劉丹陽， 顏洋洋， 王成章

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042)

靛藍(lán)是一種來自植物的古老的天然染料，被廣泛應(yīng)用于紡織、木器和繪畫等領(lǐng)域[1]。當(dāng)前大部分牛仔衣物的染料是合成靛藍(lán)，年產(chǎn)量數(shù)萬噸。由于靛藍(lán)在牛仔衣物染色中的大量使用，產(chǎn)生了很多污水，因此，很多學(xué)者致力于使用化學(xué)催化劑[2-3]或生物法[4]加以處理，以期更快降解靛藍(lán)[5]或靛藍(lán)胭脂紅[6]。而有研究發(fā)現(xiàn)[7-9]天然靛藍(lán)提取物溶液放置幾小時(shí)后會(huì)有顏色褪去現(xiàn)象，也有報(bào)道珍貴的古代書畫或絲織品中顏料靛藍(lán)的顏色會(huì)隨時(shí)間褪色，從而造成資源浪費(fèi)和藝術(shù)品損失。因此，在靛藍(lán)提取物的含量測(cè)定、珍貴文物或紡織品的保存過程中，需要盡量避免靛藍(lán)的降解[10-11]，但是關(guān)于靛藍(lán)光照穩(wěn)定性的相關(guān)研究較少。Novotna等[12]研究發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)降解產(chǎn)物中有靛紅、異酸酐、鄰氨基苯甲酸、色胺酮以及其他未知化合物，且天然靛藍(lán)降解率高于合成靛藍(lán)；Sousa等[13]研究發(fā)現(xiàn)過氧化物或其他氧基自由基在靛藍(lán)的降解中起關(guān)鍵作用，溶液和凝膠介質(zhì)中的靛藍(lán)降解產(chǎn)物主要是靛紅；Gandra等[14]研究發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)和靛藍(lán)胭脂紅在輻照后形成單線態(tài)分子氧，量子產(chǎn)率分別為0.6和0.3～0.5；張笑河等[15]研究得到食用靛藍(lán)降解率與光照時(shí)間之間的指數(shù)關(guān)系，可方便地檢測(cè)食用靛藍(lán)的降解率。本研究測(cè)定了溶液質(zhì)量濃度、光照時(shí)間和光照方式對(duì)合成靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品吸收光譜的影響，建立了溶液中靛藍(lán)降解影響因素模型，得到了靛藍(lán)光降解率與不同影響因素之間的關(guān)系，并進(jìn)一步分析了光照時(shí)間及光照方式對(duì)靛藍(lán)提取物降解過程及產(chǎn)物的影響，以期在實(shí)際應(yīng)用中盡量避免靛藍(lán)的降解，從而指導(dǎo)染色工藝、色彩保存或?qū)嶋H檢測(cè)工作。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

馬藍(lán)葉發(fā)酵制備的靛藍(lán)膏購自貴州省獨(dú)山縣麻尾工業(yè)園區(qū)，靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～5%，含水量50%～60%。靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品(純度97%)、靛紅標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，阿拉丁試劑公司；二甲基亞砜(DMSO)等試劑均為分析純。

KH5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)有限公司；CBM-10A VP Plus高效液相色譜(HPLC)儀，日本島津公司。

1.2 靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光氧化降解實(shí)驗(yàn)

1.2.1光照時(shí)間的影響 在室內(nèi)自然光條件下，將不同質(zhì)量濃度的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液放置0、 1、 2、 5、 17、 18、 19、 20、 21和24 d，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸收光譜，直至靛藍(lán)吸收峰基本不再變化。為了考察部分降解的靛藍(lán)溶液在黑暗條件下是否會(huì)繼續(xù)降解，將自然光下放置5 d的不同質(zhì)量濃度靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用黑色塑料袋包裹放置在柜子中模擬黑暗環(huán)境，間隔同樣時(shí)間測(cè)試自然光和黑暗條件下放置的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收光譜。

1.2.2光照方式的影響 用手電筒白光(20 W)照射0.03 g/L的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并測(cè)試在照射0、 5、 10、 20、 40、 60和70 min后的紫外吸收光譜；同樣地，用手提式紫外燈(365 nm+254 nm)照射0.03 g/L的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并在照射0、 1、 2、 3、 5、 8和10 min后測(cè)試溶液的紫外吸收光譜；另將0.03 g/L的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于室外太陽光下照射1 h測(cè)量吸光度。

