崔麗娜，韓 英

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710032)

肝臟作為人體最大的加工廠，擔(dān)負(fù)著重要的消化、合成、代謝及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能。當(dāng)發(fā)生急性損傷或部分切除后，可以發(fā)揮強(qiáng)大的再生能力，在短時間內(nèi)完成功能和細(xì)胞數(shù)的恢復(fù)。但如果肝臟的慢性損傷持續(xù)，尤其是發(fā)展至肝纖維化、肝硬化階段，肝臟再生能力被顯著抑制，出現(xiàn)以肝功能減退為主的臨床證候群，一旦出現(xiàn)肝功能衰竭，病情很難逆轉(zhuǎn)。如何實(shí)現(xiàn)慢性肝病基礎(chǔ)上的肝臟損傷修復(fù)和再生一直是慢性肝病治療面臨的主要問題。

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞。在理論層面上，干細(xì)胞的高度自我更新能力使得干細(xì)胞可以成為一個源源不竭的細(xì)胞庫，極大地克服肝細(xì)胞移植治療終末期肝病時肝細(xì)胞體外增殖能力有限的問題；干細(xì)胞的多向分化潛能賦予了干細(xì)胞一定的可塑性，可分化為具有肝功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。在體外，將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，可以解決生物人工肝種子細(xì)胞來源困難的問題。在體內(nèi)，將干細(xì)胞經(jīng)肝動靜脈回輸入肝臟局部，可分化為肝細(xì)胞，從一定程度上提高終末期肝病患者的肝臟功能，改善終末期肝病患者的臨床癥狀。因此，課題組圍繞干細(xì)胞治療慢性肝病尤其是肝硬化和肝衰竭等開展了系列基礎(chǔ)和臨床研究。

1 自體干細(xì)胞回輸治療可顯著改善肝硬化患者肝功能且不增加肝癌的發(fā)生

課題組于2005年建立了自體外周血干細(xì)胞經(jīng)肝動脈回輸治療終末期肝病新技術(shù)[1]，即用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)將失代償期肝硬化患者的骨髓源性干細(xì)胞動員至外周血，再分離、采集干細(xì)胞，之后經(jīng)肝動脈回輸至患者肝臟。首先通過旨在探討G-CSF對干細(xì)胞療效影響的40例隨機(jī)對照研究，明確與單純G-CSF動員相比，外周血干細(xì)胞移植顯著升高了患者的血清白蛋白水平、縮短了患者的凝血酶原時間、降低了患者的Child-Turcotte-Pugh(CTP)評分；提示富集后的自體外周血干細(xì)胞經(jīng)肝動脈回輸入患者體內(nèi)后，其對肝功能的改善效果明顯優(yōu)于單純動員組[2]；進(jìn)一步通過近10年的長期隨訪臨床研究明確了自體干細(xì)胞治療肝硬化的有效性和安全性。結(jié)果顯示，自體干細(xì)胞移植可顯著提升患者肝臟功能(合成能力——白蛋白、膽堿酯酶、凝血提高)，降低終末期肝病模型及CTP評分。患者平均生存期由71個月延長為94個月，5年生存率由52.1%提高為71.2%[3]。

2 干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后可向損傷肝臟歸巢并部分轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞

干細(xì)胞為混合細(xì)胞群，包含間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)等。課題組針對干細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后的轉(zhuǎn)歸開展了研究：將失代償期肝硬化患者外周血的干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注入裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)來自患者的干細(xì)胞可以定植于受體鼠肝臟內(nèi)[4]。隨后，將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的MSC、HSC或MSC+HSC經(jīng)尾靜脈移植入同品系雌性小鼠體內(nèi)，分別于2 h、24 h、7 d和28 d檢測GFP信號，發(fā)現(xiàn)GFP信號首先在小鼠肺內(nèi)蓄積，2 h后GFP信號在肺內(nèi)開始逐漸減弱，并在肝臟中一直保持增長趨勢，說明移植干細(xì)胞進(jìn)入受體鼠體內(nèi)后，可向損傷肝臟歸巢，并且MSC較HSC歸巢能力更強(qiáng)[5]。

