潘 鈺，夏海華，于 沖，曲曉軍，尹麗穎，葉 陽△

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所微生物藥物學(xué)中心，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗實訓(xùn)中心，黑龍江 哈爾濱 150036)

衛(wèi)計委公布的《既是食品又是藥品的物品名單》中：葛根、姜黃、沙棘均有文獻(xiàn)報道具有護(hù)肝作用，他們均為藥食同源植物，他們的主要護(hù)肝作用成分分別為葛根素、姜黃素、沙棘黃酮或多糖[1-5]。三者可能通過不同的機制起到減輕肝損傷作用，葛根素能抑制甘油三酯合成，具有解酒護(hù)肝等功效作用[6]；姜黃素對肝臟疾病癥狀的預(yù)防和改善作用源于其抗氧化、抗炎癥作用，其護(hù)肝作用主要在于抑制肝纖維化[7]；抗氧化也是多種沙棘活性成分的重要特性，沙棘黃酮具有良好的自由基清除能力及抑制脂質(zhì)過氧化作用[8]。

本研究旨在通過建立CCl4小鼠肝損傷模型，將文獻(xiàn)報道過有護(hù)肝作用的“既是食品又是藥品”的葛根、姜黃、沙棘有效成分組成復(fù)方，探究復(fù)方對小鼠化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)對化學(xué)性肝損傷具有綜合作用的保健食品提供一定的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 葛根素，姜黃素，購自西安瑞林科技有限公司；沙棘黃酮，購自陜西冠晨生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AlanineTransaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AspartateTransaminase，AST)、丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(TotalCholesterol，TCHO)測定試劑盒，購自江蘇南京建成生物工程研究所；Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；四氯化碳(CarbonTetrachloride，CCl4)，購自中國天津富裕華工有限公司。

1.2 動物實驗 雄性昆明種小鼠(KM)，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。將小鼠養(yǎng)在動物室中，自由進(jìn)食、飲水，給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，控制溫度為20～22 ℃，相對濕度為55±10%，光照/黑暗循環(huán)為12 h。在適應(yīng)一周后開始動物實驗。所有程序均符合實驗動物護(hù)理和使用指南。

稱重60只小鼠，隨機分為6組，即空白對照組(Control)，四氯化碳模型組(Model)，葛根素組(Puerarin，簡寫成Pue)、姜黃素組(Curcumin，簡寫成Cur)、沙棘黃酮組(Seabuckthornflavonoids，簡寫成Seaf)、復(fù)方組(葛根素、姜黃素和沙棘黃酮含量1∶1∶1，簡寫成Pue+Cur+Seaf)，葛根素組(Pue)，姜黃素組(Cur)，沙棘黃酮組(Seaf)各組中分別將各材料溶解在蒸餾水中，并使用圓頭喂食針口服給予小鼠。葛根素，姜黃素，沙棘黃酮組中的小鼠給藥劑量為300 mg/kg·d的相應(yīng)材料，復(fù)方組中三種材料的劑量均為100 mg/kg·d(總量為300 mg/kg·d)，連續(xù)15 d，空白對照組和四氯化碳模型組中的小鼠接受等體積的蒸餾水。第15在d，急性肝損傷通過灌胃CCl4(0.4 mL，40%，溶于橄欖油)建立模型，空白對照組小鼠灌胃等量的橄欖油。禁食不禁水16 h后，稱重，用眼科鑷子摘取小鼠眼球采血，采用頸椎脫臼方法處死小鼠，剖開腹腔分離完整肝臟并稱重，計算肝臟/體重比率，即肝指數(shù)。小鼠血液靜置2 h后，通過離心(3000 rpm，10 min)獲得血清樣品，并在-80 ℃下儲存直至測定。收獲肝組織并將部分肝臟樣品固定在2.5%戊二醛溶液中用于組織學(xué)分析，將剩余的肝臟樣品立即浸入液氮中并儲存在-80 ℃直至使用。

1.3 血清酶分析 按試劑盒說明測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量。

1.4 肝臟指標(biāo)測定 肝臟制備10%肝勻漿，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定勻漿液蛋白質(zhì)濃度，按試劑盒說明操作檢測小鼠肝組織中SOD的活性及MDA、GSH、TG和TCHO的含量。

1.5 組織病理學(xué)觀察 將小鼠肝臟切成0.5～1 mm3的小塊，將樣品塊浸入2.5%戊二醛溶液，制作超薄切片后用透射電鏡觀察各組肝臟切片。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方對CCl4急性肝損傷小鼠肝指數(shù)的影響 肝指數(shù)是一與肝臟損傷程度呈正相關(guān)的大體指標(biāo)。與空白對照組相比，四氯化碳模型組小鼠肝指數(shù)顯著升高(P<0.05)。表明小鼠四氯化碳急性肝損傷模型造模成功。各組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠肝指數(shù)(P<0.05或P<0.01)；復(fù)方組和葛根素組、沙棘黃酮組比較，能更顯著降低肝指數(shù)(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

