李月明，畢延震

（1.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所∕動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.武漢大學生命科學學院，武漢 430072）

生豬產業(yè)關乎民生大計，對促進國民經濟平穩(wěn)發(fā)展、保障糧食安全和提高居民生活水平具有重要意義。中國是生豬養(yǎng)殖與消費大國，截至2019年，生豬存欄與出欄數分別占世界總量的55.78%和45.08%。然而，種豬進口依然是目前中國改善生豬生產性能的重要方式，大量進口外國豬種導致中國地方豬數量急劇下降，對中國生豬育種和養(yǎng)殖的長遠發(fā)展十分不利［1］。克服中國生豬育種所存在的問題，充分發(fā)揮地方豬肉質好、繁殖力強、適應性好等獨特的種質資源優(yōu)勢，是提高中國豬種國際市場競爭力，促進生豬育種可持續(xù)發(fā)展的必經之路［2］。隨著豬種全基因組測序的完成，基礎研究的不斷深入，越來越多基因功能被注釋，育種水平也從群體水平過渡到分子水平?；蚓庉嫾夹g因其精準性與高效性脫穎而出，成為優(yōu)勢豬種選育的一把“利器”。在實際育種工作中，聯合雜交育種、分子標記輔助育種以及全基因組選擇育種等方法不僅可以突破技術壁壘，還將大大縮短育種時間，結合胚胎工程技術促進優(yōu)勢個體的擴繁，也將不斷推進育種進程［3］。本文對豬生物育種技術的發(fā)展進行簡要概述，并綜述基因編輯技術在豬產肉性能、改善豬肉品質、提高飼料轉化率以及抗病性上的育種進展，預測基因編輯技術和重大基因在未來豬育種工作中的應用。

1 豬生物育種技術發(fā)展概述

生物育種是指利用遺傳學和細胞生物學理論以及現代生物工程技術培育生物新品種的過程。常規(guī)的育種技術是包括雜交育種、分子標記輔助育種和全基因組選擇育種等在內的技術和方法，在以往的優(yōu)良豬種選育工作中被廣泛應用并卓有成效，但這些技術也存在明顯不足。雜交育種可集中親本的優(yōu)良性狀，但育種時間漫長、過程繁瑣；分子標記輔助育種技術具有分子標記數量豐富和可操作性強的優(yōu)點，但一些與目標基因相連鎖的分子標記仍缺乏進一步的研究與驗證，導致結果的可信度不足［4］；相比于分子標記輔助育種，全基因組關聯分析通過對難以測定和選擇的性狀進行分析來控制選配、減少群體近交等問題，早期選擇準確率更高，但價格昂貴，而且分子輔助標記和基因組選擇技術僅用物種自身基因來改良品種，不對外源基因加以利用［5］；基因工程技術的優(yōu)點在于可以跨越物種界限導入外源基因或通過基因沉默獲得優(yōu)勢性狀，中國的生豬育種在該育種技術上取得了一定進展，但存在隨機插入風險和產生脫靶效應問題［6］。因此，僅用以往的育種方法無法滿足當下的實際育種需要。

隨著鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、轉錄激活因子樣效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇規(guī)則間隔的短回文重復序列∕Cas9系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs∕Cas9）基因編輯技術的發(fā)展，人類對基因功能的研究更加深入，從而進一步提高了生豬的育種效率，加快了育種進程［7］。以CRISPRs∕Cas9為代表的基因編輯技術從遺傳學角度上選育優(yōu)勢豬種，相比于ZFNs和TALENs具有識別位點多樣、成功率高、操作簡單、周期短和成本低等優(yōu)勢，在動植物新品種的培育、構建動物模型和基因治療等多個領域具有廣闊的應用前景［8］。不僅如此，CRISPR∕Cas9系統(tǒng)與Cre∕LoxP系統(tǒng)相結合可以刪除標記基因，降低對人類基因組的潛在影響［9］?；贑RISPR∕Cas9系統(tǒng)的單堿基編輯技術利用CBE4和ABE4編輯器，可以將單核苷酸變異引入基因組，在不發(fā)生雙鏈斷裂的條件下產生永久的DNA編輯，提高基因編輯的生物安全性［10，11］。基因編輯技術的不斷發(fā)展與創(chuàng)新將在家畜育種工作中發(fā)揮更大的作用。