1.3 靛藍(lán)提取物的制備

靛藍(lán)膏在烘箱中80 ℃烘干，干燥后研磨成粉，過0.178 mm篩，得到靛藍(lán)提取物1；靛藍(lán)提取物1于水中均質(zhì)后加鹽酸，離心，下層固體用開水洗滌至中性并烘干，即得靛藍(lán)提取物2；靛藍(lán)提取物1和靛藍(lán)提取物2分別經(jīng)葡萄糖氧化還原提取得到粉末狀靛藍(lán)提取物3和靛藍(lán)提取物4，靛藍(lán)提取物1～4的靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.6%、 28.22%、 50.91%和75.91%。

1.4 靛藍(lán)提取物溶液的光氧化降解實(shí)驗(yàn)

1.4.1光照時(shí)間的影響 稱取5 mg靛藍(lán)提取物1粉末于100 mL容量瓶中，60 mL DMSO溶解后超聲波處理30 min，冷卻至室溫后定容。用紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm波段進(jìn)行掃描。靛藍(lán)提取物1溶液在室溫下自然光的環(huán)境下放置，并在不同時(shí)間間隔下重復(fù)測(cè)量該溶液的吸光度。

1.4.2光照方式的影響 分別用手電筒白光(20 W)、手提式紫外燈(365 nm+254 nm)照射靛藍(lán)提取物溶液，并測(cè)試在不同照射時(shí)間下的紫外吸收光譜。

1.5 分析方法

1.5.1靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取5.10 mg靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加入DMSO溶解后超聲波處理30 min，冷卻至室溫后定容，配置成0.05 g/L母液，并稀釋得到不同質(zhì)量濃度(0.002～0.014 g/L)的靛藍(lán)溶液。在紫外-可見分光光度計(jì)上用DMSO溶劑作空白對(duì)照，對(duì)不同質(zhì)量濃度的靛藍(lán)溶液在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，由吸收光譜確定在可見光區(qū)靛藍(lán)的最大吸收波長(zhǎng)為618 nm。在618 nm的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定靛藍(lán)溶液的吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到的回歸方程為：y=61.648 2x+0.001 4，R2=0.999 7。靛藍(lán)在質(zhì)量濃度為0.002～0.014 g/L范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

1.5.2降解率的計(jì)算 由于靛藍(lán)的吸光度和質(zhì)量濃度具有線性相關(guān)關(guān)系，故可以用618 nm處靛藍(lán)吸光度變化值代表靛藍(lán)降解的質(zhì)量濃度變化值，靛藍(lán)降解率計(jì)算公式如下：降解率=(初始吸光度-光照一定時(shí)間后吸光度)/初始吸光度×100%。

1.5.3HPLC分析 將白光照射后的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和靛藍(lán)提取物溶液進(jìn)行HPLC分析，并與靛藍(lán)、靛紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖對(duì)比。HPLC分析條件：PRAZIS C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)；流動(dòng)相為甲醇/水(體積比70 ∶30)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)289 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同條件對(duì)靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品降解的影響

2.1.1光照時(shí)間 為了探究靛藍(lán)在自然光下的穩(wěn)定性，將不同質(zhì)量濃度的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液于室內(nèi)自然光條件下放置不同時(shí)間，并測(cè)試其618 nm處吸光度的變化?；诓煌|(zhì)量濃度靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液在不同時(shí)間的吸光度值，通過指數(shù)擬合建立了靛藍(lán)在618 nm處的吸光度-時(shí)間模型(圖1)。由圖可知，自然光下(圖1(a)～圖1(c))不同質(zhì)量濃度靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液隨時(shí)間降解曲線的擬合方程R2值均不小于0.997，而放置在黑暗條件下(圖1(d)～圖1(f))的靛藍(lán)溶液隨時(shí)間降解曲線的擬合方程R2值不小于0.990。故相比較而言，自然光下的靛藍(lán)溶液吸光度值隨時(shí)間呈指數(shù)變化更為準(zhǔn)確。將在自然光下放置5天的溶液置于黑暗條件下(圖1(d)～(f))，對(duì)比自然光下靛藍(lán)溶液的降解曲線(圖1(a)～1(c))，發(fā)現(xiàn)5～24天內(nèi)黑暗條件下的對(duì)照樣品會(huì)繼續(xù)降解，但吸光度隨時(shí)間下降幅度較小，且最終降解率較小。

