王義強(qiáng)，林方睿，胡 睿，劉麗煒，屈軍樂

（1. 深圳大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院, 廣東 深圳 518060；2. 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 深圳 518060）

1 引 言

光學(xué)成像系統(tǒng)的信息通量常用空間帶寬積（Space-Bandwidth Product，SBP）來衡量，SBP是一個無量綱數(shù)，可以理解為系統(tǒng)視場（Field of view，F(xiàn)OV）內(nèi)可分辨的像素點(diǎn)個數(shù)， SBP越大，系統(tǒng)可傳輸?shù)男畔⒕驮截S富。常規(guī)的光學(xué)顯微鏡，其成像SBP在數(shù)百萬量級。系統(tǒng)的SBP提升主要受兩個因素限制：一是探測器的像素尺寸和像素數(shù)量，目前隨著以sCMOS為代表的大尺寸高分辨率相機(jī)的發(fā)展，探測器的像素數(shù)已經(jīng)可以達(dá)到2×107,像素尺寸達(dá)1.5 μm，因此其已不再是系統(tǒng)SBP的技術(shù)瓶頸；二是成像光路，SBP的提升主要受制于顯微系統(tǒng)的成像物鏡。常用的商業(yè)顯微物鏡，其SBP在不考慮離軸像差影響的情況下，一般不超過107，因此提升成像光路的SBP是提升整個系統(tǒng)大視場光學(xué)顯微成像能力的有效途徑[1]。

提升系統(tǒng)SBP的基本思路有兩種，簡單來說，就是在保持分辨率的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大視場；或者在維持視場的基礎(chǔ)上，提升分辨率。目前，光學(xué)顯微系統(tǒng)的分辨率最高可達(dá)衍射極限（約200 nm），低至數(shù)個μm，由物鏡的數(shù)值孔徑（Numerical Aperture，NA）和工作波長λ決定。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，分辨率可提升的范圍有限，以熒光顯微成像中的結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Structured Illumination Microscopy，SIM）為例[2]，使用線性結(jié)構(gòu)光照明樣品的方法最多可以將分辨率提升一倍，雖然使用非線性結(jié)構(gòu)光可以實(shí)現(xiàn)更高的提升倍率，然而其會產(chǎn)生強(qiáng)烈的光損傷，且實(shí)際可提升的倍數(shù)也有限[3]，因此，這種方法并不常用。與之相似的還有傅立葉疊層顯微技術(shù)（Fourier Ptychography Microscopy，F(xiàn)PM）。其通過頻域多角度照明的方法實(shí)現(xiàn)視場內(nèi)分辨率的數(shù)倍提升[4]。由此可知，利用分辨率提升的措施使SBP達(dá)到十倍百倍的提升，并不現(xiàn)實(shí)。

而基于擴(kuò)大成像視場，進(jìn)而提高獲取圖像像素數(shù)的方法，已經(jīng)得到了有效的驗(yàn)證[5-8]。一個常用的做法是用高NA，小視場的成像物鏡對樣品做多次成像，再用二維互相關(guān)技術(shù)等將各子視場的圖像拼接，獲取高分辨率的超大視場圖像。這一方法在組織切片成像，病理診斷等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[9-10]。拼接成像的優(yōu)勢在于這一技術(shù)非常成熟，系統(tǒng)相對簡單。電動樣品位移臺可以實(shí)現(xiàn)樣品微米級精度的二維或三維移動，物鏡掃描系統(tǒng)和自動對焦算法也可以使物鏡在樣品每次移動后實(shí)現(xiàn)自動對焦并成像。因此無論是用現(xiàn)有顯微鏡改造，還是購置新品，實(shí)現(xiàn)拼接的大視場成像均不困難。然而，對于拼接成像技術(shù)，由于其每個子視場在時間上和空間上的采集都是離散的，因此需要更多的采集時間，這些時間更多地被用于樣品移動和物鏡對焦，而不是光子采集。長時間采樣時，來自溫度的變化或環(huán)境的振動有可能導(dǎo)致樣品離焦以及產(chǎn)生運(yùn)動偽影，高NA的物鏡對于環(huán)境變化則更為敏感[5]。此外，較長的采樣時間也限制了這一方法的應(yīng)用范圍，如無法用于大視場的生物樣本實(shí)時動態(tài)檢測。

綜上所述，通過提升分辨率或者是采用拼接成像的方法提升成像系統(tǒng)的SBP各有弊端：前者的提升能力有限，難以滿足大視場光學(xué)顯微生物成像的需求；后者耗時太長，不適用于快速的在體觀測。一類有效的解決辦法是通過直接擴(kuò)大成像視場來提升SBP。它可以在較短的時間內(nèi)獲取高像素數(shù)圖像[11]。但需要注意的是，系統(tǒng)的SBP受空間分辨率和視場范圍影響，會決定單次成像的像素數(shù)上限，而系統(tǒng)的實(shí)際像素數(shù)還會受探測器的限制，因此探測器的選型需要和系統(tǒng)設(shè)計匹配。

2 技術(shù)與應(yīng)用

光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的SBP常用公式SBP=0.612×π2×r2/F2計算，其中r為系統(tǒng)視場半徑，F(xiàn)為系統(tǒng)分辨率。本文重點(diǎn)介紹了幾種目前發(fā)展較好的大視場顯微成像技術(shù)，主要有以下4種：一是兼顧高分辨率和超大視場的大視場物鏡成像技術(shù)[1,11-12]；二是通過曲面探測實(shí)現(xiàn)更大視場成像的曲面探測成像技術(shù)[7,13-14]；三是基于“化整為零”思路的陣列顯微成像技術(shù)[15-17]；四是徹底擺脫折射光學(xué)固有限制的無透鏡顯微成像技術(shù)[18-21]。這幾類技術(shù)在探索高像素數(shù)成像方面取得了卓有成效的進(jìn)展。本文介紹了這些技術(shù)的原理和特點(diǎn)，以及它們在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展,并討論了它們在其他領(lǐng)域，如高速成像方面，存在的挑戰(zhàn)以及可能的解決方案。