2 豬經濟性狀育種進展

2.1 提高產肉性能

隨著生活水平的日益提高，人們對豬肉的需求量不斷上升。根據國家統(tǒng)計局公布數據，2020年豬肉總產量為4 113萬t，而中國全年豬肉需求量約5 500萬t，豬肉供給依然存在較大的缺口［12］。胴體與肉質是衡量養(yǎng)豬業(yè)經濟的重要指標，同時也是開發(fā)地方豬種需要考慮的重要因素。肌抑制素（Myostatin，MSTN）是骨骼肌生長的經典負控因子。利用CRISPR∕Cas9系統(tǒng)對敲除MSTN的雙等位基因，大大提高了巴馬豬、兩廣小花豬和二花臉豬等地方豬的瘦肉率［13-15］。激活素A可以促進MSTN的表達，分別沉默雞和山羊的激活素A受體IIB型（Activin receptor type IIB，ACVR2B），可以引起其肌肉含量顯著升高，該基因為肌肉的負調節(jié)因子，敲除該基因可以作為提高豬產肉性能的一種選擇［16，17］。研究表明，解偶聯蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）是線粒體內膜上的載體，在棕色脂肪組織的非顫抖性產熱中起著重要作用。缺乏UCP1會使仔豬溫度調節(jié)能力變差以及脂肪沉積增加，利用CRISPR∕Cas9系統(tǒng)獲得UCP1-KI豬，UCP1-KI豬的脂肪溶解增加、沉積減少，使之更符合現代人的飲食習慣［18，19］。

2.2 改善豬肉品質

對于豬肉品質的廣泛評價標準包括肉的外觀、適口性和營養(yǎng)價值，肌肉組織結構的肌纖維發(fā)育與肌內脂肪的沉積決定了肉質的肉色、嫩度、風味、多汁性和系水力等關鍵指標［20］。表達Fat-1和Fat-2的轉基因豬，豬肉中ω-3和ω-6的含量顯著提高，為人們提供了一種富含多不飽和脂肪酸的新豬肉品種［21］。過氧化物酶體增殖激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是肌內脂肪生成和脂肪細胞分化的主要調節(jié)因子，PPARγ過表達的大白豬肌內脂肪顯著增加，在保證瘦肉占比不變的情況下，豬肉的口感更為豐富［22］。豬肉貯藏是影響豬肉品質和食品安全的重要因素，鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）廣泛存在于哺乳動物組織中，是鈣蛋白酶的特異性抑制劑，在冷藏條件下肉類宰后貯藏過程中起關鍵作用［23］。CAST在成年豬的表達量顯著增高，對于豬的肌肉剪切力和嫩度具有調控作用，該基因可以為豬肉品質性狀的優(yōu)化育種工作提供參考［24］。豬脂肪干細胞和肌衛(wèi)星細胞中的全轉錄組差異表達分析表明，KLF6是脂肪形成的正調控因子，KLF6下調后脂滴形成顯著下降，可用于減少豬的整體脂肪量，促進低脂肪豬的育種［25，26］。Zhang等［27］通過對2 448頭豬背最長肌脂肪酸組成相關的32個性狀進行全基因組SNP位點分析，發(fā)現ELOVL6、SCD和FASN具有顯著位點，為脂肪酸成分和其他經濟特征的共同遺傳控制提供了新的見解，并為提高豬肉中的不飽和脂肪酸提供了相關基因策略。

