楊雪蓮 劉 帥 楊 麗 唐文鑫 代天志 龍曉燕 孫德群

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽 621010；2.山東大學(xué)海洋學(xué)院 山東威海 264200）

白血?。↙eukemia），亦稱作血癌，是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。病原是克隆性白血病細胞出現(xiàn)增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等情況并在骨髓中出現(xiàn)大量增殖，浸潤其他非造血性組織和器官，同時抑制正常造血功能。臨床上將白血病分為急性白血病和慢性白血病，具體分為急性淋巴細胞白血?。ˋLL）、急性髓系白血?。ˋML）、慢性髓系白血?。–ML）、慢性淋巴細胞白血病（CLL），白血病在各年齡段均有發(fā)病風(fēng)險［1］。目前，白血病是兒童癌癥死亡的主要原因，約占所有兒童癌癥的30%［2］，在發(fā)展中國家中，兒童白血病治愈率甚至低于35%［3］。臨床上成人白血病治愈率也不樂觀。這是由于常規(guī)藥物特異性和選擇性較差，沒有明確的白血病預(yù)防和治療效果［4］。因此，迫切需要開發(fā)效果更佳、選擇性更好的新藥。

氮芥屬于一種DNA烷化劑，是細胞毒性類藥物，起源于二戰(zhàn)時期的芥子氣，它可對接觸者造成骨髓和淋巴系統(tǒng)增生低下，有較強的毒副作用。為了將芥子氣運用于臨床，對其進行了不同的結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生了各種類型的氮芥類衍生物［5］。由于氮芥衍生物是基于雙（2-氯乙基）硫化物對白細胞的殺傷作用開發(fā)，因此其最開始主要用于治療白血病［6］。由于氮芥衍生物具有較強的抗增殖活性，臨床上將其廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的化療。比如：最早應(yīng)用于臨床的鹽酸氮芥，主要用于治療惡性淋巴瘤以及慢性白血?。?］；臨床常用的氮芥類藥物環(huán)磷酰胺，具有廣泛抗瘤譜，對惡性淋巴瘤有顯著治療效果，對急性或慢性淋巴細胞白血病以及乳腺癌等也有不錯療效［7］。對氮芥的抗腫瘤機制研究發(fā)現(xiàn)，氮芥可通過與DNA結(jié)合，交聯(lián)兩條鏈，防止DNA復(fù)制并導(dǎo)致細胞最終死亡而發(fā)揮其生物活性。在分子水平上，氮芥類衍生物主要是與DNA雙螺旋中的腺嘌呤或者鳥嘌呤的N7位或腺嘌呤的N3位結(jié)合，使DNA發(fā)生鏈內(nèi)或雙鏈間交聯(lián)［8］，由此刺激了相對的遺傳毒性應(yīng)激反應(yīng)，影響細胞中DNA損傷調(diào)節(jié)反應(yīng)、能量代謝、細胞周期或者細胞凋亡（線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路）等多個信號通路［9］。

由于氮芥類化合物屬于非特異性DNA烷基化，因此對正常細胞毒性極大，給患者帶來許多副作用［10］，這些副作用和耐藥性［11］已成為臨床治療的主要限制因素。為了解決這些問題，藥物化學(xué)家在過去做了很多努力。Hu等［12-14］設(shè)計并合成了各種氮芥與吳茱萸堿雜合體，此類生物堿具有多種抗腫瘤活性，所合成的化合物對HL-60細胞具有優(yōu)良的細胞活性，IC50值為0.5μmol／L。Xiang等［15］合成并評估了一系列與氮芥偶聯(lián)的enmein型二萜類化合物，這一系列化合物表現(xiàn)出一定細胞毒性和選擇性。Wen等［16］描述了具有各種芳香取代基和硼酸酯的新型芳香族氮芥類化合物，這類化合物可有效交聯(lián)DNA。綜上可知，對氮芥進行有效結(jié)構(gòu)修飾，可降低其毒副作用，有利于氮芥類化合物的臨床應(yīng)用。

本文以氮芥為基礎(chǔ)，設(shè)計并合成了氮芥新衍生物，并通過白血病細胞抗增殖活性實驗及一系列熒光染色實驗證明了化合物Y-65體外抗白血病細胞增殖活性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器和試劑