自然光natural light: a.0.002 g/L; b.0.006 g/L; c.0.014 g/L

由圖1可知，0.002、 0.006和0.014 g/L靛藍(lán)溶液的吸光度值均在前5天明顯降低，5～17天內(nèi)緩慢降低，17天后逐漸穩(wěn)定。而由圖2可知，不同質(zhì)量濃度靛藍(lán)溶液的降解率不同，質(zhì)量濃度較大的靛藍(lán)溶液在相同時(shí)間的降解率更大，如24天時(shí)0.002 g/L靛藍(lán)溶液降解率為95.63%，而0.014 g/L靛藍(lán)溶液降解率約為100%。

圖2 自然光條件下不同質(zhì)量濃度靛藍(lán)溶液的降解率Fig.2 Degradation rate of indigo solutions with different mass concentrations under natural light

同時(shí)，通過觀察靛藍(lán)溶液的顏色變化(圖3(a))可知，自然光下放置3天靛藍(lán)母液(0.05 g/L)就由深藍(lán)色變?yōu)辄S色，而放置相同時(shí)間的稀釋得到質(zhì)量濃度較小(0.002～0.014 g/L)的溶液顏色仍為藍(lán)色，這進(jìn)一步說明濃度越大的溶液降解速率更快。由圖3(b)可以看出，在自然光下放置24天后的靛藍(lán)溶液藍(lán)色褪去，變?yōu)闊o色或黃色；而由圖3(c)可知，在自然光下放置5天后，再置于黑暗條件下19天，累計(jì)放置24天后對(duì)照樣品溶液仍為藍(lán)色(母液除外)。且根據(jù)擬合的指數(shù)方程可知，與自然光條件下放置的溶液相比，相同質(zhì)量濃度時(shí)黑暗條件下的靛藍(lán)溶液擬合所得方程的指數(shù)項(xiàng)和指數(shù)前系數(shù)更小，這進(jìn)一步說明部分降解的靛藍(lán)溶液置于黑暗條件下降解速率會(huì)變慢直至穩(wěn)定。

a.自然光natural light,3天3 days;b.自然光natural light,24天24 days;c.自然光5天+黑暗19天natural light,5 days+dark,19 days圖3 不同光照條件下靛藍(lán)溶液的顏色變化Fig.3 Color changes of indigo solutions under the different light conditions

2.1.2光照方式 由圖4(a)可知，用手電筒白光持續(xù)照射靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí)，隨著光照時(shí)間延長(zhǎng)，靛藍(lán)最大吸收峰(618 nm)明顯下降且較低波長(zhǎng)(400～450 nm)區(qū)域的吸收峰強(qiáng)度增加。在光照60 min時(shí)，618 nm處吸收峰完全消失，即靛藍(lán)溶液完全降解。

a.白光white light; b.紫外光ultraviolet light; c.靛紅標(biāo)準(zhǔn)品isatin standard; d.3種光照方式的對(duì)比three different illumination methods圖4 不同光照方式照射不同時(shí)間后靛藍(lán)溶液的吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of indigo irradiated solution under different illumination methods

由圖4(b)可知，當(dāng)用紫外光照射靛藍(lán)溶液時(shí)，可以看到溶液顏色逐漸由藍(lán)色變?yōu)辄S色，光照10 min時(shí)500 nm后吸收光譜區(qū)域無吸收峰，但400～450 nm左右區(qū)域的吸收峰增加。由圖4(c)可知，光照處理后靛藍(lán)溶液的吸收光譜與靛紅標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖非常相似，故猜測(cè)靛藍(lán)光照后譜圖中400～450 nm區(qū)域吸收峰強(qiáng)度的增加可對(duì)應(yīng)靛紅含量的增加(418 nm)，初步證明光照后靛藍(lán)溶液降解生成靛紅。

