丁頎 寧弋珍 張菁 謝春生 張寶杰＊

(1.肇慶學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東省肇慶市 526061；2.梧州市茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，廣西梧州市，3.肇慶學(xué)院 農(nóng)村科技特派員工作站，廣東省肇慶市526061；)

1 前言

硒是人類體內(nèi)必需的微量元素之一，其兼具金屬性和非金屬性，擁有6種穩(wěn)定同位素，而且還具有清除生物體內(nèi)自由基、抗過氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、排毒等功能，維持機(jī)體中適量的硒水平能預(yù)防多種疾病，如大骨節(jié)、克山病、癌癥等，所以硒對人類的生活和健康有著至關(guān)重要的作用[1,2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些典型的硒蛋白，如谷胱甘肽過氧化物酶、甲狀腺激素脫碘酶和硫氧還蛋白還原酶，這些典型的硒蛋白都是參與細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵蛋白，也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)及甲狀腺激素代謝平衡的重要參與者[3,4]。發(fā)展富硒茶是功能農(nóng)業(yè)的突出代表，開展茶葉中硒蛋白的檢測與營養(yǎng)功能的研究具有重要的意義。

2 硒的種類與檢測

硒可分為總硒、無機(jī)硒和有機(jī)硒。無機(jī)硒主要以硒單體、硒酸鹽和亞硒酸鹽的形式存在[5]。其中有機(jī)硒主要以硒代氨基酸的形式存在，如硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代半胱氨酸，這些硒代氨基酸不僅能通過活性鈉依賴系統(tǒng)被腸道吸收，而且它們與無機(jī)硒相比具有更高生物利用度和較低毒性[6]。在有機(jī)硒中，γ-谷氨酸-甲基硒代半胱氨酸是比較有效的防癌抗癌有機(jī)硒化合物[7]。通常認(rèn)為人體正常一天補硒標(biāo)準(zhǔn)是攝入50到200μg，所以適當(dāng)?shù)倪m時的補硒對身體健康有著十分重要的作用。

檢測硒含量的方法主要有熒光分光光度法、紫外分光光度法、氫化物原子熒光光譜法、石墨爐原子吸收光譜法、電感耦合等離子體光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等[8]。其中氫化物-原子熒光光譜法（HG-AFS）、氫化物發(fā)生原子吸收光譜法（HG-ASS）測試準(zhǔn)確度高，是目前應(yīng)用廣泛的硒的測定方法。氫化物-熒光光譜法（HG-AFS）是最為廣泛運用的硒含量的檢測方法，其結(jié)果準(zhǔn)確度高、操作簡便、靈敏度高的特點使其廣泛受用，大大提高了食品中檢測硒蛋白的效率[9]。近年來，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）由于具有簡單快捷，精度和準(zhǔn)確度高的特性，在硒含量的檢測中應(yīng)用越來越廣泛。而硒形態(tài)的檢測方法是對有機(jī)硒組分的進(jìn)一步細(xì)化，通常需要結(jié)合高效液相色譜預(yù)處理的方法進(jìn)行成分分離[10]。高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法（HPLC-UV-HG-AFS），成本較低，但靈敏度較差[11]。高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（HPLC-ICP-MS），是分析硒形態(tài)最便捷、最靈敏也是最常用的檢測方法，但不提供未知化合物的結(jié)構(gòu)信息且應(yīng)用范圍較小[12]。高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ESI-MS），靈敏度高，選擇性好，準(zhǔn)確度高，能提供未知化合物的結(jié)構(gòu)信息且應(yīng)用范圍廣。

富硒茶通常只檢測總硒、無機(jī)硒和有機(jī)硒，硒蛋白的提取需要特殊的方法[13]。富硒茶中同時存在大量的硒蛋白，硒蛋白占總硒含量的60.12%[14]，茶葉中的硒蛋白多為堿溶性，經(jīng)水浸泡無法溶出而留于茶渣中，占茶渣總量的23.18%之高[15]。而且通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的富硒茶葉，含硒量在0.3-5.0μg/g，但是茶葉中水溶性硒浸出率僅占總硒的10%左右。胡秋輝等人[16]的研究發(fā)現(xiàn)茶葉中的有機(jī)硒占總硒的80%，這些有機(jī)硒主要與蛋白質(zhì)結(jié)合，而硒蛋白占有機(jī)硒的79.56%～88.70%，茶葉中的蛋白質(zhì)含量占茶葉干重的15%-30%。