儀器：ICX41系列倒置生物顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；5404低速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SW-CJ-1D型超凈工作臺（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；ReadMax1900型光吸收全波長酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；KG-SX-700型高溫蒸汽滅菌鍋（KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC）；培養(yǎng)箱（SANYO）。

試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基（Biological Industeries）；胎牛血清（Gibco）；青鏈霉素（中國Beyotime研究所）；四甲基噻唑藍（MTT）（中國Beyotime研究所）；胰蛋白酶消化液（中國Beyotime研究所）；PBS（中國Beyotime研究所）；二甲基亞砜（DMSO）（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；超純水（實驗室配制）；線粒體膜電位試劑盒（JC-1）（中國Beyotime研究所）；Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒（中國Beyotime研究所）；Hoechst33258檢測試劑盒（中國Beyotime研究所）；苯丁酸氮芥（安耐吉化學(xué)）；濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、異丁醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

細胞株來源：人慢性髓原白血病細胞系K562、人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞系CCRFCEM、人早幼粒細胞白血病細胞HL-60和人正常肝細胞L02，上海攬寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑配制

DMEM高糖完全培養(yǎng)基配制：在DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)10%FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分數(shù)1%PS（青霉素鏈霉素），配制好的完全培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

DMEM高糖維持培養(yǎng)基配制：在DMED高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)2.5%的FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分數(shù)1%的PS（青霉素鏈霉素），配制好的維持培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

IMDM完全培養(yǎng)基配制：在IMDM（含谷氨酸）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)20%的FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分數(shù)1%的PS（青霉素鏈霉素），配制好的完全培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

IMDM維持培養(yǎng)基配制：在IMDM（含谷氨酸）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)5%的FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分數(shù)1%的PS（青霉素鏈霉素），配制好的維持培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

RPMI-1640完全培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基的配制方法與DMEM配制方法相同。

MTT溶液配制：稱取500 mg四甲基噻唑藍（MTT）倒入滅菌后的玻璃瓶中，加入100 mL PBS（磷酸緩沖液）溶解，再用0.22μm無菌濾膜過濾，得到的MTT溶液用2 mL EP管分裝置于-20℃冰箱中避光保存。

三聯(lián)裂解液配制：稱取10 g SDS（十二烷基硫酸鈉），量取10 mol／L HCl 0.1 mL、異丁醇5 mL，用雙蒸水溶解并定容至100 mL，再用0.22μm濾膜過濾，最后進行高壓蒸汽滅菌，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氮芥新衍生物結(jié)構(gòu)式

氮芥新衍生物為西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院合成實驗室設(shè)計合成［17］，并經(jīng)氫譜、碳譜、高分辨質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)式。

化合物Y-65

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ8.94（s，1H），8.49（s，1H），7.40～7.06（m，4H），6.81～6.61（m，3H），3.85～3.58（m，8H）。13C NMR（126 MHz，DMSO-d6）164.11，163.98，162.19，162.06，152.90，143.29，142.70，129.66，121.55，112.94，101.26，101.20，101.08，101.02，97.00，96.79，96.58，52.87，41.70。HRMS（ESI）m／z：［C17H17Cl2F2N3OH＋］388.0790（計算值），388.0793（實驗值）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞系、CCRF-CEM和K562細胞系、L02細胞系分別使用IMDM完全培養(yǎng)基、RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述細胞系均在37℃恒溫，體積分數(shù)5%CO2的飽和濕度的無菌細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d更換一次細胞液，培養(yǎng)4 d進行細胞傳代。

2.2 MTT比色法檢測細胞抑制率

貼壁細胞［17］：將對數(shù)生長期細胞接種到96孔板，每孔100μL細胞懸液，待細胞貼壁后，分別加入各濃度化合物Y-65，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，對照組為不加藥維持培養(yǎng)基，陽性對照藥為苯丁酸氮芥（CLB）。將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后每孔加入100μL MTT工作液（0.5 mg／mL）。培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄工作液，再向每孔加入100μL DMSO溶解10 min后，檢測490 nm吸光度，計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）＝（1-OD實驗組／OD對照組）×100%。IC50值利用GraphPad Prism 8分析得出。