經(jīng)不同光照方式處理的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在照射不同時(shí)間后，深藍(lán)色靛藍(lán)溶液均變?yōu)辄S色。對(duì)比不同光照方式光照后靛藍(lán)溶液的紫外吸收光譜(圖4(d))，可以看出相同時(shí)間(60 min)的手電筒白光照射后光譜和太陽光照射后溶液吸收光譜重合性較好，故手電筒白光對(duì)靛藍(lán)溶液的作用與太陽光作用相似。而紫外光照射后的溶液光譜吸收峰峰位和峰值與其他兩種光照方式的溶液光譜均不同。這可能是由于紫外光能量高，使得靛藍(lán)降解后產(chǎn)物進(jìn)一步反應(yīng)，引起的溶液降解反應(yīng)比太陽光和手電筒白光的降解反應(yīng)更復(fù)雜。因此，在實(shí)驗(yàn)室測(cè)量靛藍(lán)含量時(shí)，靛藍(lán)溶液配置后需避光放置，特別是避免紫外光照射，然后快速測(cè)量，否則靛藍(lán)降解會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏低。

綜上所述，手電筒白光、太陽光和紫外光照射都對(duì)靛藍(lán)溶液產(chǎn)生了影響。由圖5可知，不同光照方式下靛藍(lán)均能完全降解，而能量較強(qiáng)的紫外光對(duì)靛藍(lán)降解影響更大，照射5 min時(shí)降解率就已經(jīng)達(dá)到100%。

圖5 不同光照方式時(shí)0.03 g/L靛藍(lán)溶液的降解率 圖6 IE 1溶液的吸光度隨時(shí)間降解曲線(618 nm)Fig.5 Degradation rate of 0.03 g/L indigo solution under different illumination modes Fig.6 Degradation curve of absorbance of IE 1 solution(618 nm)

2.2 光照時(shí)間和光照方式對(duì)靛藍(lán)提取物溶液的影響

將靛藍(lán)提取物1(靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.6%)溶液于自然光條件下放置，測(cè)試不同時(shí)間下的吸收光譜并繪制降解曲線(圖6)，發(fā)現(xiàn)溶液的吸光度值(618 nm)也是前5天下降較快，5～24天內(nèi)緩慢降低，最后靛藍(lán)幾乎降解完全，變?yōu)闊o色透明溶液。靛藍(lán)提取物在618 nm處的吸光度-時(shí)間擬合曲線R2值為0.998，靛藍(lán)溶液吸光度值隨時(shí)間呈指數(shù)變化。

將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的靛藍(lán)提取物2、 3和4溶液于自然光條件下放置，測(cè)試不同時(shí)間下的降解率，結(jié)果見圖7。由圖7可知，自然光條件下放置1天后靛藍(lán)提取物4溶液的降解率約為98%，而13天后靛藍(lán)提取物2溶液的降解率約為98%。靛藍(lán)提取物溶液的濃度與所含靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)成正比，故濃度較大的靛藍(lán)溶液在相同時(shí)間下降解率更大。由圖8可知，用不同光照方式處理靛藍(lán)提取物3溶液均能完全降解，而能量較強(qiáng)的紫外光對(duì)靛藍(lán)降解影響更大，10 min內(nèi)降解率達(dá)到100%。

圖7 自然光條件下不同IE溶液的降解率 圖8 不同光照方式下IE 3溶液的降解率Fig.7 Degradation rate of different IE solutions under natural light Fig.8 Degradation rate of IE 3 solution under different illumination modes

2.3 靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品和靛藍(lán)提取物溶液的HPLC分析

根據(jù)2.1節(jié)的分析可以初步判斷靛藍(lán)降解生成靛紅，而HPLC圖譜(圖9)進(jìn)一步證明靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品和靛藍(lán)提取物均降解生成靛紅，并同時(shí)生成幾種其他物質(zhì)。根據(jù)靛紅標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品和靛藍(lán)提取物降解生成靛紅的比例分別為56.78%和85.50%，故靛紅是靛藍(lán)降解的主要產(chǎn)物[13]。

a.靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品indigo standard; b.靛紅標(biāo)準(zhǔn)品isatin standard; c.IE 3; d.靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品白光照射后 indigo standard irradiated by white light; e.IE 3白光照射后IE 3 irradiated by white light圖9 光照前后的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和IE溶液HPLC圖譜Fig.9 HPLC spectra of indigo solution and IE solution before and after illumination