2.1 大視場物鏡成像

通過自行設(shè)計和定制物鏡，實(shí)現(xiàn)大視場的高分辨率成像是近年來大視場物鏡成像的一個重要發(fā)展方向。定制的物鏡可以突破傳統(tǒng)物鏡的外形尺寸約束，使整個視場內(nèi)的分辨率得到提升并提高SBP，目前已有多個設(shè)計成果和相應(yīng)的應(yīng)用出現(xiàn)。它們的特點(diǎn)是低放大倍率和高NA設(shè)計。低放大倍率一方面有利于產(chǎn)生大FOV(Field of View)，另一方面也兼顧了實(shí)際探測器的感光尺寸。NA值一般在0.5到1之間，成像分辨率可達(dá)微米和亞微米級別。2015年，Tsai等人[6]依靠優(yōu)化透鏡色差實(shí)現(xiàn)了10 mm直徑超大視場，但其設(shè)計基于4倍放大率0.28 NA物鏡，分辨率過低。McConnell等人[22]設(shè)計了一款大視場物鏡， 視場直徑可達(dá)6 mm，并具有4倍放大率，NA約為0.5，可用于共聚焦式的點(diǎn)掃描成像和寬場成像兩種模式。共聚焦模式可實(shí)現(xiàn)200 μm的成像深度，而落射寬場熒光成像可實(shí)現(xiàn)92 frame/s的成像幀率。為實(shí)現(xiàn)低放大率下的高NA，物鏡直徑需達(dá)63 mm，這幾乎是常用物鏡的兩倍。橫向分辨率為0.6 μm，軸向分辨率為6.3 μm，不考慮像差的影響（后續(xù)SBP的計算類似），SBP值約為9.2×107。該課題組使用落射寬場熒光成像模式實(shí)現(xiàn)了小鼠胚胎腦部神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的高分辨率多色結(jié)構(gòu)成像。同年，美國的Sofroniew等[12]使用大視場物鏡實(shí)現(xiàn)了5 mm超大視場的雙光子熒光成像，激發(fā)波長為970 nm時，橫向分辨率可達(dá)0.66 μm，SBP約為5.3×107。利用這一成像平臺，結(jié)合靈活的掃描策略，他們實(shí)現(xiàn)了活體小鼠皮下1 mm深度內(nèi)的腦皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu)成像，如圖1所示。然而，大視場物鏡成像和傳統(tǒng)的顯微鏡一樣，都會受到離焦背景的影響，導(dǎo)致實(shí)際分辨率低于理論值[23]。雖然共聚焦成像和雙光子成像可以提供良好的光學(xué)層切能力，降低了離焦背景的干擾，但是其成像幀率受點(diǎn)掃描模式的制約。例如McConnell等人所設(shè)計的基于大視場物鏡的成像系統(tǒng)，采用共聚焦掃描模式時的幀率約為5×10-3frame/s[22]。

圖1 大視場物鏡雙光子腦成像[12]。(a)成像系統(tǒng)光路圖和物鏡實(shí)物圖（左上）；(b) 活體鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的雙光子成像，深度為150 μm；(c)圖(b)中虛線框內(nèi)的細(xì)節(jié)放大圖Fig. 1 Large FOV objective two-photon brain imaging[12]. (a) Optical path diagram of the imaging system and objective lens(upper left); (b) two-photon imaging of neuronal cells activity of mice brain in vivo, the depth of imaging is 150 μm;(c) magnification of some details in white box of (b)

因此，人們將注意力轉(zhuǎn)向了光片顯微成像（Light-sheet microscopy，LSM）[24]。這是一種可以兼具寬場成像的快速和共焦成像的光學(xué)層析技術(shù)。但是傳統(tǒng)LSM的聚光鏡和成像物鏡多為普通的商業(yè)顯微物鏡，激發(fā)區(qū)域和成像視場有限，未能突破SBP的限制。因此將光片照明和大視場物鏡結(jié)合，則可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)，2018年，Schniete等[25]利用McConnell設(shè)計的大視場物鏡，發(fā)展了一種基于散斑光片照明的大視場成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了0.7 μm的橫向分辨率，7 μm的軸向分辨率。與基于該物鏡的共焦成像模式相比，分辨率幾乎一致，速度卻有了30倍的提升，并且像素數(shù)較傳統(tǒng)光片顯微鏡高一個數(shù)量級。 與落射寬場成像相比，光片成像拓展了深度成像的功能。利用這一方案，Schniete等實(shí)現(xiàn)了對斑馬魚全身的高分辨成像。系統(tǒng)光路和結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于散斑光片照明的大視場成像系統(tǒng)[25]。(a) 系統(tǒng)光路示意圖，激光經(jīng)磨砂玻璃片形成的散斑圖案投影在體積為4.4 mm×3 mm×3 mm的樣品內(nèi)，形成厚度約為3 μm的散斑光片照明；(b) 用光片照明模式實(shí)現(xiàn)斑馬魚全身成像；(c)用共聚焦模式實(shí)現(xiàn)的斑馬魚全身成像Fig. 2 Speckle light sheet illumination-based large FOV imaging system[25]. (a) System setting, the speckle pattern formed by the laser through the ground glass disk is projected into the sample with a volume of 4.4 mm×3 mm×3 mm, forming a speckle light sheet with a thickness of about 3 μm for illumination; (b) Zebrafish whole body imaging with light sheet illumination; (c) Zebrafish whole body imaging with confocal microscopy

雖然大視場物鏡成像系統(tǒng)相對于傳統(tǒng)光學(xué)顯微系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了SBP一個數(shù)量級的提升，然而它所用的物鏡尺寸通常較大，這一方面是由低放大倍率和高NA值的設(shè)計要求所限制的，另一方面也是出于像差校正的需要，消除像差所需使用眾多透鏡，增加了成像物鏡的重量和體積，這導(dǎo)致通過移動物鏡來實(shí)現(xiàn)樣品體成像難以實(shí)現(xiàn)[26-27]。對于寬場成像，場曲等離軸像差會導(dǎo)致圖像中心和邊緣的分辨率產(chǎn)生較大差異，使這一技術(shù)難以在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。對于點(diǎn)掃描成像方式，由于常規(guī)掃描元件的孔徑較小，若要將掃描光束填充物鏡的出瞳以達(dá)到最佳的分辨率，則需增加相應(yīng)的擴(kuò)束系統(tǒng)。然而，擴(kuò)束系統(tǒng)會降低掃描視場角，這導(dǎo)致實(shí)際的掃描視場范圍縮小[28]，因此需要相對復(fù)雜的掃描系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)全視場成像。此外，視場中心和邊緣像差的變化同樣會對點(diǎn)掃描成像的圖像質(zhì)量產(chǎn)生影響。因此在生物應(yīng)用領(lǐng)域使用大視場物鏡直接成像依然面臨著諸多限制。

