蔣菱玉，楊 燕，王振南* 呂慎金*

（1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2 .臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 臨沂）

羊人工授精是通過人為采精后將優(yōu)質(zhì)的公羊精液輸入母羊體內(nèi)達(dá)到配種繁殖的一種先進(jìn)實用型技術(shù)。人工授精可以提高優(yōu)質(zhì)公羊種質(zhì)資源的利用率、減少精液的浪費、加速繁殖改良，促進(jìn)育種工作的進(jìn)程，培養(yǎng)出優(yōu)良新品種；便于規(guī)?；驁黾泄芾?，提高飼養(yǎng)管理效率，降低大規(guī)模的飼養(yǎng)成本；同期發(fā)情、授精、妊娠和產(chǎn)犢，提高母畜的受胎率和飼養(yǎng)管理效率；同時公母畜無交集，防止生殖道傳染病的傳播；此外，人工授精技術(shù)能克服由于時間、地區(qū)限制及個體差異等問題，進(jìn)行跨區(qū)域、跨時間配種、雜交，擴(kuò)展家畜配種地區(qū)的范圍，是一項十分重要的技術(shù)。本文將從人工授精所需的物品、采精前的準(zhǔn)備、采精、精液品質(zhì)檢查、精液的稀釋和保存、發(fā)情鑒定、輸精、后期管理以及人工授精的注意事項和意義進(jìn)行概括分析，旨在羊生產(chǎn)繁育方面上推廣利用人工授精技術(shù)提供一定的參考。

1 羊人工授精所需設(shè)備和物品

1.1 實驗室所需設(shè)備和物品

玻璃棒、載玻片、蓋玻片、廣口瓶、托盤、放栓槍、液氮罐、采精架、采精器、集精杯、水浴鍋、溫度計、顯微鏡、移液槍、保定架、超聲波清洗機、高壓消毒鍋、干烤箱等。

1.2 輸精時所需物品

恒溫保溫箱（便攜式）、陰道輸精槍、子宮角輸精槍、腹腔內(nèi)窺鏡全套（包括內(nèi)窺鏡、穿刺套針、光源等）、手術(shù)車、B型超聲診斷系統(tǒng)（主機、腹部探頭）、限位柵欄、0.1 % 高錳酸鉀消毒水、毛巾、衛(wèi)生抽紙、記號蠟筆、隨身筆記本及筆。

2 采精前準(zhǔn)備

2.1 公羊的準(zhǔn)備

配種之前由專業(yè)人員選擇優(yōu)質(zhì)的種公羊進(jìn)行飼養(yǎng)管理，負(fù)責(zé)保證良好的生活環(huán)境和飼料營養(yǎng)的均衡搭配，并每天對其進(jìn)行身體狀態(tài)檢查和進(jìn)食情況記錄。根據(jù)前 1 d檢查情況及需復(fù)配母羊的品種，選擇性欲旺盛、精子活力強、繁殖力強的合適的公羊品種[1]。

種公羊要定期進(jìn)行采精，第一次采精時應(yīng)提前進(jìn)行訓(xùn)練，如讓其觀看其他羊的交配活動，訓(xùn)練成功后才能進(jìn)行采精操作。

2.2 器械的準(zhǔn)備

采精、輸精以及所有接觸精液的儀器、器械都要進(jìn)行清洗、消毒、烘干存放于消毒柜內(nèi)備用。玻璃棒、集精杯等玻璃器皿洗凈后在 160 ℃環(huán)境下進(jìn)行30 min的蒸氣消毒，不耐高溫的可用紫外線消毒，消毒后放在無菌環(huán)境中保存，下次使用前用生理鹽水反復(fù)沖洗。金屬制品用2 % 的NaHCO3溶液清洗，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，擦干后用75 % 的酒精消毒，使用前用生理鹽水沖洗[1]。

3 公羊采精技術(shù)