3 茶葉中典型硒蛋白的功能及檢測

3.1 硒代甲基半胱氨酸（SeMeCys）

硒代甲基半胱氨酸是茶葉中硒代氨基酸的主要存在形態(tài)，其存在的時期和含量并無規(guī)律性，主要由茶樹體內(nèi)硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Selenovysteinemethyltransferase, SMT）決定，能將茶樹內(nèi)具有一定毒害作用的硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸轉(zhuǎn)化為硒代甲基半胱氨酸，并且有效提高茶樹茶葉對硒的吸收、富集和耐性[17]。

秦冰等人[18]運用離子色譜-積分脈沖安培檢測法（HPAEC-IPAD）對茶葉浸提液中硒代氨基酸進(jìn)行定性和定量分析，硒代甲基半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為2.47、3.17和3.77，具有非常好的相關(guān)性，其結(jié)果也表明這種對硒代氨基酸的分析方法操作簡便、準(zhǔn)確度高。

3.2 硒代半胱氨酸（selenocysteine，SeC）

SeC被認(rèn)為是第21種氨基酸，其對應(yīng)的密碼子是UGA，當(dāng)有特殊識別因子存在時，UGA才指導(dǎo)蛋白質(zhì)中SeC的合成，否則只作為終止密碼[19,20]。SeC位于酶的活性部位，具有催化氧化還原的作用。與其他氨基酸相比，直接膳食攝入的SeC不能直接參與硒蛋白的合成，必須經(jīng)過復(fù)雜的合成機(jī)制進(jìn)行重新合成，才能使Sec參與合成硒蛋白，滿足生物體的正常生活需要。所以硒的抗氧化作用主要通過SeC參與構(gòu)成的硒蛋白來實現(xiàn)。SeC大多處在硒蛋白酶活性位點上，使其具有特異的功能特性，對硒蛋白的生理活性具有重要意義。Fomenko·D·E等[21]研究發(fā)現(xiàn)在同源序列中搜索Cys-SeC可以選擇性地識別具有催化氧化還原活性殘基的蛋白質(zhì)，不僅可以過濾出非功能性Cys（半胱氨酸），而且過濾出不具有催化氧化還原功能的保守Cys，可以確定大多數(shù)已知的使用催化氧化還原活性Cys的家族。Gómez-Jacinto V等人[22]的研究結(jié)果表明，可以運用微生物轉(zhuǎn)化法通過富硒小球藻將培養(yǎng)基中亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。微生物轉(zhuǎn)化法因成本和技術(shù)難度低而應(yīng)用廣泛。何家偉等人[23]發(fā)現(xiàn)也可運用化學(xué)法將氯丙氨酸和二硒化鈉反應(yīng)生成硒代胱氨酸后于液氨中將硒代胱氨酸還原裂解為硒代半胱氨酸[24]。但該方法需要在超低溫及用到活潑金屬鈉的條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件苛刻而難以投入大規(guī)模的生產(chǎn)中。

丁穎等人[25]設(shè)計合成了一種能識別硒醇的熒光探針分子O-hNRSel，其靈敏度高、選擇性好，能有效定位到硒蛋白的活性位點，即硒代半胱氨酸，有效提高了活細(xì)胞中硒代半胱氨酸的檢測效率。Hand D等人[26]運用了紫外處理-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法檢測不同硒濃度下烤煙中以SeC為主的有機(jī)硒和無機(jī)硒的比例，并以此判斷煙草的生長情況。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硒濃度為2.2mg/kg～11.1mg/kg處理煙草葉時可檢測出硒代半胱氨酸及部分有機(jī)硒，適當(dāng)?shù)卮龠M(jìn)了煙草的生長及其抗氧化能力；而當(dāng)硒濃度為22.2mg/kg時僅可檢測出無機(jī)硒，過量的無機(jī)硒將破壞活性氧（ROS）平衡并提高煙草中MDA含量，抑制了煙草的生長及其抗氧化能力。Xia Q等人[27]運用實時熒光定量PCR分析富硒茶樹中成熟茶葉和茶樹嫩根中甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的ATP硫酸化酶（APS）和硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SMT）的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)富硒茶葉中APS和SMT的表達(dá)均低于普通茶葉，而嫩根中的APS和SMT均高于普通茶樹根幾倍，表明茶葉中硒蛋白的存在影響著某些基因的表達(dá)水平。