2.3 提高飼料轉化效率

飼料成本占養(yǎng)豬成本的70%，提高飼料轉化率是降低養(yǎng)豬業(yè)經濟成本和減少環(huán)境污染的有力手段。飼料轉化率的主要影響因素除了飼料本身和環(huán)境因素，還包括豬自身的身體組分和新陳代謝。研究發(fā)現，通過生物育種技術獲得表達特定酶類的豬種是對飼料中營養(yǎng)物質利用更充分的有效途徑。在腮腺中表達木聚糖酶的轉基因豬與非轉基因豬相比，糞便中的粗蛋白含量降低了15.5%，提高了總能量和粗蛋白的消化率［28］。表達β-葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶的轉基因豬，比野生型豬的糞便氮和磷含量減少23.2%～45.8%，生長速度和育肥出欄速度更快［29］。此外，通過全基因組關聯研究和轉錄組分析，圍繞重要的SNP分布發(fā)現調節(jié)飼料轉化率的候選 基 因 包 括TPH2、FAR2、IRAK3、YARS2、GRIP1、FRS2、CNOT2和TRHDE。TPH2具有調節(jié)豬腸道活力的潛力，GRIP1可能通過影響豬的食欲來調節(jié)飼料轉化率，GRIP1、FRS2、CNOT2和TRHDE可通過甲狀腺激素信號通路調節(jié)各種組織的新陳代謝［30］。利用基因編輯技術驗證上述候選基因的功能和有效性，可以增進對影響豬飼料轉化率遺傳機制的深入了解，有利于優(yōu)化節(jié)糧環(huán)保型豬的育種方案。

3 豬抗病育種進展

傳染性疾病是豬規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的最大威脅，誤食患病豬肉也會對消費者造成極大的安全隱患。就目前而言，大多數疾病多以預防為主，疫苗接種是主要的預防方式，但該方法成本高、效用有限、消耗大量人力和物力。基因編輯技術可致力于傳染性疾病致病機理的研究，為選育和改造出具有抗病性狀的優(yōu)質種豬提供更好的方案。

豬的藍耳病又稱為豬繁殖與呼吸綜合征，其病原為豬生殖和呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），母豬感染后出現呼吸系統(tǒng)疾病、流產和死胎。CD163是該病毒的受體，利用CRISPR∕Cas9系統(tǒng)敲除母豬基因組上的CD163，母豬可免受PRRSV的感染，同時對于沒有敲除CD163的胎兒也具有子宮內保護作用［31］。僅敲除CD163的SRCR5結構域的兩廣小花豬和大白豬可以完全抵御PRRSV-2、JXA1和MY病毒株的感染，在攻毒試驗中未出現臨床癥狀、病理異常、病毒血癥和PRRSV抗體［32］。研究表明，CD163可與宿主蛋白鈣蛋白酶-1相互作用，鈣蛋白酶-1可以促進病毒的脫包被，這一發(fā)現對建立商品化的PRRSV抗性豬系以及進一步研究病毒感染的宿主基因位點提供 了 參 考［33］。CD163和pAPN雙基因敲除豬 對PRRSV和豬三角病毒均具有絕對抗性，為感染機制的研究引入了一個有價值的模型［34］。除此之外，雙crRNAs組 合靶 向PRRSV的ORF5和ORF7的mRNA可以完全清除病毒感染，該方法可以作為一種有效的抗病毒策略［35］。

口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）為正鏈RNA病毒，基因組大小約8.5 kb，是豬口蹄疫的病原，對全球偶蹄動物具有高度傳染性［36］。組織蛋白酶S（Cathepsin S，CTSS）具有抑制病毒復制的作用。過表達CTSS能夠抑制FMDV-O在PK-15細胞中復制［37］。研究表明，草莓缺口同源物2（Strawberry notch homolog 2，SBNO2）在細胞中參與炎癥反應，敲除BHK-21細胞系的SBNO2基因，有抑制FMDV復制的作用［38］。解旋酶DDX23可以參與pre-mRNA剪接，對FMDV核糖體進入位點依賴性翻譯產生負向影響，過表達DDX23可以降低FMDV的復制，對抗FMDV感染的研究具有一定的參考價值［39］。