3.1 采精頻率

采精頻率視種公羊的年齡和體況確定。身體狀況良好、體質(zhì)健壯的成年種公羊每日可采精 2次，體質(zhì)稍差的或年齡較小的公羊可適當(dāng)減少至1次/d，連續(xù)采精 3 d后間隔 1 d，使公羊得到休息。第一次采精的羊可1次/d或隔1日1次[2]。

3.2 采精方法

提前做好個人衛(wèi)生清潔，同時對假陰道和接觸精液的器皿等進(jìn)行洗滌和消毒處理，防止細(xì)菌感染等系列問題造成采精失敗。

采精前先用水清洗種公羊的陰莖和包皮，洗干凈后將公羊引到母羊面前。當(dāng)公羊開始爬跨母羊伸出陰莖時，采精員一只手持假陰道與地面成40o角貼近母羊的臀部，迅速用另一只手拖住陰莖插入到假陰道中。公羊表現(xiàn)出明顯的向前沖的動作時為正在射精，該過程很快，此時采精員要迅速將精液采集到集精瓶中，采集完后在瓶上記錄好公羊號，將集精瓶送至實驗室進(jìn)行后續(xù)精液品質(zhì)的檢查。采精結(jié)束后將假陰道進(jìn)行消毒，以便下次使用[3]。

3.3 采精注意事項

采精過程必須經(jīng)過嚴(yán)格的消毒技術(shù)，采精用到的所有物品都要經(jīng)過消毒后才能使用，避免引起疾病和感染。采精工作必須由熟練、細(xì)致的專業(yè)人員操作，且嚴(yán)格控制采精器械的環(huán)境溫度在40~42 ℃[4]。

4 羊精液品質(zhì)檢查

為達(dá)到良性配種的目的，對母羊輸精時要選擇優(yōu)質(zhì)的精液。通過精液品質(zhì)檢查來評定采集精液的優(yōu)劣，從而決定該精液能否對母羊進(jìn)行輸精。精液品質(zhì)檢查還能根據(jù)精液的濃稠程度確定稀釋的比例，以便對精液密度的測定。

4.1 外觀檢查

（1）顏色：優(yōu)質(zhì)的精液為乳白色，質(zhì)地較為濃稠，劣質(zhì)精液會出現(xiàn)紅色、褐色或綠色。

（2）氣味：優(yōu)質(zhì)的精液無味，有時會略帶腥味，劣質(zhì)精液有腐敗、發(fā)臭的異味。

（3）精液量：公羊的射精量與品種、年齡、飼養(yǎng)水平、采精頻率、采精技術(shù)等有關(guān)。正常公羊一次采集的精液量通常在0.5~2.0 ml范圍內(nèi)[5]。

4.2 顯微鏡檢查

4.2.1 精子活力 精子的活力是判斷精子質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，通常根據(jù)顯微鏡下觀察精子的活躍度來判斷，分為 10個等級?；盍Φ臋z查方法是用移液槍取 10 μl新鮮精液滴于載玻片中央，用蓋玻片緩緩蓋上，盡量減少氣泡的產(chǎn)生，在40或 100倍顯微鏡下觀察精子的活躍程度。精子的運動方式有直線運動、原地擺動和靜止，只有呈直線前進(jìn)運動的精子才具有受精能力。視野中所有精子都做高速直線運動的精液活力為 1.0，直線運動的精子在 90 % 以上、僅少數(shù)為原地擺動或靜止?fàn)顟B(tài)時，活力為 0.9，依次類推。凡活力在 0.6以上的精液都屬于優(yōu)質(zhì)精液，受精能力較強，而活力低于 0.5的精液屬于劣質(zhì)精液，生存能力較差，應(yīng)舍棄不宜使用[6]。

