā)光分別調(diào)制，3束光合束后進(jìn)入同一個(gè)物鏡，從而實(shí)現(xiàn)了三色vFED成像。

圖1 虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)簡(jiǎn)圖Fig. 1 Sketch of virtual fluorescence emission difference microscopy

2.2 系統(tǒng)成像原理與模型

在vFED中，在每個(gè)掃描位置都進(jìn)行一次19通道的并行探測(cè)，在完成整個(gè)視場(chǎng)的掃描后，即獲得了19幅圖像。光纖束端面中處于位置的光纖所對(duì)應(yīng)的圖像可表示為：

式中q（ 0＜q≤1）是位移系數(shù)。相應(yīng)地，光子重組后的圖像最終PSF為：

在vFED中，雖然是使用空心光斑而非實(shí)心光斑掃描樣品，但光子重組仍然有效。圖2（彩圖見(jiàn)期刊電子版）是遵循矢量衍射理論計(jì)算[13-14]的vFED原理仿真結(jié)果。圖2(a)中的黑紅藍(lán)3條曲線分別代表圖1中對(duì)應(yīng)顏色通道PSF的歸一化強(qiáng)度分布，在計(jì)算時(shí)各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置得與實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)相同，物鏡NA為1.49，激發(fā)光波長(zhǎng)為640 nm時(shí)光纖束總直徑相當(dāng)于1.2個(gè)艾里斑。不同通道的PSF峰值位置發(fā)生了偏移，然而它們的0值位置仍然都位于中心處。此時(shí)若將各圖像直接相加，結(jié)果圖仍得到空心PSF，但若如圖2(b)所示進(jìn)行光子重組，則PSF原中心處將不再是0值，相加后得到了實(shí)心PSF，通過(guò)選取合適的位移系數(shù)q，可使實(shí)心PSF與空心PSF的外輪廓能夠較好地匹配。將實(shí)心PSF與空心PSF對(duì)應(yīng)的圖像進(jìn)行差分，即得到vFED圖像。這一過(guò)程及其對(duì)應(yīng)的PSF可以表示為：

圖2 系統(tǒng)成像模型。（a）黑色、紅色、藍(lán)色曲線分別是并行探測(cè)的中心通道和左側(cè)、右側(cè)邊緣通道的PSF的歸一化強(qiáng)度分布；（b）進(jìn)行光子重組后邊緣通道的PSF歸一化強(qiáng)度分布，與中心通道外輪廓匹配；（c）n=1，q=0.35，p=1，無(wú)噪聲時(shí)的vFED成像模型，紅色、藍(lán)色、黑色曲線分別是光子重組并相加得到的虛擬實(shí)心光斑圖像PSF、中心通道獲得的空心光斑圖像PSF、vFED圖像PSF；（d）n=7，q=0.5，p=0.85，無(wú)噪聲時(shí)的vFED成像模型，曲線的意義和（c）相同；（e) 考慮背景噪聲時(shí)的vFED成像模型，各通道包含的背景噪聲在該通道總光子數(shù)中的占比相同，參數(shù)n、q、p與（c）相同；（f）藍(lán)色、紅色、黑色、綠色曲線分別是共聚焦PSF、實(shí)心光斑光子重組方法PSF、按（c）和（d）的n、q、p參數(shù)計(jì)算的vFED圖像PSF，背景噪聲水平與（e）相同F(xiàn)ig. 2 Imaging model of the system. (a) The black, red, and blue curves are the normalized PSFs of the center, left and right edge channels in parallel detection, respectively; (b) the normalized PSFs of the edge channels after photon reassignment, matching the outer contour of the center channel; vFED imaging model without noise at (c) n=1, q=0.35, p=1 and(d) n=7, q=0. 5, p=0.85, the red, blue and black curves are virtual solid spot image PSF obtained by photon reassignment and summation, the hollow spot image PSF obtained from the center channel, and the vFED image PSF, respectively; (e) vFED imaging model when background noise is considered, the background noise contained in each channel accounts for the same proportion of the total number of photons in the channel, and the parameters n, q, p are the same as those in (c); (f) the blue, red, black, and green curves are the confocal PSF, solid spot photon reassignment method PSF, vFED image PSF calculated according to the n, q, p parameters of (c) and (d) , respectively. The background noise level is the same as that in (e)