2.2 曲面探測成像

大視場物鏡成像系統(tǒng)雖然提供了大視場高SBP的成像技術(shù)，但它是基于物鏡直接成像設(shè)計的，大視場條件下離軸像差的影響導(dǎo)致這類透鏡的設(shè)計和制造極度困難，并且實(shí)際性能差強(qiáng)人意。而在各類離軸像差中，場曲的校正相對不同。根據(jù)Seidel像差理論[29]，若某一折射面的球差系數(shù)為0，則其慧差和像散的系數(shù)也為0，而場曲包含匹茲伐爾場曲和像散，匹茲伐爾場曲系數(shù)的修正與球差的修正并不同步。一般顯微物鏡的場曲校正需要在實(shí)像面處增加負(fù)光焦度的場鏡，而這又會重新引入其他像差，使設(shè)計愈加復(fù)雜，需要更多的透鏡進(jìn)行校正，并且場曲也是導(dǎo)致獲取的圖像中心和邊緣像質(zhì)差異較大的原因之一。曲面探測成像技術(shù)則放寬了對場曲的限制，利用平面-曲面-平面的成像策略，降低了對主物鏡的像差修正要求，實(shí)現(xiàn)了高SBP成像并緩解了設(shè)計和制造方面的挑戰(zhàn)。這種曲面探測成像方式早在2002年就應(yīng)用在天文望遠(yuǎn)鏡領(lǐng)域[30]。此外，不同視場處分辨率不一致的情況被大大緩解，因此相對于平面成像，曲面探測可允許對更大的視場成像。其具體方式為：通過一個大視場成像物鏡，將平面物體成像在其后方的匹茲伐爾像面，一般是個球面；其次，將球面圖像光學(xué)轉(zhuǎn)移到傳統(tǒng)的平面探測器上，轉(zhuǎn)移方法可以是基于波導(dǎo)的傳輸或是使用小尺度相機(jī)，或是直接使用曲面圖像傳感器探測[31]，但這一方法常用于超大視場全景成像，并不適用于生物顯微成像。

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，曲面探測成像技術(shù)也有較大的進(jìn)展。2005年P(guān)otsaid等[32]利用曲面成像和自適應(yīng)掃描技術(shù)（Adaptive Scanning Optical Microscope，ASOM），將前置主透鏡的每個子像面的場曲交由后置小尺度相機(jī)補(bǔ)償，并配備了可變形鏡（Deformable mirror，DM）消除其他的離軸像差，并結(jié)合高速二維轉(zhuǎn)向鏡和定制的掃描透鏡組件，實(shí)現(xiàn)了單個后置小尺度相機(jī)對前置主透鏡形成的大尺度曲面圖像的串行采集，再通過數(shù)字合成，得到40 mm直徑的FOV和1.5 μm的分辨率，成像物鏡的SBP約為6.5×108，比平場設(shè)計的大視場物鏡SBP高一個數(shù)量級。但是這一方法由于受到串行采集速度的限制，難以用于大視場動態(tài)成像。

基于并行采集的成像技術(shù)可以有效解決這一問題。一種直接方法是利用與主物鏡像面平行排布的多相機(jī)陣列并行采集圖像。每個相機(jī)對應(yīng)的像面則可以近似為平面。此外由于不同相機(jī)對應(yīng)的不同像面具有不同的視場角和像差系數(shù)，因此各相機(jī)的鏡頭可以針對不同的像差系數(shù)做特異性補(bǔ)償，從而實(shí)現(xiàn)FOV內(nèi)成像質(zhì)量的均衡。清華大學(xué)戴瓊海院士課題組開發(fā)的RUSH系統(tǒng)就是其中的代表[14]。他們利用一個定制的大視場物鏡和一個5×7的相機(jī)陣列，實(shí)現(xiàn)了10 mm×12 mm的大視場成像，視場內(nèi)的分辨率為1.1～1.4 μm ，差異較小。每幀圖像超過1.7×108像素，結(jié)合高速數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，該顯微系統(tǒng)每秒可獲取30幀圖像，共約5.1×109像素。利用這一裝置，該課題組實(shí)現(xiàn)了對活體小鼠腦部免疫細(xì)胞的長時間追跡。

曲面探測成像技術(shù)的核心思路和大視場物鏡成像技術(shù)類似，都是通過直接提升成像物鏡的SBP來實(shí)現(xiàn)大視場成像。因此，復(fù)雜的物鏡設(shè)計和高難度的制造工藝，導(dǎo)致系統(tǒng)成本無法降低，難以廣泛地應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究中。但同時它還揭示了另一個事實(shí)，那就是小孔徑系統(tǒng)的像差大小和控制難度遠(yuǎn)低于大孔徑系統(tǒng)?；谶@一事實(shí)，一項(xiàng)新的大視場光學(xué)顯微成像技術(shù)發(fā)展了起來。

2.3 陣列顯微

既然單個顯微鏡的成像視場太小，那么是否可以多個顯微鏡并用以擴(kuò)大成像視場呢？多軸顯微和陣列顯微回答了這一問題。多軸顯微是將多個顯微成像光路耦合，利用多個探測物鏡，同時探測不同的區(qū)域，觀察這些區(qū)域之間可能的相互聯(lián)系[33-34]。但是在實(shí)際應(yīng)用中，由于光路設(shè)置空間的約束，往往只能實(shí)現(xiàn)雙光路耦合或三光路耦合[35]，雖然這一技術(shù)在對如不同腦區(qū)的動態(tài)響應(yīng)觀測應(yīng)用中有良好的表現(xiàn)[36]，但其最終SBP的提升有限。陣列顯微是另一類并行大視場顯微成像技術(shù)。其與曲面探測成像的區(qū)別是陣列顯微將曲面探測成像的主物鏡換成了微透鏡陣列，每一個微透鏡對應(yīng)一個子FOV，并經(jīng)過后續(xù)的光路成像在探測器上。從本質(zhì)上看，陣列顯微就是將一組小視場顯微鏡陣列排布后對樣品并行采集，后合并為一張大視場的數(shù)字圖像，這與多軸顯微具有異曲同工之處。陣列顯微由Weinstein等[15]開發(fā)，該團(tuán)隊使用的微透鏡陣列包含80個微透鏡，每個微透鏡的NA為0.65，F(xiàn)OV直徑為0.25 mm，對應(yīng)SBP為～8.7×105，整個系統(tǒng)由80個微透鏡組成，單次成像可獲取一個總SBP為7×107的圖像，其性能已經(jīng)超越了傳統(tǒng)顯微物鏡。使用該系統(tǒng)，他們展示了一個具有亞微米空間分辨率的225 mm2區(qū)域的大型病理切片數(shù)字掃描圖。陣列顯微的一個顯著的優(yōu)點(diǎn)是：相較于需要執(zhí)行二維掃描才能實(shí)現(xiàn)大視場成像的傳統(tǒng)小視場多次成像技術(shù)，陣列顯微由于其微透鏡陣列可以設(shè)計為傾斜排列，使一個方向上的視場在掃描時存在重疊，因此只需要執(zhí)行一維掃描既可以實(shí)現(xiàn)全視場的覆蓋，結(jié)構(gòu)更簡單，速度也更快，且降低了微透鏡之間的空隙[15,37]。微透鏡的排布示意如圖3所示。

