王春曉，郝倩琳，于秋鴻，裴玉賀，宋希云，李 軍

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東 青島 266109)

【研究意義】近年來作物生長季頻繁發(fā)生的高溫?zé)岷σ约耙蜃匀唤邓痪鶆蛟斐傻木植康貐^(qū)干旱等因素嚴(yán)重制約了作物的生長發(fā)育，造成全球作物“產(chǎn)量與品質(zhì)”雙下降。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2006年我國川渝地區(qū)因高溫和干旱造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)216.4億元，1980—2012年間美國因高溫或干旱等災(zāi)害造成的損失高達(dá)約10億美元[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，植物在遭受高溫等逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)會積累大量的代謝產(chǎn)物如甲基乙二醛(MG)等[3]。MG是一類有毒的醛酮類代謝物，能夠使多種細(xì)胞成分發(fā)生不可逆地修飾、形成加合物和交聯(lián)，產(chǎn)生毒害效應(yīng)[4]。細(xì)胞內(nèi)MG的降解途徑：一是依賴還原型谷胱甘肽(GSH)的途徑，包括乙二醛酶1(GLY1)和乙二醛酶2(GLY2)；二是不依賴GSH的途徑，如乙二醛酶3(GLY3)[5]，最終將MG轉(zhuǎn)化為無毒的乳酸，降低或消除其毒害作用[6]。乙二醛酶系統(tǒng)在動(dòng)物細(xì)胞中研究得比較清楚，其參與細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)生、成熟和細(xì)胞死亡等生物過程[7-9]，如臨床上通過提高 Gly1的活性來治療糖尿病和高血糖癥[10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物Gly1基因迄今已在擬南芥、水稻、玉米和甘蔗等得到克隆，屬于多基因家族[11]。Gly1的表達(dá)除了受非生物逆境和生物脅迫的誘導(dǎo)外，還受激素如生長素和細(xì)胞分裂素等的誘導(dǎo)，說明 Gly1蛋白參與植物對非生物、生物脅迫和激素信號的響應(yīng)[12-15]。過表達(dá)Gly1和Gly2的轉(zhuǎn)基因煙草和水稻表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽和抗旱能力[6, 16-17]。另外，用茉莉酸處理的玉米幼苗 Gly1蛋白的活性比對照顯著提高，且對鹽堿的脅迫耐受能力明顯增強(qiáng)[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】迄今，對玉米ZmGly1的表達(dá)特性和生物學(xué)功能缺乏深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用生物信息學(xué)和qRT-PCR方法對ZmGly1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和表達(dá)差異等進(jìn)行解析，找出該基因在高溫和干旱脅迫應(yīng)答中的可能作用，以期為將來培育抗旱、耐熱玉米新種質(zhì)提供可利用的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用的玉米品種為“鄭單958”。將種子播于含有營養(yǎng)土和蛭石(3∶1)的花盆(1粒/盆)中，置于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室內(nèi)(25 ℃)生長。待幼苗長至三葉期時(shí)分別進(jìn)行干旱(20% PEG600)和高溫(37 ℃)處理，在處理0、12、24、36、48 h后選取玉米的根、莖和葉，快速置于液氮中保存?zhèn)溆?。每個(gè)處理含5棵幼苗，重復(fù)3次。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購自Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR所用引物

1.3 生物信息學(xué)分析

從NCBI網(wǎng)站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到ZmGly1基因(登錄號：NM_001153401)序列；用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)軟件分析ZmGly1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；用TMHMM Server 2.0軟件進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)分析；用MEGA 7.0軟件對ZmGly1進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.4 總RNA提取、cDNA合成和表達(dá)模式分析

按照操作說明，用RNA提取試劑盒提取總RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；用qRT-PCR分析表達(dá)模式，以玉米Actin作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmGly1蛋白的理化性質(zhì)分析

用ProtParam tool軟件分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly1基因的cDNA序列為669 bp，編碼222個(gè)氨基酸，理論分子量為24.98 kD，等電點(diǎn)為6.6。對氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，帶負(fù)電荷的氨基酸(Asp + Glu)殘基總數(shù)為30，帶正電荷的氨基酸(Arg + Lys)殘基總數(shù)為29，Leu含量最高，占8.1%；Cys含量最少，占0.9%。疏水系數(shù)是-0.448，為親水性蛋白。TMHMM Server軟件分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，為細(xì)胞質(zhì)蛋白(圖1)。

圖1 ZmGly1跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.2 ZmGly1蛋白結(jié)構(gòu)分析

用SOPMA軟件對ZmGly1蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在二級結(jié)構(gòu)中N端為無規(guī)則卷曲部分，占比約49.13%；其次是α螺旋，占比為23.04%；β轉(zhuǎn)角占比為7.39%，其余的延伸鏈結(jié)構(gòu)(圖2-a)。用SWISS-MODEL軟件對ZmGly1蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly1是一種金屬酶，在蛋白質(zhì)的A鏈和B鏈上含有4個(gè)結(jié)合Zn2+的配體氨基酸殘基，即His162、Glu208和Gln68、Glu134(圖2-b)。

a.二級結(jié)構(gòu)模型；b.空間結(jié)構(gòu)模型和金屬結(jié)合位點(diǎn)