4.2.2 精子的密度 精子的密度指每1 ml的精液中所含的精子的數(shù)目，實驗室一般用血細(xì)胞計數(shù)板計算。粗略判斷精子密度的方法是用移液槍取10 μl新鮮精液滴于載玻片中央，用蓋玻片緩緩蓋上，盡量減少氣泡的產(chǎn)生，將制好的載玻片放在顯微鏡下觀察精子的密集程度，分為密集、中等、稀疏三個等級[7]。視野中精子緊密排列，精子之間的距離極小屬于“密”；精子之間的距離較大，各精子之間仍能容納下 1個精子的距離屬于“中”；精子之間排列松散、距離很大時屬于“稀”。精確計算精子的密度時可先將精液按一定比例稀釋，然后置于血細(xì)胞計數(shù)板上，在顯微鏡下數(shù)每個中格中的精子數(shù)目，連續(xù)數(shù) 5個，共數(shù)3次，取3次的平均值進(jìn)行測定和計算1 ml精液中的精子數(shù)目。結(jié)果大于 25億個/ml的精液為“密”，20~25億個/ml為“中”，少于20億個/ml為“稀”。優(yōu)質(zhì)精液的數(shù)量通常都高于 20億個/ml，除精液未混勻等其他不當(dāng)人工檢查操作，等級為“稀”的均為劣質(zhì)精液，應(yīng)舍棄。

4.3 精液檢查時應(yīng)注意的問題

檢查過程中要求操作嚴(yán)謹(jǐn)，數(shù)據(jù)可靠，檢測合格的精液才能用于輸精；精液稀釋后和使用前均需進(jìn)行品質(zhì)檢查；精液品質(zhì)檢查要在 20~25 ℃室溫且干凈的環(huán)境中進(jìn)行，鏡溫要保證在 30 ℃以上，檢查過程要迅速而準(zhǔn)確，避免時間過久或溫度不適宜造成精子活力的降低甚至死亡[8]。

5 精液的稀釋、分裝、運輸和保存

5.1 精液的稀釋

精子的一定活力和足夠的劑量是保證受精的前提，適當(dāng)?shù)膶⒕哼M(jìn)行稀釋不僅可以為精子提供營養(yǎng)，提高精子活力，還能擴(kuò)大精液量，將有限的精子輸給更多的母羊，提高種公羊的利用率。通過前期精液品質(zhì)檢查對精子密度的計算確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，保證稀釋后的精液具有正常的活力，符合用于輸精的精液標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.1 稀釋液的配制 稀釋液有多種配方，如奶汁稀釋液、生理鹽水稀釋液、葡萄糖卵黃稀釋液等，均呈弱酸性，對減少精子的活動、延長精子的存活時間具有顯著的作用。在羊精液稀釋的生產(chǎn)實踐中使用最多的是生理鹽水稀釋液，原料成本低、操作簡單。采集到精液后直接注射生理鹽水稀釋即可，也可以用提前進(jìn)行過濾和消毒的0.9 % 的氯化鈉溶液稀釋，通?？上♂?2~3倍。此配方稀釋的精液保存時間較短，稀釋后的精液常溫下只能保存 6 h，生產(chǎn)中要現(xiàn)用現(xiàn)配，且稀釋倍數(shù)較低。當(dāng)稀釋倍數(shù)較大時可使用奶汁稀釋液或葡萄糖卵黃稀釋液，雖然配制方法較生理鹽水稀釋液復(fù)雜，但營養(yǎng)成分高，可為精液提供營養(yǎng)，且稀釋倍數(shù)高至7倍[9]。

5.1.2 操作步驟 通過精液密度的檢查確定出需要稀釋的倍數(shù)，在無菌的環(huán)境中將稀釋液和精液在同一溫度下混合，通過輕輕攪拌或輕微晃動的方式混勻。加入稀釋液時要沿玻璃棒緩緩倒入，避免導(dǎo)入氣泡。精液稀釋后，取一滴樣品于顯微鏡下觀察其活力，并將檢查結(jié)果記錄在采精登記表上。

5.1.3 注意的事項 精液與稀釋液混合前要放置在同一個盛有溫水的燒杯中，或放置在35℃水浴鍋中，使二者溫度保持一致，避免混合時溫度差對精子活力的影響。精液稀釋操作應(yīng)在干凈、無菌的室溫環(huán)境下進(jìn)行，防止外界環(huán)境條件對精子的影響。稀釋倍數(shù)通常在 2~3倍，稀釋后的精液中精子數(shù)目不低于4億個/ml[10]。