圖3 微透鏡的排列與掃描方向示意圖[37]Fig. 3 Schematic diagram of microlenses arrangement and scanning direction

一個避免機(jī)械掃描，僅需通過數(shù)字合成的辦法是使用時間順序成像替代機(jī)械掃描，2011年McCall等[38]為每個微透鏡提供單獨(dú)的照明，且相鄰視場依次成像，從而保證每個微透鏡圖像可以在相機(jī)上相互重疊，其代替了機(jī)械掃描并且放寬了對放大倍率的約束。近年來陣列顯微和熒光成像的結(jié)合也取得了不少進(jìn)展。早期的陣列顯微鏡，物鏡和管鏡均為微透鏡陣列，雖然結(jié)構(gòu)緊湊，但也使濾光片的介入難以實(shí)現(xiàn)，從而無法有效分離激發(fā)光和熒光。2013年，Orth等[39]利用水浸的微透鏡陣列成一次像，再用單反相機(jī)做二次成像到傳感器上，并將一個高通濾光片置于CMOS傳感器和單反鏡頭之間，實(shí)現(xiàn)了小鼠腎臟切片的單色熒光成像，成像視場為1 cm×0.6 cm，橫向分辨率為1.7 μm，系統(tǒng)的總SBP達(dá)到了108量級，如圖4所示。Son等[17]利用具有更大NA值（約0.5）的GRIN透鏡陣列替代傳統(tǒng)的球面透鏡陣列，降低了陣列系統(tǒng)的成本和重量。

圖4 陣列顯微系統(tǒng)[39]。 (a) 陣列顯微系統(tǒng)光路設(shè)置；(b) 小鼠腎臟切片的高通量成像；(c)圖(b)中方框內(nèi)的放大圖Fig. 4 Array microscopy system[39]. (a) The optical setting of array microscopy; (b) high-throughput imaging of mouse kidney slices; (c) magnification of the rectangle in (b)

陣列顯微成像另一個顯著的優(yōu)點(diǎn)是由于微透鏡陣列的孔徑可以做到很小，因此一個微透鏡陣列可以由多個微透鏡組成，每個微透鏡所對應(yīng)的視場角也可以做到很小，例如Orth課題組所使用的微透鏡陣列，其單個微透鏡的直徑為122 μm[16]，對應(yīng)視場角僅有2.5°，因此視場內(nèi)焦斑的大小和形狀沒有明顯的差異，單個微透鏡對應(yīng)的視場內(nèi)分辨率的散布也很小，約1.30 ± 0.15 μm。此外，微透鏡陣列的透鏡數(shù)量可以根據(jù)需要靈活設(shè)置，視場的可拓展性更強(qiáng)，如前述Son的系統(tǒng)就實(shí)現(xiàn)了模塊化定制，因此相對于大孔徑物鏡而言便利性更好，結(jié)合高分辨率的面陣探測器，可以實(shí)現(xiàn)快速的高通量成像。用微透鏡陣列替代常規(guī)物鏡的好處在于可以使系統(tǒng)全視場內(nèi)分辨率散布非常好，并且SBP的擴(kuò)展相對容易。然而，平面排列的微透鏡陣列結(jié)合的焦深有限，使得系統(tǒng)對樣品的表面平整度要求苛刻，陣列顯微的應(yīng)用場景也因此受到了極大的限制，目前主要用于對組織切片等表面平整的樣品進(jìn)行成像[40]。

以上提到的3種技術(shù)，都是在高分辨率的基礎(chǔ)上通過擴(kuò)大成像視場，進(jìn)而提高系統(tǒng)的SBP，最終實(shí)現(xiàn)高像素數(shù)圖像獲取。這雖然是主要的大視場光學(xué)顯微成像方式，但是從系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的簡化和實(shí)現(xiàn)的難易程度上來講存在劣勢。以下提到的方法相對更具優(yōu)勢，在一些特殊的大視場光學(xué)顯微成像應(yīng)用領(lǐng)域，已然擁有一席之地。

2.4 無透鏡顯微

無透鏡顯微技術(shù)是一種舍棄了傳統(tǒng)的折射光學(xué)系統(tǒng)，使用探測器直接對薄樣品成像的技術(shù)。在系統(tǒng)復(fù)雜度方面，它比基于折射光學(xué)的顯微系統(tǒng)簡單的多。在技術(shù)難度方面，由于小像素尺寸高像素數(shù)量的數(shù)字圖像傳感器技術(shù)日漸成熟，以及對采集的衍射圖像的處理和重建算法的不斷進(jìn)步，無透鏡片上顯微技術(shù)的實(shí)現(xiàn)難度大大下降，目前它的發(fā)展已經(jīng)進(jìn)入了快車道。按照技術(shù)原理，無透鏡片上顯微技術(shù)可以大致分為無透鏡陰影成像[41-42]，無透鏡熒光成像[19,43-44]，無透鏡全息成像[45-46]3種。無透鏡陰影和無透鏡熒光成像都是“所見即所得”的成像方式，傳感器芯片上樣品產(chǎn)生的陰影或熒光分布被傳感器記錄后直接形成圖像。區(qū)別在于熒光成像方式需要實(shí)現(xiàn)激發(fā)光和熒光的分離，具體措施多樣，常用的有利用全反射[19]，或在樣品和探測器之間增加濾光片[44]，以及將濾光片集成到探測器上[43]。無透鏡全息成像則不同，傳感器獲取的是樣品的相干衍射圖樣，需要利用重構(gòu)算法恢復(fù)樣品的相位信息。

它們的成像視場主要由探測器的感光區(qū)域面積決定，目前CCD和CMOS的成像視場大小從20 mm2到20 cm2不等[8,47]，取決于具體所用的傳感器。單就成像視場而言，已經(jīng)遠(yuǎn)大于折射顯微系統(tǒng)。就實(shí)際分辨率而言，3類技術(shù)存在差異，初始條件下，無透鏡顯微成像的分辨率極限基本取決于傳感器像素大小。系統(tǒng)的SBP和傳感器像素數(shù)一致，可達(dá)到107量級。無透鏡陰影成像可以利用樣品和傳感器之間的微孔徑陣列進(jìn)一步提升分辨率。2009年Lee等[42]在一個像素數(shù)為1 024 pixel×1 280 pixel，像素尺寸為5.2 μm的CMOS芯片上，借助微孔徑陣列，實(shí)現(xiàn)了0.8 μm的分辨率，系統(tǒng)SBP約為2×108，提升了約15倍。無透鏡熒光成像則是借助了一些硬件和軟件方法，但目前分辨率通常低于1 μm[19,43-44,48]，在SBP方面要低于陰影成像，因此這兩種方法本文不做過多介紹。

