何秀燕，魏 琴,2，趙 鑫

（1.宜賓學院農(nóng)林與食品工程學部，四川宜賓 644000；2.四川省油樟工程技術研究中心，四川宜賓 644000）

油樟（Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao ex H.W.Li）是樟科樟屬常綠喬木，為亞熱帶地區(qū)特有樹種[1]，具有很高的經(jīng)濟價值和生態(tài)意義.油樟在宜賓栽培面積大，宜賓素有“油樟王國”的美譽[2-4].油樟葉片利用水蒸氣蒸餾法可得油樟精油，種子經(jīng)壓榨亦可得精油（可用作工廠制香皂、潤滑油等）.油樟精油富含多種植物次生代謝物，化學成分大約100余種.油樟精油1,8-桉葉素成分可達50%～60%，該成分具有抗菌消炎[5]、疏風解熱、祛濕解毒、殺蟲的作用[6,7]，廣泛應用于醫(yī)療和化工方面.

植物不同部位影響外植體愈傷組織的產(chǎn)生[8].樟科樟屬植物龍腦樟組織培養(yǎng)及愈傷組織誘導研究較多.龍腦樟嫩枝通過適宜的培養(yǎng)基可以誘導出愈傷組織，且能夠提取出右旋龍腦[9].通過對龍腦樟腋芽誘導，獲得無菌苗及愈傷組織[10].不同的培養(yǎng)基激素濃度與配比，影響龍腦樟莖段誘導出芽或愈傷組織[11].通過植物組織培養(yǎng)技術對植物原生質體進行細胞懸浮培養(yǎng)[12]，細胞懸浮可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，應用于生物制品的研發(fā)與開發(fā)等[13].植物細胞懸浮培養(yǎng)是將固體培養(yǎng)基上質地疏松、生長旺盛的植物愈傷組織轉移至液體培養(yǎng)基，以獲取大量均一的植物細胞培養(yǎng)物[14].培養(yǎng)材料、培養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件和方式等因素影響林木懸浮體系的建立[15].目前，油樟組織培養(yǎng)研究主要集中在培養(yǎng)基成分、激素種類及濃度等方面.培養(yǎng)基中蔗糖濃度、瓊脂含量、細胞分裂素含量等因素對油樟試管苗玻璃化有明顯影響[16].培養(yǎng)基中無機鹽濃度、抗生素含量及光照處理對油樟愈傷組織生長具有明顯影響[17].為進一步提升油樟組培擴繁水平，消毒劑、基本培養(yǎng)基、激素等因素被廣泛研究[18].不同培養(yǎng)基及不同激素種類對油樟懸浮細胞的生長及其次生代謝產(chǎn)物有著顯著的影響[19].樟屬植物葉水浸提液對油樟懸浮細胞生長無明顯影響，但對懸浮細胞揮發(fā)性物質積累有一定的影響[20].影響植物愈傷組織及懸浮細胞生長的因素很多，基本培養(yǎng)基、外植體類型、激素濃度、光照、pH值和碳含量如何影響油樟愈傷組織產(chǎn)生及細胞懸浮培養(yǎng)目前尚無明確研究.因此，本研究以油樟一年生幼嫩枝條莖段、葉片為材料，結合不同培養(yǎng)基、不同6-BA濃度篩選出適宜愈傷組織誘導的外植體和基本培養(yǎng)基；進一步分析NAA濃度、蔗糖含量、pH值、光照等環(huán)境條件對油樟懸浮細胞生長及其代謝產(chǎn)物的影響，篩選出適宜的油樟愈傷組織誘導體系，同時建立油樟細胞懸浮培養(yǎng)體系，可為進一步研究油樟細胞懸浮培養(yǎng)、進一步工業(yè)化提取油樟次生代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)與研究基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

分別選取當年生油樟功能葉片、一年生幼嫩莖段（圖1）為外植體進行誘導愈傷組織.

圖1 油樟外植體

1.2實驗方法

（1）誘導油樟愈傷組織最佳外植體、培養(yǎng)基及激素濃度的篩選.將外植體分別接種到B5（NAA 0.01mg/L，6-BA 2mg/L）和MS（NAA 0.01mg/L，6-BA 2mg/L）固體培養(yǎng)基中，每個處理30瓶，重復3次.培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照（1000～2000）Lx，光照時間16 h/d，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計外植體愈傷組織誘導率及污染率，篩選出適宜誘導愈傷組織的外植體材料及適宜外植體生長的初代培養(yǎng)基：

將篩選出的最適外植體接種于初代培養(yǎng)基，設置三個6-BA激素濃度梯度：0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L.每組接種30瓶，重復3次.培養(yǎng)30 d后記錄愈傷組織生長情況，統(tǒng)計其誘導率，篩選出誘導愈傷組織最佳的激素濃度.

（2）油樟懸浮細胞培養(yǎng)最佳NAA濃度篩選.將油樟愈傷組織轉接于B5+6-BA（4.0mg/L）液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)（轉速110 r/min，溫度25±2℃，pH值5.8）.設 置3個NAA濃 度 梯 度：0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L.每組設置6個重復，每5 d觀察一次，記錄細胞懸浮生長狀態(tài).