5.2 精液的分裝

稀釋后的精液根據(jù)需要輸精的量裝入小試管中，封好口避免灑出，試管規(guī)格通常在 2~5 ml，試管中的精液量不能超過容量的 2/3。精液裝好后在試管外貼上標(biāo)簽紙注明該精液對應(yīng)的公羊品種、采集時間和精液品質(zhì)，放在室溫下使其自然降溫。

5.3 精液的運輸

運輸距離較近時，可將精液保存在5 ml小試管中，放在保溫瓶中即可，但精液量不能超過試管容量的 2/3，同時注意將試管口封好避免運輸過程中精液灑出。運輸距離遠(yuǎn)時，需要將精液在低溫或冷凍條件下保存，且運輸途中避免劇烈振蕩，以減少精子在運輸過程中的死亡。運輸?shù)木憾家⒚骶旱膩碓?、精液量、采集時間、精子活力和精子密度。

5.4 精液的保存

精液在體外的保存效果受多種因素的影響，溫度對其影響最為顯著。精液有 3種保存方式：室溫保存、低溫保存和冷凍保存。不同溫度下，精子的活動能力、運動速率、代謝水平都有較大差異。

精液在室溫下保存的溫度在 20 ℃ 左右，此時運動能力較弱，活力較低，因此存活時間較長，可保存 1 d；精液在 0~5 ℃ 低溫保存時，代謝水平低、活動較慢，產(chǎn)生的代謝廢物減少，活力和活率較高，且保存成本低、運輸方便，保存時間也可延長至 2~3 d；冷凍保存指將精液保存在液氮貯精罐（-196 ℃）中，以極低的溫度長期冷凍保存，從而達(dá)到延長精液壽命的目的。使用時提前將精液解凍，解凍后的精子活動能力較低，受精能力下降。此方法是保存時間最長的一種方式，可將精液長期保存，目前在實驗室相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用[11-13]。

6 發(fā)情鑒定

適時配種是保證羊人工授精成功與否的關(guān)鍵。通過觀察母羊的生理表現(xiàn)、外陰部腫脹程度、黏液性狀可判斷母羊是否發(fā)情[14]。在發(fā)情初期，母羊不安游走、食欲不振、嘶叫。母羊接受公羊爬跨，外陰部腫脹發(fā)紅，陰道潤滑，流出玻璃狀的白色黏液，這時即為發(fā)情盛期。

7 輸精

7.1 輸精前的準(zhǔn)備

輸精前要對所有輸精器械進(jìn)行高溫消毒殺菌，輸精員帶好口罩，身著無菌的操作服，用酒精和生理鹽水對手進(jìn)行清洗，同時保證操作環(huán)境的無菌。提前將備好的精液放置在 35 ℃ 恒溫水浴鍋中，取一滴樣品放在顯微鏡下觀察，檢查合格后才可用于輸精[15]。準(zhǔn)備好后將身體狀況良好、發(fā)情鑒定完畢的母羊安置好，蘸取 0.1 % 高錳酸鉀溶液擦拭母羊外陰部進(jìn)行清洗消毒，避免授精時對母羊的生殖器官造成感染，消毒完后開始準(zhǔn)備輸精。

7.2 輸精方法

輸精前先對母羊的外陰部進(jìn)行消毒和擦拭，在母羊發(fā)情排卵時用開腔器深入陰道內(nèi)將子宮口打開，隨后將輸精槍慢慢插入到子宮頸，深度在0.5~1.0 cm處時將精液緩緩注入，待精液全部輸入母羊體內(nèi)后，緩慢將輸精槍取出[16]。輸精完畢后，讓羊保持原姿勢停留5~10 min后再將其驅(qū)走。

輸精過程中插入開腔器和輸精槍時都應(yīng)緩慢操作，否則易劃傷母羊的生殖道，同時引起母羊弓背努責(zé)導(dǎo)致胸腔內(nèi)血壓增高、子宮平滑肌收縮[17]，不易確定子宮頸的位置，給深部輸精工作造成困難。