式中p（ 0 ＜p≤1）是差值系數(shù)。其中，

然而，若考慮噪聲的影響， 由于中心通道只接收到總光子數(shù)中的一部分，由單張圖像構(gòu)成的空心光斑圖像往往信噪比不足，使得差分后的vFED圖像的信噪比受到限制。為解決這一問(wèn)題，可采用部分非中心通道獲得的圖像相加；此外采取較大的位移系數(shù)q也可進(jìn)一步提升信噪比。然而，更大的空心光斑圖像數(shù)n將導(dǎo)致分辨率略微下降。同時(shí)，隨著位移系數(shù)q的增大負(fù)值畸變也將出現(xiàn)。此時(shí)為避免過(guò)大的負(fù)值畸變淹沒(méi)樣品的有效信息，差值系數(shù)p需適當(dāng)減小。圖2(d)展示了傾向于保證信噪比時(shí)的各圖像PSF，此時(shí)，空心光斑圖像數(shù)n取 7，位移系數(shù)q取0.5，差值系數(shù)p取0.85。此時(shí)vFED圖像PSF出現(xiàn)了與傳統(tǒng)FED相似的負(fù)值畸變，但相較傳統(tǒng)FED，其只需單次掃描即可成像的優(yōu)勢(shì)仍得以保留。實(shí)際成像時(shí)，需選取合適的空心光斑圖像數(shù)n、 位移系數(shù)q和差值系數(shù)p，以使分辨率、信噪比和負(fù)值畸變這三者達(dá)到平衡：首先由信噪比確定合適的空心光斑圖像數(shù)n，再確定不產(chǎn)生明顯負(fù)值畸變時(shí)的最大位移系數(shù)q和差值系數(shù)p。

進(jìn)一步地，在實(shí)際成像時(shí)由于樣品的離焦信號(hào)和雜散光等的影響，各通道獲得的圖像可能包含一定的背景噪聲。圖2(e)和圖2(f)說(shuō)明了考慮背景噪聲時(shí)vFED的成像性能，其中各通道包含的的背景噪聲在該通道總光子數(shù)中的占比相同。圖2(e)除有背景噪聲外，其余參數(shù)與圖2(c)相同?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)vFED差分處理后，vFED圖像基本消除了背景噪聲的影響，其總光子數(shù)、半高全寬等與圖2(c)基本相同。圖2(f)對(duì)比了vFED與共聚焦以及實(shí)心光斑光子重組方法的成像性能，各方法設(shè)置的背景噪聲水平相同， 兩個(gè)vFED圖像的歸一化強(qiáng)度分布采用的參數(shù)（除背景噪聲外）分別與圖2(c)和圖2(d)相同。差分產(chǎn)生的負(fù)值被置為0?？梢?jiàn)即使相較于效果略好于共聚焦的實(shí)心光斑光子重組方法，vFED圖像的PSF半高全寬也明顯減小，分辨率得到提高，且其背景噪聲水平顯著降低，證明vFED方法具有良好的去背景能力。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)的超衍射極限成像能力，本文首先使用波長(zhǎng)為640 nm的激發(fā)光激發(fā)200 nm熒光顆粒進(jìn)行成像，結(jié)果如圖3（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示。圖3(a)是從光路中取出渦旋相位板后掃描樣品，將各通道圖像直接相加得到的共聚焦圖像；圖3(b)是對(duì)同一組數(shù)據(jù)進(jìn)行光子重組后得到的圖像。圖3(c)是加入渦旋相位板后的同一區(qū)域的vFED圖像，它是通過(guò)圖3(d)光子重組后的虛擬實(shí)心光斑圖像和圖3(e)中心通道的空心光斑圖像之間進(jìn)行差分得到的。由圖3可見(jiàn)，一系列在共聚焦中因?yàn)檠苌錁O限的存在而無(wú)法分辨的彼此靠近的顆粒，在vFED圖像中能夠被很好地分開(kāi)。圖3(f)選取了其中一個(gè)區(qū)域，給出了沿共聚焦圖像、實(shí)心光斑光子重組圖像和vFED圖像中白色截線的歸一化強(qiáng)度分布?？梢?jiàn)，不同于前兩者，vFED圖像對(duì)應(yīng)的曲線呈現(xiàn)兩個(gè)明顯的峰值，從而清晰地揭示了兩個(gè)顆粒的位置。為進(jìn)一步定量說(shuō)明vFED圖像分辨率的提升，分別對(duì)圖3(a)～3(c)中方框內(nèi)的區(qū)域進(jìn)行了高斯擬合，得到的半高全寬分別為425.75 nm、320.96 nm、224.72 nm，由此可知，vFED方法相較1.2倍艾里斑針孔下的共聚焦圖像實(shí)現(xiàn)了1.9倍分辨率提升。事實(shí)上，考慮到熒光顆粒具有一定的大小，vFED方法的實(shí)際分辨率的提升性能還要高于這一水平。