（3）油樟細胞懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)化.以B5+6-BA（4.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）為基本培養(yǎng)基，分別改變油樟懸浮細胞培養(yǎng)基中糖含量、pH值、光照.蔗糖含量設置三個處理：0 g/L、20 g/L、40 g/L；pH值設置3個處理：6.0、6.8、7.2；光照設置兩個處理：光照（2000 Lx）、黑暗(0 Lx).每個處理6個重復，培養(yǎng)條件：轉速110 r/min，溫度25±2℃.每5 d觀察一次，記錄其生長狀態(tài)，并用紫外分光光度計測定每次的總酚、類黃酮和總抗氧化的吸光值，以及用電子天平測定其干重和鮮重.

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析和顯著性分析（p＜0.05）.

2 結果與分析

2.1 油樟愈傷組織誘導及懸浮培養(yǎng)

2.1.1 誘導油樟愈傷組織最佳外植體、培養(yǎng)基及6-BA濃度

將油樟葉片及枝條分別接種于B5、MS培養(yǎng)基，分析培養(yǎng)基對油樟不同外植體誘導愈傷組織的影響.相同培養(yǎng)基條件下，油樟莖段愈傷組織出愈率顯著高于葉片，葉片玻璃化嚴重（圖2），因此幼嫩莖段適宜誘導愈傷組織.B5培養(yǎng)基誘導的愈傷組織結構疏松，顏色呈淡黃色，更適宜細胞懸浮培養(yǎng).MS培養(yǎng)基誘導的愈傷組織質地致密，顏色呈淺綠色，不利于細胞懸浮培養(yǎng)（圖2）.B5培養(yǎng)基外植體污染率顯著低于MS（表1）.因此，將油樟幼嫩枝條接種于B5培養(yǎng)基有利于愈傷組織誘導，且污染率低.

圖2 不同培養(yǎng)基誘導油樟愈傷組織

表1 不同培養(yǎng)基和外植體出愈率及污染率

以油樟一年生幼嫩枝條為外植體，B5為基本培養(yǎng)基，分別設置6-BA三個濃度梯度，分析6-BA濃度對油樟愈傷組織形成的影響，發(fā)現(xiàn)4.0 mg/L處理下外植體易形成愈傷組織，結構疏松適于懸浮培養(yǎng)，顏色呈淡黃色（圖3C），且污染率顯著低于其他處理（表2）.在0 mg/L處理外植體正常生長，切口處褐化，但愈傷組織誘導率低（圖3A），出愈率僅為6.7%，且污染率高達66.7%（表2）.2.0 mg/L 6-BA處理外植體雖能產(chǎn)生愈傷組織，但愈傷組織結構緊密、質地堅硬，不易進行懸浮培養(yǎng)（圖3B）.

圖3 不同濃度的6-BA誘導油樟愈傷組織的影響

表2 不同濃度6-BA對出愈率及污染率的影響Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA on recovery rate and pollution rate

2.1.2 油樟懸浮培養(yǎng)最佳NAA濃度的篩選

將繼代培養(yǎng)的油樟愈傷組織轉接于不同濃度NAA的B5液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，分析NAA濃度對油樟細胞懸浮培養(yǎng)的影響.實驗表明，0 mg/L NAA濃度下無明顯細胞增殖（圖4A），0.5 mg/L NAA濃度下懸浮細胞生物積累量大，但易褐化（圖4B）.1.0 mg/L NAA濃度下懸浮細胞增殖較快，生物積累量大，生長狀態(tài)較好且細胞分散程度較均勻（圖4C）.通過觀察懸浮培養(yǎng)液，油樟懸浮細胞呈橢圓形或球形，F(xiàn)DA染色后懸浮細胞表現(xiàn)出熒光強度高且熒光分布均勻，細胞活性強（圖5）.因此1.0 mg/L NAA的生長素濃度更適合油樟細胞的懸浮培養(yǎng).

圖4 不同的NAA對油樟懸浮培養(yǎng)的影響

圖5 油樟懸浮細胞

2.2 油樟細胞懸浮培養(yǎng)體系優(yōu)化

2.2.1 蔗糖含量對油樟懸浮細胞的影響

為了進一步優(yōu)化油樟懸浮培養(yǎng)體系，在B5+6-BA（4.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）培養(yǎng)基中設置不同蔗糖濃度，分析不同蔗糖對油樟懸浮細胞生長的影響.發(fā)現(xiàn)在蔗糖濃度為40 g/L處理下油樟懸浮細胞鮮重高于低濃度處理，干重在第15天時顯著高于其他處理（圖6A、B）.隨著蔗糖濃度增大，其總酚含量、類黃酮含量及抗氧化能力越高，蔗糖濃度為40 g/L時，其總酚、類黃酮含量及總抗氧化能力顯著高于其他處理（圖6C、D、E）.