懸浮細胞：采用三聯(lián)法［17］檢測570 nm波長處的吸光度，抑制率計算和IC50值分析同貼壁細胞的計算分析方法。

2.3 白血病細胞在化合物的不同濃度和不同處理時間下的抑制活性

（1）鋪板。同2.2，濃度為0，0.05，0.10，0.50，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0μmol／L。

（2）檢測。將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72 h后，然后用三聯(lián)法在570 nm處檢測其吸光度，根據(jù)公式計算其抑制率，用軟件GraphPad Prism 8繪制CCRF-CEM細胞經(jīng)化合物Y-65不同濃度和不同處理時間下的抑制活性曲線圖。

2.4 化合物對白血病細胞形態(tài)的影響

（1）接種細胞。用RPMI-1640維持細胞液將對數(shù)生長期CCRF-CEM細胞制成適當(dāng)細胞數(shù)量的細胞懸液，然后用此細胞懸液，稀釋藥物為0，3.0，6.0，10.0，20.0，30.0μmol／L，然后將各濃度細胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（2）觀察。約24 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并用ImageView軟件進行拍照。

2.5 Hoechst33258染色下細胞核形態(tài)變化

接種細胞同2.4節(jié)，24 h后，4 min，1 000 g離心收集細胞，加入試劑盒中固定液，孵育30 min；離心，每個濃度組細胞沉淀用PBS洗滌兩遍；離心，留50μL PBS，將細胞混懸，然后滴在載玻片上，待細胞貼在載玻片上后，滴加0.2 mL Hoechst33258染液，避光染色2 min；從邊緣吸掉染色液，用PBS洗滌兩遍，在熒光顯微鏡下進行核形態(tài)觀察，并拍照記錄。

2.6 Annexin V-FITC和PI染色下不同階段的細胞凋亡

接種細胞同2.4節(jié)，離心，收集細胞，用PBS洗滌；離心，將細胞在195μL結(jié)合液中重懸，再依次加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色工作液，混勻，25℃避光孵育20 min后在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，此過程盡量避光進行。

2.7 JC-1染色下細胞線粒體膜電位的變化

接種細胞同2.4節(jié)，離心，將細胞重懸于0.5 mL細胞液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液混勻后，在培養(yǎng)箱中孵育20 min，孵育結(jié)束后，稱量600 g，4℃離心，再用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩遍；離心，用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，使用熒光光度計對熒光強度進行定量，此過程盡量避光進行。

3 實驗結(jié)果討論

3.1 化合物Y-65對3種白血病細胞系的抗腫瘤活性

據(jù)表1可知，化合物Y-65對3株白血病細胞均有較好抗增殖活性，特別是對CCRF-CEM細胞株增殖抑制作用顯著，其IC50值為4.3±0.3μmol／L。同時發(fā)現(xiàn)化合物Y-65對HL-60白血病細胞活性（IC50值12.4±6.2μmol／L）高于CLB（IC50值34.4±2.7μmol／L［17］）；除此之外更值得注意的是，化合物Y-65對K562細胞系抗增殖活性（IC50值25.9±1.7μmol／L）明顯優(yōu)于CLB（IC50值＞100μmol／L），顯著提高了氮芥對人慢性髓原白血病細胞系抗增殖活性?？梢?，氮芥新衍生物（化合物Y-65）對3株白血病細胞均有較好抗增殖作用，且研究發(fā)現(xiàn)其對急性白血病細胞（CCRF-CEM，HL-60）的抗增殖作用（IC50值4.3±0.3，12.4±6.2μmol／L）明顯優(yōu)于對慢性白血病細胞（K562）的抗增殖作用（IC50值25.9±1.7μmol／L）。由于化合物Y-65對3株白血病細胞均有較好抗增殖活性，可進一步研究其作用機制。

通過選擇性指數(shù)分析可確定化合物Y-65作用于哪一株白血病細胞更值得進行機制研究。根據(jù)表1數(shù)據(jù)，化合物Y-65對CCRF-CEM細胞的最大選擇性指數(shù)為1.3，高于化合物Y-65對HL-60細胞的最大選擇性指數(shù)0.5，因此，選擇化合物Y-65作用于CCRF-CEM抗白血病細胞活性機制研究。

表1 氮芥新衍生物對3種白血病的抑制活性以及選擇性指數(shù)（x±SD，n＝3）Table 1 Inhibitory activity and selectivity index of new nitrogen mustard derivatives on three kinds of leukemia

