房云海（Fang Yunhai），張心聲（Zhang Xinsheng）

（山東省血液中心山東省血友病診療中心，濟南，250014；

冷沉淀在1964 年由美國醫(yī)生Judith Graham Pool 首先發(fā)現，是采用特定的方法將新鮮冰凍血漿在1～6 ℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的冷不溶解物質速凍的成分血［1］。 冷沉淀的質量抽檢需要進行凝血因子Ⅷ（FⅧ）活性測定，但對于如何測定冷沉淀中FⅧ的活性，尚無統一的標準。血站技術操作規(guī)程（2019 版）和全血及成分血質量監(jiān)測指南（WS／T550-2017）要求在使用血凝儀測定時，應參照廠家使用說明［2-3］。 血凝儀廠家的使用說明往往是針對患者血漿FⅧ活性測定，而不是針對冷沉淀，冷沉淀中的FⅧ活性遠高于日常檢測的患者血漿，也遠超標準曲線的檢測范圍，在測定過程中很多細節(jié)會影響測定結果。 我們根據日常工作經驗和復習文獻，對冷沉淀FⅧ活性測定全過程中需要注意的問題總結如下。

1 冷沉淀抽樣的控制

目前血站技術操作規(guī)程（2019 版）要求成分血質量檢查的抽樣量為每月制備量的1%或至少4袋。 若該成分血每月制備量少于4 袋的，由血站根據統計過程抽樣原則自行制定抽樣頻次［2］。 由于不同血型的獻血者本身FⅧ的水平也有差異，冷沉淀的凝血因子質控抽樣時要注意血型的影響，如果抽檢4 袋冷沉淀的話，建議每個血型一袋，如果抽檢袋數超過4 袋，建議按照制備量選擇血型抽檢。 O型血的人FⅧ和血管性血友病因子（VWF）整體偏低，所以O 型血漿和冷沉淀的FⅧ和VWF 含量也整體偏低。

1979 年7 月柳葉刀雜志發(fā)表的文章研究了冷沉淀中FⅧ含量和血型的關系［4］，這些冷沉淀均來源于一個單位全血（約513 mL）分離后的血漿（約225 mL），其中O 型冷沉淀FⅧ含量要低于其他血型，而Rh 陰性或陽性則對凝血因子水平影響不大（表1）。 我們在2012 年檢測了40 袋冷沉淀中FⅧ含量，這些冷沉淀均來源于400 mL 的全血，其中O型冷沉淀中FⅧ含量最低，AB 型冷沉淀中FⅧ含量最高（表2）［5］，跟柳葉刀雜志的結果相符。 不符合要求的11 袋冷沉淀中，有7 袋是O 型的冷沉淀，而這些O 型冷沉淀本身的原料血漿中FⅧ就整體偏低。 目前尚不能常規(guī)開展制備前的凝血因子檢測，所以我們在臨床使用O 型冷沉淀治療時，應該適當調整用量。

表2 我中心檢測40 袋冷沉淀原料血漿及冷沉淀中FⅧ含量

2 冷沉淀融化條件的控制

冷沉淀應該在37 ℃水浴中快速充分融化，一般需要融化15～20 min。 室溫融化或融化時間太短會形成冷沉淀，影響FⅧ的檢測；融化時間太長，會增加FⅧ的損耗。

血站技術操作規(guī)程（2019 版）里面冷沉淀的制備方法有兩種，分別是離心法和虹吸法，最后的體積都是40 ～50 mL。 冷沉淀的體積增加以后，充分融化需要的時間也隨之增加。

英國最新的出凝血實驗室檢測指南指出，如果血漿不能及時檢測，凍存后融化的要求是在37 ℃融化5 分鐘或直至充分融化，目的是避免形成冷沉淀，影響檢測結果［6］。 融化5 min 的檢測用血樣一般只有1 mL 左右，冷沉淀體積是40～50 mL，如果融化5 min，顯然不能充分融化。 英國的一項針對冷沉淀質控的研究中把冷沉淀在35±2 ℃融化20 min，冷沉淀的FⅧ含量是符合要求的，所以冷沉淀融化時間不超過20 min，對于FⅧ的含量影響不大［7］。

3 冷沉淀融化后取樣和樣品檢測前的保存條件

冷沉淀融化后，取樣檢測前需要充分混勻，混勻后的樣本更能代表整個冷沉淀的質量。 混勻時應避免劇烈振蕩和產生氣泡。 冷沉淀融化后放在室溫，盡快上機檢測，最長不要超過4 個小時。 2021 年發(fā)布的凝血因子活性測定技術標準中，要求在4 h 內完成血漿標本檢測［8］。 再有要避免檢測血樣的反復凍融，血樣一旦融化后，除非檢測都完成，不要再次凍存。