7.3 輸精時間

母羊的發(fā)情時間很短且無法準(zhǔn)確把握，通常在早晚各試情一次，試情后對母羊進(jìn)行第 1次輸精，間隔時間 8 h最適宜，8 h后進(jìn)行第 2次輸精，再過 8 h進(jìn)行第 3次輸精。3次輸精的配種率較高[18]，而對于技術(shù)純熟、經(jīng)驗豐富的配種員進(jìn)行2次輸精即可[19]。

7.4 輸精次數(shù)和輸精量

母羊的發(fā)情期較短，因此在發(fā)情時需及時進(jìn)行輸精。母羊發(fā)情期內(nèi)一般每隔8~10 h進(jìn)行一次輸精，共輸 2次。輸精的關(guān)鍵是要保證充足的輸精量，若輸入的精液為原精液，則輸 0.05~0.10 ml；若將精液稀釋后再輸精，則根據(jù)稀釋倍數(shù)輸入相應(yīng)的0.1~0.2 ml的稀釋精液[20]。

7.5 輸精要點和注意事項

（1）有條件的應(yīng)盡可能采用鮮精輸精，鮮精輸精和凍精輸精相比，活力和活率更高，運動速率更快，便于觀察操作。

（2）子宮頸輸精時用 0.1 % 高錳酸鉀溶液或稀釋 15倍的 5 % 新潔兒滅溶液清洗干凈外陰及周圍部位并用消毒紙巾擦干后，應(yīng)用生理鹽水再噴洗一遍（生理鹽水可置于噴壺內(nèi)），擦干后再進(jìn)槍，輸精槍盡量不與外部相觸碰，雙手撐開陰唇后借助開殖器等將輸精槍直接伸入陰道，接觸精液的器械盡可能避免不接觸殺精物品，外陰清洗最好選用新潔兒滅溶液，因為新潔兒滅較高錳酸鉀刺激性更小，對精子的危害相對更小[21]。

（3）子宮頸深處輸精，輸精槍進(jìn)入子宮頸內(nèi) 1 cm左右深處后即可打入精液，一邊打精液一邊退槍，輸精槍進(jìn)入子宮頸內(nèi)時要順勢緩慢推入（發(fā)情母羊子宮頸口微張），不可強硬捅插，以免捅傷母羊子宮頸，造成子宮頸發(fā)炎、粘連等繁殖疾病[22]。

（4）子宮頸輸精，打入精液退槍后，保持母羊倒立狀態(tài) 0.5 min左右，可在母羊背部拍一巴掌，讓母羊抽搐收縮子宮頸，便于精液流入子宮內(nèi)[23]。

（5）子宮頸輸精一般在母羊發(fā)情后6~8 h進(jìn)行第一次輸精，8 h后進(jìn)行復(fù)配；腹腔內(nèi)窺鏡子宮角輸精應(yīng)在母羊發(fā)情后24 h內(nèi)完成，以發(fā)情后12~24 h輸精為宜[24]。

（6）母羊配種18~22 d后用公羊進(jìn)行試情，有發(fā)情表現(xiàn)的母羊進(jìn)行補配。

（7）輸精操作前后應(yīng)對器械進(jìn)行清洗消毒，包括B超儀探頭等，探頭是換能器，是B超儀的主要、重要部件，關(guān)系到孕檢的可行性和準(zhǔn)確性，必須輕拿輕放，不能損壞[25]。

8 后期管理

8.1 配種記錄

填寫?zhàn)B殖檔案，記錄種公羊品種、種公羊號、母羊品種、母羊號、母羊年齡、發(fā)情時間、輸精時間、胎次和精子活率等配種信息，便于技術(shù)人員了解母羊的具體情況。

