李文濤，王韻涵，劉江月

（濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東濰坊261053）

糖尿病大血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死致殘的首要原因［1］，高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是2型糖尿病大血管并發(fā)癥的始動環(huán)節(jié)。盡管人們早已認(rèn)識到氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥的核心發(fā)病機(jī)制，但單純的抗氧化治療預(yù)防大血管并發(fā)癥的效果并不理想。有研究表明，自噬在神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、肝臟疾病、心臟病、代謝綜合征、衰老和炎癥中發(fā)揮著作用［2］，自噬的發(fā)現(xiàn)為防治糖尿病大血管并發(fā)癥提供了新的思路。近幾年自噬與糖尿病及其慢性并發(fā)癥的關(guān)系引發(fā)廣泛關(guān)注。自噬是細(xì)胞適應(yīng)不利環(huán)境，維持穩(wěn)態(tài)的重要途徑。高糖誘導(dǎo)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞后，DNA損傷啟動了修復(fù)系統(tǒng)，其修復(fù)的程度決定了細(xì)胞的命運［3］。由此可以看出自噬在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)中的重要性，自噬的增強(qiáng)促進(jìn)了修復(fù)，這也使其成為潛在的促進(jìn)細(xì)胞損傷修復(fù)的新靶點。目前，如何調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬逐漸成為研究熱點。梓醇是地黃中發(fā)揮藥理作用的主要活性成分之一，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等多種藥理學(xué)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)梓醇梓醇（catalpol，CAT）能夠減輕糖尿病大血管損傷［4-5］，那么，梓醇是否通過促進(jìn)自噬，減輕高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮DNA損傷，從而減輕大血管損傷呢？因此，本實驗的目的就是明確梓醇減輕高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮DNA損傷的作用，并以自噬在為切入點，研究其可能的作用機(jī)制，為臨床防治糖尿病大血管病變提供新思路，為尋找新藥提供新靶點。

材料和方法

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑梓醇（純度≥98%）購自成都植標(biāo)化純生物科技有限公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購自Sigma；8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ROS及DNA損傷檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸化組蛋白H2AX變異體（γH2AX）抗體購自Abcam；beclin-1、p62和LC3抗體及Ⅱ抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器DYCN-25D型電泳儀（北京市六一儀器廠）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus）；752型紫外分光光度計（上海精密儀器有限公司）；轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析儀（BIO-RAD）。

2 方法

2.1 實驗分組及干預(yù)方法生長良好的EA.hy926細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對照（control，CON）組、高糖（high glucose，HG）組、梓醇高劑量（HG+CAT-H）組、梓醇低劑量（HG+CAT-L）組和自噬抑制劑（HG+CAT-H+3-MA）組。HG+CAT-H、HG+CAT-L和HG+CAT-H+3-MA組分別加入0.5、0.05及0.5 mmol/L濃度的梓醇孵育24 h，HG+CAT+3-MA組繼續(xù)加入5 mmol/L濃度3-MA共孵育24 h后棄培養(yǎng)液；HG、HG+CAT-H、HG+CAT-L和HG+CAT-H+3-MA組再加入終濃度33 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。根據(jù)文獻(xiàn)［6-9］確定高糖、梓醇及3-MA的劑量并建立了高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞DNA損傷模型。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS生成收集處理后的各組細(xì)胞，PBS溶液洗滌，離心5 min，棄上清，加入稀釋的ROS熒光探針染劑400 μL吹打重懸，37℃孵育30 min，間隔5 min吹打1次，孵育后立即采用流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS。

2.3 ELISA檢測8-OHdG水平收集處理后的各組培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定8-OHdG水平。

2.4 激光共聚焦檢測γH2AX水平處理后的各組細(xì)胞去上清，加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌3次，Triton-X透化細(xì)胞30 min，胎牛血清封閉1 h，加入Ⅰ抗（1∶200）4℃過夜，熒光標(biāo)記Ⅱ抗避光孵育1 h，DAPI細(xì)胞核染色10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照并進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析。