2.4 靛藍(lán)光降解得到靛紅的機(jī)理分析

Kuramoto等[16-17]認(rèn)為單線態(tài)氧影響靛藍(lán)的光降解，在靛藍(lán)溶液中添加三乙烯二胺(DABCO)或二甲基二硫代氨基甲酸鎳等單線態(tài)氧猝滅劑，可以降低靛藍(lán)的光降解速率。近年來，Sousa等[13]研究發(fā)現(xiàn)在沒有氧氣的情況下，335 nm光或610 nm光照射下靛藍(lán)的降解率僅為有氧氣情況下的1/20，但靛藍(lán)降解不是單線態(tài)氧引起而是氧基自由基或過氧化物自由基起到關(guān)鍵作用。Iuga等[18]通過密度泛函理論(DFT)研究了羥基自由基(·OH)和氫過氧化物自由基(·OOH)引發(fā)靛藍(lán)氧化降解的量子化學(xué)機(jī)理。該研究從分子機(jī)制解釋了·OH和·OOH攻擊靛藍(lán)中心雙鍵，形成的中間體不穩(wěn)定，迅速斷裂生成靛紅，從而導(dǎo)致染料褪色(圖10)。反應(yīng)加成產(chǎn)物的自旋密度在未取代側(cè)分子周圍離域，然后分子內(nèi)重排、斷鍵產(chǎn)生一個(gè)靛紅分子和一個(gè)自由基，后者能與氧和靛藍(lán)發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生成更多的靛紅。Nassar等[2]將可以產(chǎn)生氫過氧化物自由基的雙氟硼吡咯光催化劑(CAT)用于靛藍(lán)降解，發(fā)現(xiàn)一個(gè)CAT分子可以使40多個(gè)靛藍(lán)分子褪色；將自由基淬滅劑二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)添加到靛藍(lán)溶液中，靛藍(lán)降解反應(yīng)停止。綜上，自由基是靛藍(lán)光氧化降解的關(guān)鍵因素[2]。故應(yīng)減少空氣中易發(fā)生自由基反應(yīng)的污染物或臭氧等對(duì)靛藍(lán)溶液、靛藍(lán)紡織品或繪畫品的干擾。實(shí)驗(yàn)室中靛藍(lán)溶液測(cè)試時(shí)應(yīng)該使用新鮮溶劑，即新蒸或剛開蓋的DMSO或DMF溶劑中由于含氧/水量較低，氧基自由基或羥基自由基含量相對(duì)較低，并避光，蓋上瓶塞保持溶液密閉，通過多種措施減緩靛藍(lán)光降解。

3 結(jié) 論

3.1在對(duì)靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液光降解影響因素進(jìn)行考察的基礎(chǔ)上，分析了靛藍(lán)提取物溶液的光氧化降解。結(jié)果表明：在自然光條件下，不同質(zhì)量濃度靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液在前5天降解最明顯，17天后大部分靛藍(lán)都已經(jīng)降解(降解率>90%)，24天時(shí)達(dá)到穩(wěn)定幾乎不再降解。部分降解的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于黑暗條件下降解速率會(huì)變慢，直至穩(wěn)定。靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品和靛藍(lán)提取物溶液最大吸收峰位(618 nm)處吸光度值隨時(shí)間均呈指數(shù)變化，均表現(xiàn)為濃度越高降解速率越快。

3.2HPLC分析結(jié)果表明：靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品和靛藍(lán)提取物降解生成靛紅的比例分別為56.78%和85.50%，說明靛紅是靛藍(lán)降解的主要產(chǎn)物。

3.3能量較強(qiáng)的紫外光對(duì)靛藍(lán)降解影響更大，紫外光照射使氧氣生成活潑的氧自由基，氧自由基進(jìn)攻靛藍(lán)分子的雙鍵，形成的不穩(wěn)定中間體雙鍵斷裂得到靛紅。為了減緩靛藍(lán)的光降解，實(shí)際測(cè)量過程中靛藍(lán)溶液應(yīng)采取遮光、容器密閉、新鮮溶劑配置等措施，靛藍(lán)染色紡織品、畫作等文物在博物館中展覽也應(yīng)該避免紫外光的干擾、保持干燥和防止有機(jī)化學(xué)污染物的接觸，良好的環(huán)境更有利于文物的保護(hù)。