無透鏡全息成像的分辨率提升潛力則大得多，這是由于全息衍射成像方式使更多的樣品高頻信息得以被傳感器采集，雖然傳感器的欠采樣會導(dǎo)致部分高頻信息丟失，但是結(jié)合像素超分辨和圖像重構(gòu)算法，能夠盡量還原這些高頻信息，合成高保真圖像，最終系統(tǒng)的SBP可以達(dá)到108像素或更多。像素超分辨技術(shù)是通過采集多個樣品亞像素移動后的圖像序列，使用多幀圖像的超分辨算法插值合成亞像素超分辨圖像[45,49-50]。常用移動樣品、傾斜照明[46]、旋轉(zhuǎn)掃描或多波長復(fù)用[51]方法獲取多幀圖像，再用移加法[52]或梯度下降法[18]確定插值的像素值。若能事先獲得關(guān)于傳感器的光敏區(qū)二維像素響應(yīng)函數(shù)，合成后的高分辨圖像可以更精確。二維像素響應(yīng)函數(shù)的獲取需要視情況而定，對于有較大像素尺寸（約5 μm以上）的傳感器（一般為CCD或大像素尺寸的CMOS），可以采用掃描顯微鏡形成直徑遠(yuǎn)小于像素尺寸的掃描點(diǎn)，對傳感器像素的感光區(qū)域進(jìn)門掃描，并以信號響應(yīng)強(qiáng)度為z軸，感光區(qū)域?yàn)閤-y面，形成初步的二維響應(yīng)函數(shù)。其與掃描點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)反卷積后可以得到更為精細(xì)的二維響應(yīng)函數(shù)。但這一方法難以用于極小像素尺寸的傳感器，如高精度的CMOS，因?yàn)閽呙椟c(diǎn)與像素大小相當(dāng)（均在1 μm左右），此時可以利用二維高斯分布做像素響應(yīng)函數(shù)的初步近似（中心位置一致，x-y方向半高寬與像素大小一致）[50]。值得注意的是，像素超分辨不是傳統(tǒng)意義上的超分辨成像，只是突破了有限像素數(shù)導(dǎo)致的有限采樣頻率，進(jìn)而恢復(fù)了部分精細(xì)特征，得到更加精細(xì)的圖像。

2021年，南京理工大學(xué)左超教授團(tuán)隊[51]利用基于多波長復(fù)用的像素超分辨算法，在一塊視場面積為29.85 mm2的無透鏡片上顯微成像系統(tǒng)上，實(shí)現(xiàn)了691 nm的線寬分辨率，而對應(yīng)像素尺寸為1.67 μm，系統(tǒng)SBP約為2.3×108。他們使用了一個超連續(xù)譜連續(xù)激光器，可用波長范圍為430～1 450 nm，并利用聲光調(diào)制器控制輸出波長（450～520～nm），使用直徑為100 μm的針孔進(jìn)行空間濾波，形成了一個用于照明樣品的準(zhǔn)單色球面波前。利用這套系統(tǒng)，他們不但觀測到了單個HeLa細(xì)胞的有絲分裂期間不同階段的細(xì)胞形態(tài)，還可以在全視場內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞追跡，并定量分析了單個細(xì)胞的干質(zhì)量變化，展示了對傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的高通量、長期快速成像的能力。

Zhang等[20]發(fā)展了一款超大視場的無透鏡片上顯微成像系統(tǒng)，F(xiàn)OV達(dá)到了18.15 cm2，由于他們開發(fā)的這套系統(tǒng)是用于高通量的封裝胰島膠囊分析，對分辨率要求不高，因此圖像重建并沒有涉及像素超分辨，最終系統(tǒng)的SBP為6×107。Jiang等[53]將圖像傳感器相對樣品傾斜放置，引入了一個沿橫向線性增加的相位調(diào)制，使系統(tǒng)可以在橫向位移的同時完成樣品的離焦多高度測量，解決了傳統(tǒng)多高度相位檢索中精確軸向定位的難題。結(jié)合像素超分辨算法，他們在一個120 mm2的視場內(nèi)實(shí)現(xiàn)了690 nm的線寬分辨率，系統(tǒng)SBP超過2.9×108。他們還通過對全視場內(nèi)1 014個白細(xì)胞的自動計數(shù)追跡，展示了系統(tǒng)的高通量成像能力。后來，他們又提出了一種分辨率增強(qiáng)的并行編碼疊層高通量成像技術(shù)[21]，采用了類似散射透鏡成像[54-55]的思路，將傳感器表面的保護(hù)玻璃蓋換成了自制的無序表面，如圖5(a)（彩圖見期刊電子版）所示。實(shí)現(xiàn)了240 mm2視場內(nèi)，308 nm的線寬分辨率，SBP約為3×109。他們自制的這一無序表面是由化學(xué)刻蝕技術(shù)形成亞微米級的相位散射體，并在刻蝕表面印刷了隨機(jī)分布的碳納米顆粒后形成的。相位散射體可以將目標(biāo)相位信息變化轉(zhuǎn)為強(qiáng)度變化進(jìn)行檢測，而碳納米顆?？梢詫⒋蠼嵌鹊难苌浞至恐匦露ㄏ虻叫〗嵌?，這意味著物體的高頻信息被調(diào)制到光學(xué)系統(tǒng)的通頻帶[56]，因此分辨率能夠得到進(jìn)一步增強(qiáng)。利用這一系統(tǒng)，他們在像素尺寸為1.85 μm的傳感器上實(shí)現(xiàn)了308 nm的線寬分辨率，可以識別樣品中緩慢的相位變化，并利用染色切片驗(yàn)證了系統(tǒng)的高通量成像能力，如圖5(b)（彩圖見期刊電子版）所示。相較于傳統(tǒng)顯微鏡，這一系統(tǒng)可以用更短的時間對大視場的切片樣品成像，并且系統(tǒng)結(jié)構(gòu)大大簡化，穩(wěn)定性更高，成本也更低。

圖5 無透鏡分辨率增強(qiáng)成像系統(tǒng)[21]。(a) 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和其使用的無序表面示意圖；(b) 系統(tǒng)對小鼠腎臟切片的高通量成像，并選取三個子區(qū)域b1, b2, b3（圖中紅色框內(nèi)）的成像結(jié)果與使用20 X, 0.75 NA物鏡的熒光顯微鏡成像結(jié)果做對比，兩者的相似度約為0.75Fig. 5 Resolution enhanced lensless imaging system[21]. (a) Schematic diagram of system design and the disordered surface;(b) high-throughput imaging of mouse kidney slices. Imaging results of three sub-regions b1, b2, b3 (red boxes) are compared with that of the fluorescence microscope using an objective with 20 X and 0.75 NA. The similarity is about 0.75