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用BLAST程序從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與ZmGly1同源的其他植物的蛋白序列，然后選取氨基酸序列同源性≥60%的14種植物進(jìn)行進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明ZmGly1蛋白與高粱SbGly1同源性為92.51%，親緣關(guān)系最近；與三裂葉薯MeGly1的同源性為67.81%，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖3)。

BdGly1為二穗短柄草; BhGly1為冬瓜; CmGly1為筍瓜; CsGly1為亞麻薺; DeGly1為福尼奧小米；McGly1為苦瓜; MeGly1為木薯; ObGly1為短花藥野生稻；OsGly1為粳稻; PvGly1為柳枝稷；SbGly1為高粱；SiGly1為粟; SvGly1為狗尾草；ZmGly1為玉米

2.4 ZmGly1基因的組織特異性表達(dá)

如圖4所示，ZmGly1基因在玉米根、莖和葉片中均有表達(dá)，其中，葉片中的相對表達(dá)量最高，分別是根和莖中表達(dá)量的4.3和3.1倍。

圖4 ZmGly1在不同組織的相對表達(dá)量

2.5 ZmGly1基因在高溫和干旱逆境脅迫下的表達(dá)情況分析

如圖5-a所示，與對照相比，高溫處理下ZmGly1在葉片中的表達(dá)隨時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢。如在高溫處理12 h后表達(dá)量顯著降低，為對照的57%；但在處理24 h后表達(dá)量顯著升高，為對照的1.2倍，之后表達(dá)量下降，到處理48 h后表達(dá)量約為對照的97%。如圖5-b所示，與對照相比，干旱處理下ZmGly1在葉片中的表達(dá)隨時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在干旱處理12 h后表達(dá)量較高，是對照的1.1倍；之后表達(dá)量逐漸下降，如在處理48 h后的表達(dá)量為對照的60%。

圖5 高溫(a)和干旱(b)脅迫下ZmGly1基因的相對表達(dá)量

3 討 論

玉米是一種重要的糧飼兼用作物。然而，夏玉米生產(chǎn)常因季節(jié)性高溫和由高溫誘發(fā)的干旱等雙重災(zāi)害導(dǎo)致玉米減產(chǎn)，因此挖掘抗逆優(yōu)異基因進(jìn)而培育抗性較強(qiáng)的玉米品種是減少高溫?zé)岷p失的有效途徑[19]。乙二醛酶1(Gly1)是依賴GSH途徑的限速酶，在細(xì)菌、酵母、動(dòng)植物等生物體中普遍存在[20]。Gly1發(fā)揮著重要的解毒功能，能夠有效降低細(xì)胞中的甲基乙二醛含量，清除比例可達(dá)99%[21]。擬南芥Gly1是一類依賴金屬離子的蛋白酶，催化活性需要 Ni2+和Zn2+作為輔因子[22]。對ZmGly1基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly1基因的分子量為24.98 kD，是一種親水性蛋白。由于缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，推測該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中還有較高比例的α螺旋和β轉(zhuǎn)角，這對維持ZmGly1蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定起重要作用。與擬南芥Gly1類似，ZmGly1蛋白也是一種金屬酶， 但需要Zn2+作為輔因子，在蛋白的A鏈和B鏈上各包含1個(gè)Zn2+金屬結(jié)合位點(diǎn)，分別位于His162、Glu208和Gln68、Glu134。通過對14種植物Gly1蛋白氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly1與高粱SbGly2同源性最高，親緣關(guān)系最近。

GLY1是一個(gè)基因家族，已有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥基因組中有11個(gè)編碼GLY1的同源基因[23]。對其轉(zhuǎn)錄本豐度分析發(fā)現(xiàn)，AtGLY1不僅在營養(yǎng)器官如葉、根中表達(dá)，也可在繁殖器官如花、角果中表達(dá)，如AtGLY1.1在葉片中的轉(zhuǎn)錄本豐度最高，在根中最低；且AtGLY1對干旱、高鹽、冷、熱和高光響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本豐度呈現(xiàn)多樣性，如AtGLY1.1對干旱、鹽、冷和熱應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄本豐度下降，而對高光的響應(yīng)升高；AtGLY1.2對鹽、冷和熱應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄本豐度下降，而對干旱、高光的響應(yīng)增加。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，ZmGly1基因在不同組織器官中的表達(dá)水平存在差異，在葉片中的表達(dá)量最高，而在根和莖中表達(dá)量相對較低，這與Schmitz等[23]報(bào)道的AtGLY1.1結(jié)果一致。ZmGly1基因應(yīng)對干旱和高溫脅迫的表達(dá)情況有差異，如干旱處理下ZmGly1基因在葉片中的表達(dá)隨時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但在高溫處理下隨時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先降低后升高再降低的趨勢。

4 結(jié) 論

玉米乙二醛酶1作為依賴Zn2+的蛋白酶，與高粱的親緣關(guān)系最近，通過改變ZmGly1基因的表達(dá)來調(diào)控玉米對高溫和干旱的脅迫應(yīng)答，但具體的生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步解析。