圖3 熒光顆粒成像結(jié)果。（a）共聚焦圖像；（b）實(shí)心光斑光子重組圖像；（c）vFED圖像；(d）虛擬實(shí)心光斑圖像；（e）空心光斑圖像；（f）圖（a)～(c) 中白色截線的歸一化強(qiáng)度分布Fig. 3 Fluorescent particle imaging results. (a) Confocal image; (b) solid spot photon reassignment image; (c) vFED image;(d) virtual solid spot image; (e) hollow spot image; (f) normalized intensity of the white truncation line in figures(a)～(c)

生物樣品較熒光顆粒結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，且更易漂白，限制了激發(fā)光功率，使其成像時(shí)較熒光顆粒更易受到噪聲的影響。本文進(jìn)一步使用三色生物樣品（640:star red標(biāo)記的核孔復(fù)合物；561:star orange標(biāo)記的高爾基體；488:star green標(biāo)記的波形蛋白）進(jìn)行成像，結(jié)果如圖4（彩圖見(jiàn)期刊電子版）所示。圖4(a)～4(b)是實(shí)心光斑光子重組圖像，其中圖4(b)是圖4(a)中方框內(nèi)區(qū)域的放大圖，圖4(c)是同一區(qū)域的vFED圖像。通過(guò)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)盡管vFED圖像信噪比有一定程度下降，但相較于實(shí)心光斑光子重組圖像，其可揭示出更多的樣品細(xì)節(jié)，分辨率得到明顯提高。

圖4 三色生物樣品的成像結(jié)果。（a）實(shí)心光斑光子重組圖像；（b）圖（a）中方框內(nèi)區(qū)域的放大圖；（c）同一區(qū)域的 vFED 圖像Fig. 4 Imaging results of three-color biological samples.(a) Solid spot photon reassignment image; (b) enlarged view of the area inside the box in (a); (c)vFED image of the same area

4 結(jié) 論

本文提出了存在背景噪聲和受信噪比限制的vFED成像模型，設(shè)計(jì)搭建了一套三色虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)，并通過(guò)熒光顆粒和生物樣品成像驗(yàn)證了其超衍射極限成像能力。

vFED方法在應(yīng)用中遇到的主要困難是空心光斑圖像數(shù)n、 位移系數(shù)q和差值系數(shù)p三者間存在制約關(guān)系，而引起這一制約關(guān)系的根本因素是vFED方法受到的信噪比限制。為避免降低分辨率或引入較大的負(fù)值畸變，不宜選取過(guò)大的空心光斑圖像數(shù)n，這意味著部分邊緣通道包含的信息不會(huì)體現(xiàn)在空心光斑圖像中，從而一定程度上導(dǎo)致信噪比下降。然而，由于vFED方法比STED方法對(duì)樣品的損傷更小，因而其能夠容忍的激發(fā)光強(qiáng)適度提高，單點(diǎn)停留時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，從而可以對(duì)信噪比進(jìn)行補(bǔ)償。此外，其他消除負(fù)值畸變的方法[15]也可用于vFED中，從而打破這一三角制約關(guān)系。

總體上說(shuō)，vFED是一種對(duì)樣品高度普適、損傷低的超分辨方法，由于STED中損耗光不存在對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)的制約，因此易于實(shí)現(xiàn)三色成像，為細(xì)胞器間的相互作用等研究提供強(qiáng)有力的研究工具。由于只需單次掃描即可成像，vFED系統(tǒng)成像速度較經(jīng)典FED系統(tǒng)提升了一倍。此外，vFED方法的去背景能力也使得系統(tǒng)更不易受到雜散光或使用低NA物鏡時(shí)出現(xiàn)的樣品離焦信息的干擾。總之，本文所搭建的三色虛擬熒光輻射差分顯微系統(tǒng)光路易于搭建和校準(zhǔn)，對(duì)熒光染料普適性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：搭建的多色虛擬熒光輻射差分顯微成像系統(tǒng)在3個(gè)波長(zhǎng)上都獲得了良好的成像效果，通過(guò)熒光顆粒和三色生物樣品的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本系統(tǒng)較1.2倍艾里斑針孔下的共聚焦實(shí)現(xiàn)了1.9倍的分辨率提升。實(shí)現(xiàn)了良好的成像效果，在細(xì)胞生命活動(dòng)的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。