總的來說，無透鏡顯微的優(yōu)缺點(diǎn)都很突出，其最突出的優(yōu)點(diǎn)在于成功地解耦了分辨率和視場，使其系統(tǒng)SBP提升的方式與傳統(tǒng)解決方法截然不同，其可以通過更少的硬件投入，更多的計算輔助，獲得同樣SBP的成像系統(tǒng)，而且其成本和系統(tǒng)復(fù)雜度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的折射顯微系統(tǒng)。同時，它也有明顯的缺點(diǎn)，就是對成像樣品有較高的要求。探測器直接成像模式使得無透鏡成像無法有效區(qū)分信號光和散射背景光，因此，實(shí)際分辨率受信噪比的影響強(qiáng)烈。此外，衍射全息成像的相干成像條件限制也使得無透鏡成像的樣品厚度有限（＜1 mm）[47]。對于不透光，較厚或密集標(biāo)記的樣本難以使用無透鏡成像技術(shù)進(jìn)行觀察，此外成像的保真度也還有待提升。因此，無透鏡成像目前只適用于一些特殊的應(yīng)用場景，如高通量的快速切片成像，細(xì)胞識別與自動計數(shù)等。

2.5 幾種技術(shù)的比較

以上簡要回顧了4種高SBP成像技術(shù)，雖然它們只是高SBP成像技術(shù)的一部分，但卻具有相當(dāng)?shù)拇硇?。按照大類它們可以分為基于折射光學(xué)的有透鏡成像技術(shù)和基于計算成像的無透鏡成像技術(shù)。按照小類，對于有透鏡的成像技術(shù)，前文著重介紹了其中3種大視場高分辨的成像技術(shù)[12-14,17,25,31,34]，無透鏡的成像技術(shù)重點(diǎn)介紹了無透鏡片上全息顯微成像技術(shù)[21,46,51,53]，并分享了它們的一些最新進(jìn)展和成果。對以上這4種技術(shù)，就分辨率、視場、適用場景和技術(shù)難度進(jìn)行簡要的總結(jié)，如表1所示。

表1 4類典型的大視場光學(xué)顯微成像技術(shù)參數(shù)對比Tab. 1 Comparison of four representative optical microscopy imaging techniques with large FOV

對于大視場物鏡成像技術(shù)，使用低倍鏡固然可以獲得更大的視場，但卻損失了分辨率，故其視場擴(kuò)展?jié)摿ο鄬^小。在保持微米級別分辨率的前提下，其已報道實(shí)現(xiàn)的最大視場也沒有突破1 cm2，這樣的物鏡雖說可以兼顧點(diǎn)成像和面成像，但是鏡頭本身的設(shè)計制造難度和配套光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)置難度都是極高的。從光學(xué)原理出發(fā)，使用大視場物鏡成像的技術(shù)路線在視場的擴(kuò)大和SBP提升上的應(yīng)用前景非常有限，并且只在視場中心附近區(qū)域可以實(shí)現(xiàn)高分辨率。與之相比，曲面探測成像技術(shù)更有潛力，就面成像而言，視場直徑已可達(dá)4 cm。但是曲面探測成像的技術(shù)難點(diǎn)除了復(fù)雜的光路設(shè)計以外，還由于需要設(shè)置多個相機(jī)，導(dǎo)致體積龐大和標(biāo)定過程復(fù)雜。不過就分辨率而言，曲面探測成像的整體效果要好于大視場物鏡成像[14]，SBP的上限更高。目前曲面探測成像的發(fā)展方向之一是提高成像速度，如RUSH系統(tǒng)可以達(dá)到30 frame/s的幀率，但其時間分辨率仍然不能實(shí)現(xiàn)成像細(xì)胞動作電位的傳播——電位信號的上升和衰減在幾個毫秒內(nèi)完成。進(jìn)一步提升成像幀率需要解決高速數(shù)據(jù)采集、處理、傳輸和多相機(jī)同步等問題，最終目標(biāo)可能需要達(dá)到每秒上千幀的成像速率。

陣列顯微因采用并行化的采集思路，視場拓展空間和難度要低于前面兩種。從理論上講，微透鏡陣列的SBP可以隨微透鏡數(shù)量的提升不斷提升[15]，對于單個微透鏡還可以采用高NA設(shè)置實(shí)現(xiàn)高分辨率。然而在實(shí)際應(yīng)用上，仍然存在很多限制：微透鏡陣列的物理尺寸本身就難以做的太大。此外，還要考慮實(shí)際傳感器的尺寸和數(shù)量、中繼光學(xué)系統(tǒng)的承接能力、對微透鏡的數(shù)量和尺寸依然有限制。此外，物鏡的NA和焦深負(fù)相關(guān)，高NA設(shè)置會使焦深變淺，圖像錯位的概率也會大大增加，因此，陣列顯微單次快照的SBP并不十分突出。但是陣列顯微在病理切片成像，活細(xì)胞觀測等領(lǐng)域已有很好的發(fā)展，這是因?yàn)椋合噍^于傳統(tǒng)的高NA物鏡拼接成像的方式，陣列顯微的單次成像面積更大，所以圖像采集次數(shù)更少，成像時間更短，便于實(shí)現(xiàn)快速大規(guī)模成像；其次，切片樣品薄而平整的特點(diǎn)非常適合陣列顯微；另外，陣列顯微已經(jīng)發(fā)展出多色成像功能，可以快速對切片樣品實(shí)現(xiàn)多色成像或光譜成像[40]，改善了早期只能單色成像的缺點(diǎn)。已經(jīng)有研究人員對陣列顯微和傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡結(jié)合進(jìn)行了初步探索[57]，有望實(shí)現(xiàn)兩種成像方式的優(yōu)勢結(jié)合。