3.3 硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）

硒代蛋氨酸可以借助腸道細(xì)菌蛋氨酸酶的催化釋放硒化物。SeMet是谷物、豆類中主要的硒化物，是動物體內(nèi)第21個氨基酸，是硒代半胱氨酸（SeC）的主要前體[28]?？梢苑翘禺愋缘靥娲琢虬彼釟埢⒋嬖谟诘鞍追肿又衃29]，SeMet在體內(nèi)可通過胱硫醚γ裂解酶降解為甲基硒醇，通過甲基化作用后轉(zhuǎn)化為二甲基硒化物或三甲基硒化物，然后通過去甲基化轉(zhuǎn)化為硒化物，最終參與硒蛋白的合成過程。孫協(xié)平等人[30]發(fā)現(xiàn)SeMet與土壤中氮的吸收轉(zhuǎn)運存在密切關(guān)系，農(nóng)作物對SeMet的吸收主要是依賴于氫離子與NRT1.1B的運輸，當(dāng)土壤中的氮元素與硒等微量元素發(fā)生耦合互作時，會產(chǎn)生氮肥，提高了土壤中SeMet的利用效率及作物的產(chǎn)量。

章發(fā)盛等人[31]運用了高效液相色譜-原子熒光光譜法對茶葉中硒的賦存形態(tài)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在無紫外線消解情況下難以對硒形態(tài)進(jìn)行分離，將該方法進(jìn)行優(yōu)化后得出連續(xù)進(jìn)樣7次相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于4%的結(jié)果，且硒的回收率在81.47%～119.30%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，在用純水浸提法和鹽酸提取法進(jìn)行前處理時都無法檢測出峰值，但運用甲醇提取法能測得茶葉樣品中含有硒代蛋氨酸6.25μg/L，且硒代蛋氨酸占總硒含量的1.3%，所以該優(yōu)化后的方法只適用于高硒含量樣品，否則難以測出硒代蛋氨酸。

3.4 硒蛋白P（selenoprotein PP1,SePP1）

人體中的硒蛋白P含有366個氨基酸的糖化蛋白，大約三分之二的分子被折疊成包含一個硒代半胱氨酸基的N端結(jié)構(gòu)域，而較小的C端結(jié)構(gòu)域含9個SeC[32]，這使得人體中的硒蛋白P具有運輸硒的功能[33]，影響著人體內(nèi)硒的代謝分布和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。此外硒蛋白P還具有高效的抗氧化能力，通過表達(dá)該硒蛋白可以有效減少細(xì)胞對氧化氫攻擊的敏感性[34]。Saito Y等人[35]發(fā)現(xiàn)純化后的SeP可以有效促進(jìn)和支持神經(jīng)元的存活，比無機(jī)硒的效率更高。Shintaro等人[36]通過對C57BL/6J小鼠肝臟中肝細(xì)胞因子和肝臟來源的分泌蛋白的觀察發(fā)現(xiàn)，綠茶提取物能有效減少高脂肪飲食引起的硒蛋白P產(chǎn)生水平的增加，從而間接減少肥胖、高血壓、胰島素反抗等部分會引起全身不良反應(yīng)發(fā)生的情況。在此可看出，茶葉中的硒蛋白P不僅能有效促進(jìn)人體的神經(jīng)元活躍，而且能與茶葉中的其他物質(zhì)反應(yīng)而不對人體產(chǎn)生過激的作用。

Ying等人[37]在考察單獨或聯(lián)合使用巴西堅果和綠茶提取物（GTE）膠囊補充對靶向生物標(biāo)記物的影響中發(fā)現(xiàn)單獨或聯(lián)合使用GTE的受試者血漿中硒水平及直腸硒蛋白P均呈現(xiàn)上升趨勢，表明茶葉有助于提高人體內(nèi)硒蛋白水平，有效降低結(jié)直腸癌發(fā)生的概率。

4 結(jié)論

富硒茶葉中硒蛋白的種類繁多，對人類的健康有著或好或壞的不同程度的影響，所以仍然需要更多的實驗和研究了解清楚硒蛋白的營養(yǎng)功能。硒蛋白在人體內(nèi)起著不可或缺的重要作用，盡管目前發(fā)現(xiàn)了茶葉中硒蛋白具有抗癌癥、抗過氧化、增強免疫力、延緩衰老等的營養(yǎng)功能，但隨著人們生活水平的不斷提高，對硒蛋白的需要也會越來越高，所以繼續(xù)發(fā)現(xiàn)和研究硒蛋白的營養(yǎng)功能具有重要意義，對科學(xué)且合理地利用硒蛋白預(yù)防、治療人類疾病具有重要作用。