3.2 化合物濃度、作用時間與化合物抗細胞增殖活性的關(guān)系

圖1表明，化合物Y-65濃度越高，作用時間越久，對白血病細胞抗增殖活性越好。通過比較24，48 h時間濃度抑制曲線，我們發(fā)現(xiàn)只有24 h和48 h抗白血病活性表現(xiàn)出時間依賴，而48 h抑制曲線很接近72 h，推測可能是由于化合物Y-65處理細胞48 h后，CCRF-CEM細胞對化合物Y-65敏感性下降所致。

圖1 化合物Y-65在不同濃度和不同時間對CCRF-CEM細胞的增值抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of compound Y-65 on proliferation of CCRF-CEM cells at different concentrations and different time

3.3 化合物Y-65對白血病細胞形態(tài)的影響

細胞凋亡呈現(xiàn)出的形態(tài)學(xué)變化主要包括細胞皺縮、染色質(zhì)凝集、形成凋亡小體、細胞骨架解散等，可以通過觀察白血病細胞外觀變化來初步判斷化合物Y-65對細胞的作用情況。圖2顯示，CCRF-CEM細胞經(jīng)化合物Y-65作用后發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)變化。從第一張圖（0μmol／L）可知，未進行化合物處理CCRF-CEM細胞飽滿、圓潤，并且大小較為均勻；從后6張圖（3～40μmol／L）可知，隨著化合物濃度增加，細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了變化，細胞開始皺縮，細胞膜出現(xiàn)破損，這種變化表明細胞骨架崩解，細胞逐漸凋亡；且隨著化合物Y-65濃度增加，細胞凋亡增多，且細胞大小無法保持均勻。據(jù)此可知，氮芥新衍生物（化合物Y-65）對CCRF-CEM細胞毒性作用顯著，且隨著濃度遞增，毒性作用隨之遞增。

圖2 化合物Y-65作用后CCRF-CEM細胞形態(tài)圖Fig.2 Morphology of CCRF-CEM cells treated with compound Y-65

3.4 Hoechst33258染色下的白血病細胞核形態(tài)變化

為確定化合物Y-65對CCRF-CEM細胞抗增殖活性是否與其誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)，進行了Hoechst33258實驗。經(jīng)Hoechst33258染色后，正常未凋亡細胞呈現(xiàn)淺藍色熒光；凋亡細胞由于染色質(zhì)凝集，細胞核會呈現(xiàn)致密濃染，出現(xiàn)深藍色熒光。圖3顯示，未經(jīng)化合物Y-65作用的CCRF-CEM細胞染色后呈現(xiàn)淺藍色，未出現(xiàn)由于染色質(zhì)凝集產(chǎn)生的深藍色熒光（0μmol／L）。圖3中后5張圖（3～30 μmol／L）顯示，經(jīng)過化合物Y-65作用的CCRFCEM細胞，由于化合物誘導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致細胞核中染色質(zhì)凝集，經(jīng)染色后細胞核出現(xiàn)致密濃染，產(chǎn)生深藍色熒光，且隨著化合物濃度加大，細胞凋亡數(shù)量增加，導(dǎo)致深藍色熒光量增加。當(dāng)化合物濃度增加到30μmol／L時，細胞幾乎全部凋亡。由此可知氮芥新衍生物（化合物Y-65）是以濃度依賴方式誘導(dǎo)白血病細胞（CCRF-CEM）凋亡。

圖3 Hoechst33258染色CCRF-CEM細胞的顯微圖像Fig.3 Microscopic image of CCRF-CEM cells after Hoechst33258 staining