相對而言，無透鏡成像系統(tǒng)非常簡潔，多數(shù)元件都來自成熟的商業(yè)化產(chǎn)品，另外視場的擴(kuò)展空間也很大，可以多個芯片并行成像而無需掃描[56]，因此它可以在一個成本相對低廉的小型化平臺上實(shí)現(xiàn)大視場高分辨成像。雖然只適用于特定范圍的樣品，無法對活體目標(biāo)等直接成像，但是在細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞示蹤和染色切片成像等領(lǐng)域，無透鏡成像還是展現(xiàn)了極好的應(yīng)用前景。目前無透鏡成像的發(fā)展主要有兩個方向：一是分辨率提升，目前的成像分辨率達(dá)不到理想衍射極限，這主要受光源的相干性和傳感器結(jié)構(gòu)設(shè)計等的影響，這可通過選擇相干性較好的激光光源、多角度頻移照明和數(shù)字解卷積等方法改善；二是成像結(jié)果保真度有待提高，這是由于無透鏡成像的實(shí)際成像過程會受到多種環(huán)境因素影響，實(shí)際成像模型與理論模型存在偏差，使得計算重構(gòu)出的結(jié)果和基于透鏡成像的結(jié)果存在差異，為改善這一問題，深度學(xué)習(xí)已經(jīng)被大量引入，多種基于深度學(xué)習(xí)的無透鏡成像得到發(fā)展，并有效降低了對實(shí)際成像過程精確建模的需求，圖像的保真度有望得到進(jìn)一步提升。此外還有其他幾個方向有待發(fā)展，如快速動態(tài)全視場無透鏡成像，離焦距離精確測定的無透鏡層析成像等。

3 前景與挑戰(zhàn)

3.1 深度成像

正常的生物樣本都具有一定的厚度，不同深度處的生物組織之間的相互聯(lián)系也是生物研究感興趣的重要內(nèi)容，利用光學(xué)顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物樣本的深度成像可以幫助人們有效獲取三維組織和器官的生理信息。由于光在生物組織中存在散射和吸收效應(yīng)[58-59]，導(dǎo)致光學(xué)顯微在正常生物組織中的成像深度存在一個軟極限（約1 mm），限制了成像深度的進(jìn)一步提高。但是在生物研究領(lǐng)域，許多感興趣目標(biāo)所處深度均超過1 mm。例如在腦科學(xué)研究中，哺乳動物的大腦皮層下數(shù)個毫米內(nèi)有豐富的神經(jīng)元和毛細(xì)血管分布，對神經(jīng)元活動的研究有助于理解大腦功能實(shí)現(xiàn)的原理，而對腦部血管的精確成像能夠?qū)σ恍┠X部疾病進(jìn)行輔助診斷和病因分析，如阿爾茨海默[60]和腫瘤[61-62]等。此外，在大腦內(nèi)部更深處還有許多其他重要的部分，如負(fù)責(zé)記憶的海馬體和負(fù)責(zé)激素調(diào)節(jié)的下丘腦，垂體等，對它們的成像需要現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡在成像深度上取得更多的進(jìn)步[63]。因此若能實(shí)現(xiàn)成像深度的進(jìn)一步提升，則有望在以腦科學(xué)研究為代表的諸多生物研究領(lǐng)域取得更多進(jìn)展。

傳統(tǒng)的三維成像方法是利用層切技術(shù)，即通過機(jī)械清除[64-65]，或者激光消融[66]等，使較厚的生物組織實(shí)現(xiàn)逐層的光學(xué)顯微成像，再通過后期處理實(shí)現(xiàn)三維圖像恢復(fù)，這一點(diǎn)和利用機(jī)械掃描方法實(shí)現(xiàn)二維大視場拼接成像在思路上是一致的。后來開發(fā)出的一系列組織光透明方法[67-69]可以改變生物組織的折射率分布，使其分布更加均勻，從而降低生物組織的高散射特性，增強(qiáng)光在組織中的穿透深度。這一技術(shù)目前已應(yīng)用在皮下微血管成像[70]、神經(jīng)系統(tǒng)成像[71-73]等領(lǐng)域。隨著基于近紅外II區(qū)波段的顯微成像技術(shù)的發(fā)展，利用近紅外II區(qū)在生物組織內(nèi)低吸收和低散射特性的共聚焦[74]和多光子技術(shù)[75-79]均實(shí)現(xiàn)了光學(xué)成像軟極限的突破，并在活體成像領(lǐng)域取得了豐富的成果。

對于本文提到的4種技術(shù)，實(shí)現(xiàn)深度成像的適用技術(shù)則各不相同。對于大視場物鏡成像系統(tǒng)，使用傳統(tǒng)的層切技術(shù)實(shí)現(xiàn)三維成像面臨新的問題：由于傳統(tǒng)的層切技術(shù)要求形成均勻厚度的薄切片，因此切片的面積往往很小，可能需要多張切片才能使大視場物鏡的FOV得到有效利用[80]。一個可行的思路是利用光片顯微的光學(xué)層切能力[24,81-82]，通過合理的照明物鏡選型，實(shí)現(xiàn)大視場物鏡全FOV內(nèi)的均勻照明。這一思路同樣適用于曲面探測成像技術(shù)。這一技術(shù)路線有一個明顯的優(yōu)勢：由于光片的瑞利長度和厚度正相關(guān)，實(shí)現(xiàn)毫米視場的光片照明對應(yīng)的光片厚度很容易達(dá)到10 μm以上[82]，但是大視場物鏡由于大入瞳直徑和長工作距離的特點(diǎn)，其焦深也可達(dá)到數(shù)個微米[6]，因此大視場物鏡成像和曲面探測成像對厚光片的離焦背景具有更好的魯棒性。此外，由于大視場物鏡具有相對更長的工作距離，與光片技術(shù)和組織透明技術(shù)結(jié)合后，相對于傳統(tǒng)的光片成像技術(shù)，有可能實(shí)現(xiàn)更大的成像深度。而基于近紅外II區(qū)激發(fā)的共聚焦或多光子大視場物鏡成像技術(shù)可能是個有前景的方向，其可以兼顧大視場和大深度成像，只是在成像速度和分辨率上需要做出一定的取舍。對于陣列顯微和無透鏡顯微，由于只是用于對較薄的樣品進(jìn)行成像，若要實(shí)現(xiàn)深度成像，則還是需要通過多次切片成像。