干細(xì)胞可以分化為肝細(xì)胞是干細(xì)胞用于肝臟疾病治療的理論支撐，也是干細(xì)胞治療肝臟疾病的主要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞的主要組成細(xì)胞HSC和MSC，不僅可以分化為血細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等，還可跨胚層界限，分化為肝細(xì)胞等[6]。1999年，美國學(xué)者PETERSEN等[7]將雄性鼠骨髓移植入四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷雌性鼠模型，并通過2乙酰氨基酸抑制自身肝細(xì)胞的再生、刺激卵原細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)雌性鼠肝臟內(nèi)存在一些含有Y染色體的卵原細(xì)胞及肝細(xì)胞，說明來自雄性鼠的骨髓細(xì)胞移植入雌性鼠體內(nèi)后可分化為肝卵原細(xì)胞并進(jìn)一步分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。課題組從終末期肝病患者的外周血中分離、收集含有干細(xì)胞的單個核細(xì)胞，將細(xì)胞接種于包被有纖連蛋白的培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)液中加入重組人肝細(xì)胞生長因子。7～14 d后，可見培養(yǎng)皿中有具有肝細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞出現(xiàn)。這些具有肝細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞還能夠表達(dá)成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志分子(人白蛋白、CK-18、CYP3A4等)，能夠產(chǎn)生或分泌乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、葡萄糖、尿素和白蛋白。提示終末期肝病患者的干細(xì)胞在肝細(xì)胞生長因子的誘導(dǎo)下可轉(zhuǎn)分化為具有一定形態(tài)和功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞[1]。用熒光染料PKH26-GL標(biāo)記終末期肝病患者的外周血干細(xì)胞，并將其從尾靜脈注入部分肝切除的裸鼠體內(nèi)，在裸鼠肝臟中可檢測到人白蛋白的表達(dá)。由此證明，終末期肝病患者的干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)也可轉(zhuǎn)分化為具有合成白蛋白功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞[4]。

3 miRNA參與MSC肝向分化過程，并可以介導(dǎo)MSC直接轉(zhuǎn)分化為在體內(nèi)外均可以發(fā)揮功能的肝細(xì)胞

課題組在成功建立的MSC肝向分化模型基礎(chǔ)上，利用miRNA芯片技術(shù)共檢測了1 205個人類已知的和144個人類病毒相關(guān)miRNA分子在肝向分化7個不同時間點(diǎn)的表達(dá)變化情況。依據(jù)差異倍數(shù)和表達(dá)含量、實(shí)時定量PCR驗(yàn)證，并與骨向分化、肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的miRNA譜對比，確定了7個高表達(dá)miRNA和8個低表達(dá)的miRNA，為肝向分化特異性的miRNA表達(dá)譜[8]。包含miRNA干擾序列的慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，抑制高表達(dá)miRNA分子中的任意一個均可以抑制MSC的肝向分化，說明miRNA分子在MSC肝向分化過程中發(fā)揮重要作用。將miR-122、miR-1246、miR-1290、miR-148a、miR-30a、miR-424和miR-542-5p模擬物共同轉(zhuǎn)染入MSC后，可以促使MSC高表達(dá)肝臟特異性早、中、晚期標(biāo)志分子，而不表達(dá)肝祖細(xì)胞、胰膽上皮標(biāo)志分子；使MSC的細(xì)胞形態(tài)從間質(zhì)樣向上皮樣轉(zhuǎn)化，并具有肝細(xì)胞特異性的功能。移植入肝損傷裸鼠體內(nèi)后，不僅可以發(fā)揮肝細(xì)胞的功能，即改善小鼠肝功能，還可以發(fā)揮部分MSC的功能，修復(fù)小鼠肝組織[9]。課題組進(jìn)一步通過系統(tǒng)優(yōu)化，創(chuàng)建了更優(yōu)化的miRNA組合體系，該組合(miR-122、miR-148a、miR-424、miR-542-5p和miR-1246)不僅可以將MSC直接轉(zhuǎn)化為功能性肝細(xì)胞，提高M(jìn)SC向肝細(xì)胞分化的效率，縮短誘導(dǎo)分化時間，也可以提高M(jìn)SC的抗肝纖維化能力[10]。