圖6 培養(yǎng)基碳含量對油樟懸浮細胞的影響

2.2.2 pH值對油樟懸浮細胞的影響

在B5+6-BA（4.0mg/L）+NAA（1.0mg/L）培養(yǎng)基中設置不同pH，分析pH對油樟懸浮細胞生長的影響.在pH值為6.0，培養(yǎng)10 d時，細胞鮮重達到峰值后逐漸下降且WPA（鮮重0.2443 g）＞W(wǎng)PB（鮮重0.2104 g）＞W(wǎng)PC（鮮重0.1344 g）（圖7A）.而在pH6.0處理下第15 d時干重達到最大值，高于其他處理（圖7B）.隨著培養(yǎng)基pH的增加，懸浮細胞總酚、類黃酮及總抗氧化活性反而降低，pH為6.0時總酚、類黃酮及總抗氧化能力顯著高于其他處理（圖7C、D、E）.

圖7 pH對油樟懸浮細胞的影響

2.2.3光照對油樟懸浮細胞的影響

以B5+6-BA（4.0 mg/L）+NAA（1.0 mg/L）為培養(yǎng)基，分別設置光照和黑暗兩種培養(yǎng)條件，分析光照對油樟懸浮細胞的影響.實驗表明，油樟懸浮細胞干鮮重受光照影響明顯，暗培養(yǎng)細胞鮮重高于光照培養(yǎng)（圖8A）.除第5、15天，暗培養(yǎng)下細胞干重顯著高于光培養(yǎng)（圖8B）.暗培養(yǎng)總酚、類黃酮及總抗氧化能力顯著高于光培養(yǎng)（圖8C、D、E），懸浮細胞類黃酮含量在暗培養(yǎng)下比光培養(yǎng)高0.1556μg/ml（圖8D）.

圖8 光照對油樟懸浮細胞的影響

3 討論及結論

植物懸浮細胞培養(yǎng)所需要的愈傷組織應生長旺盛且質地疏松，同時具有較高的次生代謝產(chǎn)物.植物不同組織、培養(yǎng)基、激素等因素影響植物愈傷組織的生長.油樟組培中，兩年生莖段比當年生莖段易玻璃化，污染率高[16].植物不同組織、不同器官愈傷組織誘導率不同，桂花花梗愈傷組織誘導率比花瓣高[21]，葡萄帶芽莖段相比葉片和卷須更易誘導出愈傷組織[22].本研究中以油樟一年生莖段與葉片為外植體，相同條件培養(yǎng)后莖段愈傷組織誘導率高于葉片，葉片在誘導過程中玻璃化嚴重.激素對植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響比誘導愈傷組織更大，外源激素的合理濃度是誘導懸浮細胞增殖的關鍵[23].生長素NAA濃度高時，誘導出淡黃色且疏松的愈傷組織[24].本研究中較高濃度的NAA（1.0 mg/L）懸浮細胞增殖較快，生物積累量大，細胞活性強.

不同的培養(yǎng)條件，影響植物懸浮細胞培養(yǎng).培養(yǎng)條件主要包括基本培養(yǎng)基種類、激素種類及濃度、培養(yǎng)基pH值和附加物等.蔗糖作為一種碳源，一般認為較高濃度的蔗糖促進次生代謝物合成，可為呼吸作用提供底物，為細胞新陳代謝提供能量，可以調節(jié)細胞培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓[25]，為代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生提供前體[26]，是植物離體培養(yǎng)不可或缺的一類營養(yǎng)物質.因此，油樟懸浮細胞合成次生代謝產(chǎn)物需要蔗糖提供能量，由實驗結果可知隨著蔗糖濃度增大，其總酚含量、類黃酮含量及抗氧化能力越高，表明培養(yǎng)基中高濃度的蔗糖含量可有效提升次生代謝產(chǎn)物含量.植物懸浮細胞生長受培養(yǎng)基pH的影響.pH除調節(jié)細胞膜透性，還會影響植物細胞的離子通道活性、細胞器完整性等方面[27].pH會對橡膠樹懸浮細胞[28]、馬鈴薯愈傷組織[29]有明顯影響.培養(yǎng)基的pH值對次生代謝物的分泌很重要，植物的細胞培養(yǎng)都要求一定的pH值，研究發(fā)現(xiàn)pH值為5.8～6.5范圍內懸浮培養(yǎng)煙草細胞能獲得最多的生物量和次生代謝產(chǎn)物量[30].由實驗可知油樟細胞懸浮培養(yǎng)的最適pH為6.0，該pH下次生代謝產(chǎn)物量和生物積累量較高.

環(huán)境因素，如光照、溫度、濕度和氣體成分等也能夠影響植物懸浮細胞培養(yǎng).光是植物必需的資源之一，光照對植物生長的直接作用是光能促進細胞的增大和分裂，促進組織和器官的分化，制約器官的生長和發(fā)育速度[31].本研究以光照與黑暗對油樟懸浮細胞進行處理，黑暗處理油樟懸浮細胞總酚、類黃酮及總抗氧化能力顯著高于光培養(yǎng)，進一步證明了黑暗培養(yǎng)有利于油樟懸浮細胞次生代謝產(chǎn)物的生成[19].蛇足石杉共生藍藻細胞只能在較低的光照強度下生存[32].但部分植物，如西洋參細胞有無光照對培養(yǎng)西洋參細胞無差別[33].