8.2 妊娠診斷

妊娠后，母羊明顯表現(xiàn)出食欲增加、營養(yǎng)狀況改善、體重增長加快、皮毛有光澤，同時體內(nèi)新陳代謝更加旺盛，消化能力大大提高。配種后的母羊是否再次發(fā)情是判定妊娠依據(jù)，但不是母羊妊娠的必要依據(jù)，需要具體檢測。檢測妊娠可應(yīng)用 B超，在母羊輸精后 60 d左右對其進(jìn)行直腸檢查，如檢查發(fā)現(xiàn)卵巢上出現(xiàn)持續(xù)黃體、變硬，子宮內(nèi)膜增生，子宮角兩側(cè)不對稱，子宮壁變厚，有胚泡出現(xiàn)，可判斷為妊娠?；蛘吣秆蜉斁?0 d后無重復(fù)發(fā)情同樣可視為妊娠[26]。

9 人工授精技術(shù)要點和注意事項

（1）同期發(fā)情的母羊要空懷，可通過 B超儀檢測，不然用藥會流產(chǎn)，造成經(jīng)濟(jì)損失。

（2）提前 1個月左右加強對采精公羊的飼養(yǎng)管理，提高公羊的飼料營養(yǎng)，促進(jìn)身體健康狀況，同時定期進(jìn)行采精訓(xùn)練，有利于提高采集的精子的質(zhì)量。

（3）給母羊放置黃體酮陰道栓（PRID）時，栓槍頭應(yīng)涂抹適量滅菌潤滑劑，以方便栓槍進(jìn)出，不傷母羊陰道；埋置 PRID時，若外留線過長需剪掉過長部分（外留 12~15 cm即可），外留線過長陰道栓易被羊只咬拉出來，造成誘導(dǎo)發(fā)情失敗[27]。

（4）最好選擇發(fā)情好、性欲強、身體健壯的母羊做臺羊；采精前，在采精器夾層內(nèi)注入適量溫水，將溫度調(diào)至 37~40 ℃，在內(nèi)胎上口至下1/3~1/2處涂抹滅菌潤滑劑，最后吹氣加壓，盡量模擬母羊陰道環(huán)境，讓公羊在采精時感到舒適愉悅，才能采到更多、質(zhì)量更好的精液；集精杯使用時應(yīng)在杯外套上杯套，冬天起到保溫防凍、夏天起到遮陽防曬的功效，可有效保護(hù)精子，以免降低精子質(zhì)量。

10 展望

隨著人們對羊產(chǎn)品的消費需求日益增高，羊人工授精技術(shù)對羊養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)起重要的保障作用。羊人工授精技術(shù)是一種科學(xué)配種方法，技術(shù)手段成熟，目前在羊養(yǎng)殖業(yè)已被廣泛推廣應(yīng)用。但由于部分養(yǎng)殖場衛(wèi)生環(huán)境條件較差、精液的質(zhì)量得不到保證，往往會導(dǎo)致受胎率偏低。同時，有些養(yǎng)殖場缺乏專業(yè)的采精人員，人手不足或技術(shù)不嫻熟、操作細(xì)節(jié)把握不得當(dāng)，導(dǎo)致輸精不成功或?qū)δ秆蛏车涝斐蓳p傷。

未來應(yīng)注重改善養(yǎng)殖場環(huán)境，保證精液的質(zhì)量；總結(jié)母畜發(fā)情經(jīng)驗，減少盲目放對；加大對專業(yè)人員的技能培訓(xùn)，提高操作人員的技術(shù)水平，確保每一名工作人員都能夠詳細(xì)的掌握人工授精技術(shù)要點，提高母羊受精率，降低母羊感染等相關(guān)問題。國家鼓勵專業(yè)相關(guān)技術(shù)人員深入養(yǎng)殖群體，開展有效的宣傳帶動活動，在人工授精方面實現(xiàn)創(chuàng)新和突破，不斷學(xué)習(xí)和引進(jìn)專業(yè)知識，構(gòu)建人工授精的專業(yè)知識體系，加快羊人工授精技術(shù)的普及，實現(xiàn)羊產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)、高效發(fā)展。