2.5 Western blot檢測γH2AX、beclin-1、p62和LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)收集細(xì)胞提取總蛋白，所有蛋白SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液封閉1 h后加Ⅰ抗（1∶500），4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入Ⅱ抗，37℃孵育1 h，TBST洗滌4次，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

2.6 電鏡觀察自噬小體的形成情況收集處理后的各組細(xì)胞，用2.5%戊二醛4℃固定過夜。1%鋨酸固定液固定2 h，脫水、滲透、包埋，超薄切片機(jī)切片70 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察自噬小體。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間采用單因素方差分析，兩組間采用SNK-q進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 梓醇對高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞ROS生成及8-OHdG含量的影響

與CON組比較，HG組ROS生成及8-OHdG含量均顯著增加（P＜0.05）；與HG組比較，HG+CAT-H、HG+CAT-L組ROS生成及8-OHdG含量均顯著降低（P＜0.05）；與HG+CAT-H組比較，HG+CAT-H+3-MA組ROS生成及8-OHdG含量顯著升高（P＜0.05），見圖1。

2 梓醇對高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞γH2AX的影響

與CON組比較，HG組γH2AX生成均顯著增加（P＜0.05）；與HG組比較，HG+CAT-H、HG+CAT-L組γH2AX生成均顯著減少（P＜0.05），與HG+CAT-H組比較，HG+CAT-H+3-MA組γH2AX生成顯著增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 1.The effect of catalpol（CAT）on ROS generation and 8-OHdG content in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HG group；△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.圖1梓醇對高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞ROS生成及細(xì)胞上清8-OHdG含量的影響

Figure 2.The effect of catalpol（CAT）on γH2AX in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HG group；△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.圖2梓醇對高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞γH2AX的影響

3 梓醇對高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞γH2AX、beclin-1、p62和LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)的影響

與CON組比較，HG組γH2AX蛋白含量及p62蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），beclin-1、LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)則均顯著減少（P＜0.05）；與HG組比較，HG+CAT-H、HG+CAT-L組γH2AX蛋白含量及p62蛋白表達(dá)均顯著減少（P＜0.05），beclin-1、LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；與HG+CAT-H組比較，HG+CAT-H+3-MA組γH2AX蛋白含量及p62蛋白表達(dá)均顯著增加，而beclin-1、LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)均顯著減少（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The effect of catalpol（CAT）on the expression of γH2AX，beclin-1，p62 and LC3-II/LC3-I proteins in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HG group；△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.圖3梓醇對高糖誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞γH2AX、beclin-1、p62和LC3-II/LC3-I蛋白表達(dá)的影響

4 梓醇對高糖誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞自噬小體形成的影響

與CON組比較，HG組自噬小體形成顯著減少；與HG組比較，HG+CAT-H、HG+CAT-L組自噬小體形成均顯著增加（P＜0.05）；與HG+CAT-H組比較，HG+CAT-H+3-MA組自噬小體形成顯著減少（P＜0.05），見圖4。

討 論

Figure 4.The effect of catalpol（CAT）on the formation of autophagosomes in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs HG group；△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.圖4梓醇對高糖誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞自噬小體形成的影響

糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升，而糖尿病患者最主要的威脅為慢性并發(fā)癥［10］。T2DM的持續(xù)高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致心血管病變、視網(wǎng)膜病變、腎臟病變、神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥。研究證實DNA損傷與糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［11］，糖尿病高糖狀態(tài)所致的氧化應(yīng)激是多種慢性并發(fā)癥形成的關(guān)鍵原因之一，也是誘發(fā)DNA損傷的重要因素。氧化應(yīng)激產(chǎn)生過多的活性氧作為一種突變誘導(dǎo)劑，可將DNA鏈上的鳥嘌呤氧化為8-羥基鳥嘌呤。在DNA復(fù)制過程中，8-OHdG易與腺嘌呤錯配，導(dǎo)致G：C到T：A顛換突變，形成DNA損傷。ROS還會引起DNA雙鏈斷裂，有組蛋白H2AX迅速磷酸化，生成磷酸 化 的組蛋 白γH2AX。8-OHdG、γH2AX是 細(xì) 胞DNA損傷的特征性標(biāo)志，通常用于判斷細(xì)胞DNA損傷［12］。本研究以EA.hy926細(xì)胞為研究對象，高糖誘導(dǎo)建立細(xì)胞DNA損傷模型，證實ROS生產(chǎn)顯著增多，同時發(fā)現(xiàn)8-OHdG含量及γH2AX表達(dá)均顯著增多，說明高糖能夠致EA.hy926細(xì)胞DNA損傷。多種植物化合物具有抗DNA損傷的作用，特別是可拮抗和預(yù)防自由基所造成的氧化性DNA損傷。運用DPPH自由基和·OH反應(yīng)模型，發(fā)現(xiàn)芹黃素可對自由基產(chǎn)生淬滅效應(yīng)，并對·OH所致的DNA損傷產(chǎn)生抑制作用［13］。羥基酪醇是一種橄攬葉提取物，可通過保護(hù)DNA損傷而抑制蘇丹紅一號的毒性作用［14］。還有研究證實姜黃素可以保護(hù)丙烯酰胺所致的HepG2細(xì)胞DNA損傷。梓醇作為地黃的主要活性成分，具有降低血糖、血脂、保護(hù)心血腦管系統(tǒng)等作用。本研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠顯著降低8-OHdG含量，減少γH2AX蛋白表達(dá)，減輕了高糖誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞DNA損傷，證實梓醇與很多植物化合物一樣具有抗DNA損傷的作用。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體吞噬降解衰老、受損蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的過程，有助于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是一種細(xì)胞內(nèi)的適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。自噬能參與調(diào)控多種外源化學(xué)物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性轉(zhuǎn)歸，與其參與調(diào)節(jié)多種損傷修復(fù)關(guān)鍵酶的表達(dá)而加速DNA損傷的修復(fù)進(jìn)程、維持基因組穩(wěn)定性密切相關(guān)。自噬和DNA修復(fù)是維持細(xì)胞正常狀態(tài)的生物學(xué)過程，自噬可參與DNA損傷修復(fù)。自噬小體形成是自噬激活的特征，而beclin-1、p62和LC3是自噬相關(guān)基因，在自噬小體形成過程中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)能反映自噬的激活程度。Tian等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，高糖激活mTOR信號通路，抑制LC3-II/LC3-I、beclin-1的表達(dá)以及增加SQSTM1/p62堆積抑制自噬，從而促進(jìn)鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病Apo E-/-小鼠動脈粥樣硬化。高血糖可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS水平上升，從而導(dǎo)致炎癥，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，是糖尿病大血管病變的始發(fā)事件。Xie等［16］的研究中發(fā)現(xiàn)，AGEs可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ROS水平升高，作為一種防御機(jī)制，機(jī)體內(nèi)的自噬水平相應(yīng)的增加，而自噬抑制劑3-MA加重了AGEs對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。以上研究均表明自噬與糖尿病大血管病變密切相關(guān)，糖尿病時氧化應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體自噬增加，然而長期高血糖又會抑制自噬導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大血管病變發(fā)生。本研究也發(fā)現(xiàn)，高糖組自噬小體形成顯著減少，自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3-II/LC3-I表達(dá)均顯著減少，而p62蛋白表達(dá)顯著增加，說明高糖確實抑制了細(xì)胞自噬。而梓醇預(yù)處理的EA.hy926細(xì)胞自噬小體形成顯著增加，自噬相關(guān)蛋白beclin-1、LC3-II/LC3-I表達(dá)均顯著增加，而p62蛋白表達(dá)顯著減少，證實了梓醇能夠促進(jìn)自噬增加。

綜上所述，本研究證實了梓醇能夠有效地減輕高糖誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞DNA損傷，其機(jī)制可能與梓醇促進(jìn)自噬增強(qiáng)有關(guān)。然而，在此次研究中尚有不足：第一，梓醇誘導(dǎo)自噬的機(jī)制還未闡明，在今后的研究中將通過各種分子生物學(xué)手段明確此問題；第二，仍需要進(jìn)一步動物實驗支持此次研究的發(fā)現(xiàn)，以上兩點將是下一步研究工作的重要內(nèi)容。