3.2 超分辨成像

前面提到的高SBP顯微成像儀的分辨率均受衍射極限的限制，若是可以發(fā)展一種可以在大FOV的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)亞衍射極限分辨率的超分辨成像系統(tǒng)，則可以為探索生物大分子和整體細(xì)胞/組織功能之間的聯(lián)系提供重要思路[1,83-84]。這是因?yàn)?，對于生命科學(xué)而言，發(fā)展一類具有大視場超分辨成像能力的顯微成像技術(shù)具有重要意義。一般來說，生物樣本的活體原位觀測最為客觀，最能反映生物組織內(nèi)最真實(shí)的場景。例如，活體器官中的諸多細(xì)胞構(gòu)成了一個精密的微觀世界，細(xì)胞之間、細(xì)胞和細(xì)胞器之間的物質(zhì)交換、相互作用和遷移等在各種生理現(xiàn)象中發(fā)揮著重要作用[85]。而體外觀察很難去重建一個具有眾多生理信號和完整周邊組織的環(huán)境，因此所觀測到的動態(tài)過程也非自然狀態(tài)下的，這一點(diǎn)在駱利群教授課題組[86]近期的果蠅神經(jīng)發(fā)育實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步的證實(shí)。然而，觀測這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或信號大分子需要具有超分辨成像能力的顯微系統(tǒng)，傳統(tǒng)的超分辨成像技術(shù)是以犧牲單次成像通量為代價的，完成具有多個細(xì)胞的較大視場的超分辨成像需要很長時間，其時間分辨率不足以解析組織內(nèi)的相互作用和動態(tài)過程，影響了生命科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。因此，有必要發(fā)展一類不僅可以同時對多個細(xì)胞成像且具備亞細(xì)胞甚至單分子級別分辨率的大視場的超分辨成像顯微成像系統(tǒng)，它在時間分辨率上的提升有望幫助生命科學(xué)領(lǐng)域獲取新的成果。

常用的超分辨技術(shù)包括基于點(diǎn)掃描的受激發(fā)射損耗[87]（Stimulated Emission Depletion，STED），基于單分子定位（Single-Molecule Localization Microscopy，SMLM）的隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微[88]（Stochastic Reconstruction Microscopy，STORM）、光激活定位顯微[89]（PhotoActivated Localization Microscopy，PALM）和結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)[90]（Structured Illumination Microscopy，SIM）等，對于可以實(shí)現(xiàn)單分子分辨率（10到100 nm）的超分辨技術(shù)，其成像視場多在10 μm×10 μm到50 μm×50 μm之間，這一視場只能覆蓋兩三個小細(xì)胞或大的細(xì)胞的一部分，無法實(shí)現(xiàn)高通量成像。

目前原理上可適用于大視場成像的超分辨技術(shù)主要集中在SMLM和SIM兩類，而STED受限于點(diǎn)掃描模式，用于大視場成像時速度太慢，一般不被考慮。近年來，大視場的超分辨成像技術(shù)主要有以下幾種實(shí)現(xiàn)路線：一類是解耦照明和檢測光路，包括基于光子芯片的納米顯微鏡技術(shù)[91-93]和基于光片顯微的超分辨技術(shù)[81,94-95]；二是在傳統(tǒng)的寬場顯微成像的基礎(chǔ)上改進(jìn)照明模式實(shí)現(xiàn)大視場超分辨成像[96-99]。這兩種技術(shù)路線目前均能夠使FOV突破100 μm × 100 μm，且分辨率優(yōu)于100 nm，SBP可以達(dá)到107以上。其中，光子芯片是利用全內(nèi)反射實(shí)現(xiàn)均勻照明，主要用于薄切片樣品成像，目前使用低倍率高NA的商業(yè)顯微物鏡，最大成像視場可以達(dá)到毫米級別，將來有望和大視場物鏡或微透鏡陣列結(jié)合使用。而基于光片顯微技術(shù)單幀成像視場相對較小，光片的瑞利長度可以表達(dá)為2λ/πNA2，其中λ為照明波長，NA為照明物鏡的數(shù)值孔徑。因?yàn)檎彰魑镧R的NA難以降低，對于0.06＞NA＞0.02的照明物鏡，通?？梢愿采w50～500 μm的FOV（λ=488 nm），再考慮到生物組織內(nèi)散射對光片的影響，實(shí)際FOV會更小。因此目前借助光片顯微實(shí)現(xiàn)超分辨成像的，主要有晶格光片+SIM/PALM的模式[94]，或者和寬場成像類似，結(jié)合膨脹顯微技術(shù)[100]和低倍率物鏡實(shí)現(xiàn)超分辨成像。其中膨脹顯微是近幾年的新興技術(shù)，其利用聚丙烯酸水凝膠等化學(xué)物質(zhì)吸水膨脹的方法實(shí)現(xiàn)生物樣品各向同性的物理放大，從而揭示樣品的納米信息，但系統(tǒng)并未突破衍射極限，這一點(diǎn)和常見的超分辨技術(shù)并不相同。目前4倍的膨脹技術(shù)已經(jīng)十分成熟，可以和多種顯微成像方式結(jié)合，并成功應(yīng)用于一系列動物模型，如小鼠[101]，斑馬魚[102]和果蠅[103]，因此膨脹顯微和前文提到的諸多高SBP顯微成像儀的結(jié)合是實(shí)現(xiàn)大視場超分辨成像的一個可能解決方案。至于基于照明模式改進(jìn)方法實(shí)現(xiàn)的大視場超分辨，目前實(shí)現(xiàn)的成像視場在100 μm到200 μm之間，仍然面臨的一些技術(shù)問題限制了其視場的進(jìn)一步擴(kuò)大。這些問題包括視場內(nèi)照明的均勻性問題，樣品表面散斑干擾問題，以及大功率激光照明對物鏡涂層可能的損傷問題等。隨著這些問題的逐步解決，其與大視場物鏡和曲面探測結(jié)合將會是個有前景的方向。

4 結(jié)束語

綜上所述，高SBP顯微成像儀的發(fā)展路線多樣，在性能上也各自取得了很好的突破?；谕哥R成像的3種系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)SBP的突破相對更復(fù)雜，成本更高，但成像的保真度更高，應(yīng)用場景更廣；而基于無透鏡計算成像的片上顯微實(shí)現(xiàn)SBP的突破更簡單、更直接、對算法和傳感器技術(shù)進(jìn)步的依賴更強(qiáng)，但是其分辨率和成像保真度均有待進(jìn)一步提升，應(yīng)用場景相對受限。目前，高SBP顯微成像儀多用于寬場成像，其與相對成熟的各類成像模態(tài)（雙光子，超分辨等）、制樣技術(shù)（組織光透明、層切、膨脹等）的合理搭配，將會使它的應(yīng)用場景得到有力拓展，文中也介紹了一些成功的實(shí)踐案例。除了以上提到的4類光學(xué)顯微成像技術(shù)外，光學(xué)相干層析（Optical Coherent Tomography, OCT）、光聲顯微成像等也在大視場成像領(lǐng)域取得了很好的成果[104-108]，其成像原理雖有差異但實(shí)現(xiàn)大視場顯微成像的方法相似——多次掃描與應(yīng)用高SBP成像物鏡等。目前大視場光學(xué)顯微成像技術(shù)仍普遍面臨成像幀率低這一瓶頸，但隨著傳感器性能和計算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，這一問題也必將獲得有效解決，其有望為大視場顯微生物成像提供更好的工具選項(xiàng)。