冷沉淀融化后儲存的溫度條件，不同的文獻上有三種選擇，分別是放到冰水混合物上、2 ～4 ℃冷藏和室溫保存。 放置到冰水混合物上，只是在室溫高于25 ℃時需要這樣操作，目前大部分的實驗室都不會超溫，所以一般不推薦這個選擇。 而且冰水混合物溫度太低，可能激活凝血因子Ⅶ，影響最終檢測結果。

2016 年，英國的研究人員把冷沉淀融化后，在室溫（22 ～24 ℃）放置，然后在融化后0、4、10、24、48、72 h 的時間點檢測。 與融化后0 h 相比，從24 h開始，FⅧ降低有統計學意義，但降低的不到10%。在0 到48 h，有94%的冷沉淀檢測FⅧ水平符合英國標準的要求，在72 h 的點，88%的冷沉淀檢測FⅧ水平合格，都高于英國標準要求的75%以上的抽檢樣本合格。 該項研究顯示，在室溫條件下FⅧ的活性比我們預期的要更穩(wěn)定［7］。

4 冷沉淀FⅧ活性測定樣品的預稀釋

質量合格的冷沉淀中F Ⅷ活性一般在200 ～1000 IU／dL，遠超過標準曲線的上限，為保證檢測的結果在標準曲線的范圍內，在檢測FⅧ的時候必須進行預稀釋，一般稀釋5 倍或者10 倍。 具體稀釋倍數應該根據實驗室實際情況進行驗證。 世界血友病聯盟實驗手冊中稀釋液包括凝血因子檢測中的緩沖液或乏凝血因子Ⅷ，但首選的是乏凝血因子Ⅷ［9］。我們實驗室冷沉淀一般稀釋5 倍后進行檢測，稀釋液采用全自動血凝儀配套的緩沖液。

5 FⅧ活性測定結果的表達方式

在進行FⅧ活性檢測時，常用的單位有三個，分別是%，IU／dL（單位／分升）和IU／mL（單位／毫升）。

我們假定一個標準的正常人，他的凝血因子水平也是最標準的，就是1 mL 血漿里面有1 個單位的凝血因子，他的凝血因子水平就是1 IU／mL，也就是100%。

換算成IU／dL 單位，對于他來說每分升血漿是100 mL，每毫升里面1 個單位的凝血因子，每分升里面是100 個單位的凝血因子，所以他的凝血因子水平是100 IU／dL。 這個人的凝血因子水平用不同的單位表示為：100%＝100 IU／dL＝1 IU／mL。

血友病診斷與治療中國專家共識中凝血因子檢測的單位用的是IU／dL［10］，而我們國內檢測報告上最常用的還是%這個單位。 但在冷沉淀質控中，計算結果時需要把凝血因子的單位換算到IU／mL。

6 冷沉淀FⅧ含量的計算

冷沉淀質控的要求是每袋冷沉淀的FⅧ含量，需要用冷沉淀的FⅧ活性水平乘上體積。 不同的全自動血凝儀，檢測結果的單位可能有差別，但是最后計算FⅧ含量的時候，需要把凝血因子的單位換算到IU／mL，然后乘上冷沉淀的毫升數，就得到了每袋冷沉淀含FⅧ的單位數。 《全血和成分血質量要求》中冷沉淀質量控制項目要求來源于400 mL 全血的冷沉淀中FⅧ≥80 IU，來源于300 mL 全血的FⅧ≥60 IU，來源于200 mL 全血的FⅧ≥40 IU。

7 冷沉淀FⅧ含量質量抽檢結果的解釋和利用

由于獻血者本身FⅧ含量的差異，75%以上的冷沉淀抽檢合格即為符合血液質量要求。 如果抽檢4 袋冷沉淀，低于75%的冷沉淀符合質量要求，可以考慮增加抽樣數量，增加抽樣數量后仍然不合格，那就要針對冷沉淀制備的整個過程查找原因，加強冷沉淀制備全過程的質量控制和標準化操作。

8 FⅧ活性測定試驗標準曲線的繪制、使用與更新

標準曲線不是一成不變的，在試劑批號更換的時候需要重新定標，更新標準曲線；質控結果不理想的時候，也要考慮更新標準曲線。 通常使用商品化的標準血漿建立標準曲線，其標示值需溯源至國際標準物質，不推薦自制定標血漿。