4 干細(xì)胞移植可以改善肝臟微環(huán)境，促進(jìn)肝再生，減輕肝纖維化

干細(xì)胞移植不僅可以提升患者的肝功能，并且可以改善肝組織學(xué)。課題組將CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠隨機(jī)分為干細(xì)胞移植組和對照組。天狼星紅染色和Masson三色染色結(jié)果顯示，移植后2周，干細(xì)胞移植組大鼠的肝纖維化程度較移植前明顯減輕，移植后4周，肝纖維化基本消失。而對照組肝纖維化程度較移植前無明顯變化。肝纖維化統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，移植前大鼠肝纖維化程度為(9.3±1.9)%，干細(xì)胞移植4周后，大鼠肝纖維化程度下降為(2.1±0.9)%，較對照組[(11.2±2.3)%]明顯減低(P<0.01)。移植組大鼠肝組織中肝纖維化相關(guān)分子Fibronectin、α-SMA和TGF-β的表達(dá)基本消失[11]。干細(xì)胞回輸治療可以修復(fù)肝組織學(xué)的證據(jù)在臨床標(biāo)本中也得到了進(jìn)一步證實(shí)。有研究小組進(jìn)行了自體骨髓MSC治療酒精性肝硬化的隨機(jī)對照試驗(yàn)研究(對照組24例，1次干細(xì)胞治療組21例，2次干細(xì)胞治療組23例)，結(jié)果顯示，干細(xì)胞移植治療12個月內(nèi)的CTP評分穩(wěn)定改善，且肝臟膠原面積降低。且2次治療組較1次治療組在修復(fù)肝組織學(xué)方面效果更顯著[12]。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)移植組大鼠肝組織中肝細(xì)胞再生指數(shù)Ki-67的表達(dá)較對照組明顯增加，提示干細(xì)胞移植在修復(fù)肝組織的同時，能促進(jìn)自身固有肝細(xì)胞的再生[11]。此前德國學(xué)者將3名右葉肝癌以備擇期行右葉切除的患者的骨髓干細(xì)胞進(jìn)行分選，將分選出的CD133+的骨髓干細(xì)胞通過門靜脈注入到肝左葉，發(fā)現(xiàn)回輸3周后肝左葉較治療前明顯增大，其肝葉的再生速度是未移植組的2.5倍[13]。說明移植的骨髓源性干細(xì)胞在促進(jìn)肝細(xì)胞再生方面發(fā)揮重要作用。

干細(xì)胞通過改善肝臟免疫微環(huán)境改善肝臟纖維化。課題組研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，乙肝相關(guān)性失代償性肝硬化患者的多種免疫因子如IL-17明顯升高。而MSC移植后IL-17顯著降低，并且外源性干預(yù)IL-17的水平可直接影響MSC對肝纖維化的治療效果，提示MSC通過降低炎性細(xì)胞因子IL-17的水平修復(fù)了肝纖維化[14]。此外，MSC可以分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1等)，直接降解胞外基質(zhì)，減輕肝纖維化[15]。

為闡釋MSC抗纖維化機(jī)制，靶向提高M(jìn)SC抗纖維化效率，課題組應(yīng)用免疫組織化學(xué)、基因芯片等方法篩選到了MSC治療肝硬化的重要因子即TSG-6，發(fā)現(xiàn)敲減掉MSC的TSG-6基因后，MSC的肝硬化治療效果明顯減弱。進(jìn)一步以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為生物模板，制備了磷酸鈣納米顆粒(CaP@BSA NPs)，并負(fù)載TSG-6，即CaP@BSA-TSG-6。該體系提高了肝臟靶向性和TSG-6載藥率，并可改善肝纖維化[15]。

綜上所述，在系列課題的資助下，經(jīng)過課題組研究人員的不懈努力，干細(xì)胞用于肝臟疾病的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究取得了一定的進(jìn)展。干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后，可向損傷肝臟遷移、通過轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞發(fā)揮部分替代作用，通過免疫調(diào)節(jié)作用從一定程度上改善肝臟微環(huán)境，促進(jìn)肝損傷修復(fù)，但其替代作用能發(fā)揮多大、持續(xù)多久，通過什么措施能增強(qiáng)其替代作用，具體通過什么細(xì)胞、什么通路調(diào)節(jié)肝臟微環(huán)境等系列問題尚值得進(jìn)一步探討。依據(jù)干細(xì)胞的定義和特性，干細(xì)胞似乎可以完全解決肝細(xì)胞移植時細(xì)胞不足以及人工肝治療種子細(xì)胞的問題，但在實(shí)際應(yīng)用中，存在分化機(jī)制不清、分化程度不足、分化效率低下等問題。此外，在干細(xì)胞規(guī)范用于肝病治療之前，仍然需要大規(guī)模、多中心、長期隨訪的臨床研究以進(jìn)一步確認(rèn)干細(xì)胞應(yīng)用的有效性和安全性，進(jìn)一步標(biāo)化種子細(xì)胞選擇、介入時機(jī)及介入手段等系列問題。