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的豬急性傳染病，病死率高達100%，能夠致使仔豬腹瀉嘔吐，妊娠母豬流產死胎等癥狀，嚴重影響了全球豬養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益與發(fā)展。研究表明，RSAD2對DNA和RNA病毒均具有抗病毒活性，體外攻毒試驗表明RSAD2的位點特異性整合可以有效減少PRV和典型豬瘟病毒感染［40］。膜蛋白Nectin1和Nectin2被認為是PRV感染的受體，單個基因敲除后的PK-15細胞相較于野生型細胞而言，PRV感染顯著減少，該方法可以用于豬的抗PRV育種研究［41］。PRV感染后，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）能夠誘導產生炎性細胞因子，Caspase-1穩(wěn)定敲除的PK-15細胞可以抑制PRV的復制，并且細胞活力不受影響［42］。除此之外，敲除PK-15的凋亡相關斑點樣蛋白基因也能夠抑制PRV的增殖，并且能夠顯著抑制子代病毒的增殖能力［43］。與之相反，TANK結合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）在抗病毒天然免疫應答和獲得性免疫應答中發(fā)揮重要作用。TBK1穩(wěn)定敲除的PK-15細胞系可以促進PRV復制［44］。敲除豬肺巨噬細胞系的干擾素基因刺激因子基因同樣能夠促進PRV在細胞中復制，這些研究促進了豬種抵御PRV感染分子機制的研究［45］。

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原［46］。SYNGR2主要在神經元細胞突觸囊泡膜中表達，PCV2在SYNGR2敲除的PK-15細胞中病毒量降低，為SYNGR2參 與 促進PCV2感染提供依據［47］。PCV2的衣殼蛋白是一種獨特的結構蛋白，在病毒復制和發(fā)病機制過程中起著關鍵作用。PCV2的衣殼蛋白可以直接與NAP1L4的124-279位的氨基酸殘基發(fā)生相互作用，過表達NAP1L4會導致PCV2的衣殼蛋白表達下調，病毒滴度降低，而敲除NAP1L4后PCV2的基因組DNA拷貝數和病毒滴度增加［48］。PCV2衣殼蛋白的泛素化降解是抑制病毒復制的有效手段。pMKRN1是一種E3連接酶，可以通過泛素化降解PCV2衣殼蛋白，過表達pMKRN1可以減少衣殼蛋白和病毒復制，有助于PCV抗病豬的育種工作研究和對pMKRN1的抗病機制的進一步了解［49］。以上研究策略也可用于開展對非洲豬瘟、豬流感和細小病毒等其他疾病的研究，從而獲得具有抗病能力的育種新材料，在增強種豬抗病性的同時大大減小了飼料藥物添加劑的濫用，從而實現生豬育種的可持續(xù)發(fā)展。

4 討論

針對中國目前的種豬育種存在的外來引種占比高、育種創(chuàng)新性不足這一現狀，育種科研單位和養(yǎng)豬企業(yè)等應更加重視生豬育種問題，挖掘和利用中國生豬品種的遺傳資源以加強育種創(chuàng)新性，進一步提升中國豬種的核心競爭力。在技術層面，盡管基因編輯等技術在育種過程中存在需要改進的地方，但在各個方面均展現出廣闊的應用前景。加大生物育種技術研發(fā)的投入力度，使其朝著更加精準、高效、安全、經濟的方向不斷創(chuàng)新。在完善育種和遺傳評估體系上要做到“在研究上要大膽，推廣上要慎重，管理上要嚴格”［50］。基因編輯技術將推動基礎科學研究的迅猛發(fā)展，也將在促進家畜的繁殖、生長和抗病等育種工作上發(fā)揮重要作用，在構建動物疾病模型和基因治療方面前景可觀。