一期法是目前最常見的凝血因子活性測定方法，采用一期法檢測FⅧ，至少應進行2 個稀釋度的檢測，有條件可以進行3 個或3 個以上稀釋度的檢測，然后判讀結果［11］。 檢測結果與稀釋度的線性關系與標準曲線進行比較，可以提示是否存在抗凝物或樣本活化，同時也可以提高結果的可靠性。 應保證檢測的結果在標準曲線的范圍內，檢測結果高于標準曲線的上限時，直接檢測得到的結果就不可靠，需要選用稀釋后檢測的結果。

9 全自動血凝儀操作的質量控制

實驗室應按照儀器試劑生產廠商的操作說明制定符合自己實驗室要求的凝血因子檢測標準操作程序文件，并嚴格按照標準操作程序文件的要求進行操作。 全自動血凝儀需要定期保養(yǎng)和校準，排除如光源不穩(wěn)定、溫度波動等機器故障影響。 全自動血凝儀宜選擇使用配套試劑開展檢測。 如使用非配套試劑，應進行性能驗證。 試劑應按照貯存條件妥善保存并在有效期內使用。

10 FⅧ活性測定試驗的室內質控

實驗室應保證每次開機檢測凝血因子時都進行一次正常水平和異常水平的室內質控。 目前我們實驗室使用正常水平和異常水平兩種商業(yè)質控品進行室內質控，還用冰凍血漿自制質控血漿同步檢測，以保證檢測結果的準確可靠。

商業(yè)質控品血漿在復溶后允許凍融一次，可以在復溶后分裝凍存，在-70 ℃條件下最多可保存6個月。

當質控結果在允許范圍之外時，需要明確失控的具體原因，并采取恰當的糾正措施。 只有質控結果在允許范圍內時，才可以發(fā)放檢測報告。

11 FⅧ活性測定的室間質評和比對

實驗室應參加室間質量評價機構組織開展的室間質量評價活動，以保證采用相同實驗室檢測系統之間結果的可比性。 我中心出凝血實驗室對外檢測全部凝血因子及VWF 抗原和活性，實驗室從2006年開始參加英國謝菲爾德的國際出凝血室間質評，目前還參加國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心的凝血因子室間質評項目。

2014 年，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心針對72家開展凝血因子檢測的臨床實驗室進行調查，僅有44 家開展室內質控，占61%，僅有17 家參加室間質評［12］。 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心目前已經開展了凝血因子室間質評項目，針對所有開展凝血因子檢測的實驗室，有條件的血站也可以報名參加。

12 人員培訓

凝血因子檢測需要有經驗的實驗室技術人員，才能保證檢測結果的準確可靠。 世界血友病聯盟發(fā)布的血友病管理指南，其中實驗室檢測部分指出，準確的凝血因子檢測，需要經過培訓的專業(yè)技術人員；進行檢測的技術人員需要了解凝血因子檢測的原理，并且在條件許可的情況下到專業(yè)的檢測中心進行培訓［13］。

13 結 語

質量抽檢是確保冷沉淀質量合格，臨床使用有效的重要保障，只有保證檢測過程合理、檢測結果可靠，才是有效的質量抽檢。 我們的認識也有不足的地方，檢測中的注意事項隨著儀器和方法的更新，也會有改變，只有持續(xù)不斷的學習，才能保證檢測結果和質量抽檢結果的準確可靠。

冷沉淀的質量要求最終還是取決于用途，隨著冷沉淀使用范圍的改變，冷沉淀的質量要求也應進行相應的調整。 衛(wèi)生行業(yè)標準內科輸血（WST622-2018）中，冷沉淀凝血因子的使用范圍是：適用于FⅧ和／或FXIII 和／或VWF 和／或纖維蛋白原等缺乏的治療性輸注［14］。 但用于低纖維蛋白原血癥或血友病患者的規(guī)則都是在藥源性纖維蛋白原和藥源性FⅧ濃縮物無法獲得時輸注。 目前針對冷沉淀凝血因子的質量要求，主要關注FⅧ和纖維蛋白原的含量，對于VWF 和凝血因子XIII 重視不夠。 國內目前尚無專門治療血管性血友病患者（VWD）和凝血因子XIII 缺乏患者的血漿制品，出血時治療的首選是冷沉淀，隨著冷沉淀使用范圍的改變，我們也應該更重視冷沉淀中的VWF 和凝血因子XIII 的含量。

作者貢獻聲明房云海負責撰寫文章；張心聲負責修改文章

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突