3.5 Annexin V-FITC和PI兩種染色下不同階段的細胞凋亡

為進一步評價化合物Y-65抗白血病活性是否與細胞凋亡有關(guān)，采用Annexin V-FITC和PI染色實驗來確定化合物Y-65能否誘導(dǎo)細胞凋亡。Annexin V-FITC用綠色熒光探針FITC標(biāo)記Annexin V，根據(jù)Annexin V-FITC與細胞中的磷脂酸酰絲氨酸結(jié)合情況，可以直接檢測到磷脂酰絲氨酸外翻情況，從而測定出細胞凋亡狀態(tài)。碘化丙啶可以對壞死的細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞進行染色，呈現(xiàn)紅色熒光。圖4顯示，當(dāng)化合物濃度為0μmol／L時，有極少數(shù)細胞出現(xiàn)凋亡或者壞死；當(dāng)化合物濃度增加時（從3～30μmol／L），凋亡早期細胞數(shù)量增加同時，凋亡晚期或者壞死細胞數(shù)量也隨之增加。同時發(fā)現(xiàn)隨著化合物濃度增加，凋亡晚期或者壞死細胞數(shù)量增加比凋亡早期細胞數(shù)量增加更多。由此可知，隨著化合物Y-65濃度增加凋亡細胞總數(shù)增加，且化合物濃度增加可能更易誘導(dǎo)細胞發(fā)生晚期凋亡，具體機制有待進一步研究。此實驗結(jié)果表明，化合物Y-65可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡或者壞死，產(chǎn)生對白血病細胞的抗增殖活性。

圖4 Annexin V-FITC和PI染色CCR-CEM細胞的顯微圖像Fig.4 Microscopic images of CCRE-CEM cells after annexin V-FITCand PI staining

3.6 JC-1染色下細胞線粒體膜電位的變化

線粒體是細胞內(nèi)參與多種信號通路和功能的細胞器，在確定細胞存活與死亡中起著關(guān)鍵作用［20］。線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期一個標(biāo)志性事件。為了驗證化合物Y-65是否通過線粒體通路導(dǎo)致細胞凋亡，進行了線粒體膜電位（JC-1）染色實驗。在正常細胞中，線粒體膜電位較高，此時JC-1染料是聚合體可以產(chǎn)生紅色熒光；在早期凋亡細胞中，線粒體膜電位較低，此時JC-1染料是單體可以產(chǎn)生綠色熒光。圖5顯示，當(dāng)未用化合物作用時，只有極少數(shù)細胞凋亡，此時大多數(shù)細胞線粒體膜電位較高，染色后呈現(xiàn)紅色熒光。當(dāng)化合物濃度為3μmol／L時，部分細胞出現(xiàn)凋亡，凋亡細胞線粒體膜電位下降，染色后呈現(xiàn)綠色熒光，但還是有不少細胞未凋亡，當(dāng)加大化合物濃度后，凋亡細胞數(shù)量隨之增加，當(dāng)化合物濃度達到30μmol／L時，絕大多數(shù)細胞已經(jīng)凋亡，綠色熒光量達到最大。由圖6（a）、圖6（b）可知，由于化合物濃度增加，細胞凋亡增加，染色后綠色單體熒光強度增加，紅色聚合物熒光強度降低。從圖6（c）可知，綠色單體熒光強度／紅色聚合物熒光強度的去極化隨著濃度增加而遞增，說明化合物Y-65對細胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生顯著影響，并呈現(xiàn)濃度依賴性效應(yīng)。通過線粒體膜電位（JC-1）染色實驗證明化合物Y-65對CCRF-CEM細胞抗增殖活性可能是通過線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑。

圖5 線粒體膜電位（JC-1）染色CCRE-CEM細胞的顯微圖像Fig.5 Microscopic image of CCRE-CEM cells after mitochondrial membrane potential（JC-1）staining

圖6 線粒體膜電位熒光光譜及去極化統(tǒng)計圖Fig.6 Statistical diagrams of fluorescence spectrum of mitochondrial membrane potential and depolarization

4 結(jié)論

設(shè)計合成的氮芥新衍生物Y-65對CCRFCEM，K562細胞的IC50值分別為4.3±0.3，25.9±1.7 μmol／L，明顯優(yōu)于苯丁酸氮芥對CCRF-CEM，K562的抗增殖活性（IC50值分別為17.7±0.1，＞100μmol／L）。對化合物Y-65抗腫瘤機制初步研究表明，其可誘導(dǎo)白血病細胞CCRF-CEM發(fā)生細胞凋亡，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，且通過降低線粒體膜電位來誘導(dǎo)細胞凋亡。由于缺少對不同階段細胞凋亡的定量研究，本課題無法準(zhǔn)確判斷化合物Y-65能否誘導(dǎo)白血病細胞發(fā)生晚期凋亡，其作用機制也有待進一步研究。