2.2 復(fù)方對CCl4急性肝損傷小鼠血清指標(biāo)AST、ALT活性的影響 與空白組相比，四氯化碳模型組小鼠血清ALT、AST顯著升高(P<0.01)，表明小鼠四氯化碳急性肝損傷模型造模成功。葛根素組，姜黃素組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST(P<0.05或P<0.01)。沙棘黃酮組雖可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠血清AST(P<0.01)，降低ALT無顯著差異(P>0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方能使小鼠血清中ALT、AST活性升高的趨勢下降，且與模型組比較差異有顯著性(P<0.01)(圖2)。

圖2 各組對CCl4急性肝損傷小鼠血清ALT(A)，AST(B)活性的影響

2.3 復(fù)方對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織中MDA、SOD及GSH水平的影響 模型組小鼠肝勻漿MDA含量高于對照組，而SOD、GSH活性低于對照組(P<0.01)，表明本次實驗造模成功。葛根素組，姜黃素組、沙棘黃酮組和復(fù)方組小鼠肝勻漿MDA含量均低于模型組(葛根素、姜黃素、復(fù)方組P<0.01，沙棘黃酮組P<0.05)，復(fù)方組降低MDA含量的效果顯著優(yōu)于其他組；葛根素組，姜黃素組和復(fù)方組肝組織勻漿中SOD活性及GSH水平比模型組顯著升高(姜黃素、復(fù)方組P<0.01，葛根素組P<0.05)；沙棘黃酮組SOD活性與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，GSH水平較模型組顯著升高(P<0.05)；復(fù)方組提高SOD活性和GSH含量的能力相對較高(圖3)。

圖3.各組對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟MDA(A)，SOD(B)和GSH(C)活性的影響

2.4 復(fù)方對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織中TG及TCHO含量的影響 與對照組相比，四氯化碳模型組小鼠肝臟中TG顯著升高(P<0.01)，葛根素組，沙棘黃酮組和復(fù)方組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠肝臟TG含量(P<0.05或P<0.01)。復(fù)方具有最顯著的效果，各組TCHO含量無顯著性差異(圖4)。

圖4 各組對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟TG(A)和TCHO(B)含量的影響

2.5 CCl4急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué) 透射電鏡掃描圖顯示空白對照組小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞核完整，呈圓形，細(xì)胞中有少量脂滴；四氯化碳模型組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生明顯核固縮，脂滴增多，線粒體變性；單一材料處理組選取了單獨作用護(hù)肝效果相對較好的姜黃素組，透射電鏡圖顯示姜黃素組小鼠肝細(xì)胞有較明顯的核固縮癥狀；復(fù)方組小鼠肝細(xì)胞脂滴明顯增多，細(xì)胞核基本完整，形狀不規(guī)則，顯示肝細(xì)胞受到輕微損傷(圖5)。

3 討論

四氯化碳進(jìn)入肝臟后經(jīng)肝微粒體激活后產(chǎn)生了自由基，引起過氧化反應(yīng)，使肝細(xì)胞受損，破壞膜結(jié)構(gòu)，使脂質(zhì)內(nèi)ALT、AST進(jìn)入血液，造成血清ALT、AST活性升高[9]；本研究中四氯化碳模型組小鼠血清ALT、AST含量較對照組顯著升高，葛根素組、姜黃素組和復(fù)方組均可顯著降低四氯化碳所致急性肝損傷小鼠血清ALT和AST，說明這幾種物質(zhì)能起到緩解肝損傷作用，同等含量下沙棘黃酮的護(hù)肝作用相對稍微弱些。同時掃描透射電鏡結(jié)果顯示四氯化碳模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，線粒體變性，脂滴增多，這些都是典型的受到損傷的肝臟細(xì)胞的特征；復(fù)方組透射電鏡結(jié)果顯示肝細(xì)胞損傷程度相對較輕，說明復(fù)方起到了一定的護(hù)肝作用。

氧化應(yīng)激是通過活性氧(ROS)的產(chǎn)生和去除造成的一種不平衡的紊亂狀態(tài)。一方面，活性氧作為氧化代謝的副產(chǎn)物，經(jīng)常損傷細(xì)胞大分子，如DNA，脂類和蛋白質(zhì)[10]。ROS的爆發(fā)能夠造成脂質(zhì)過氧化，表現(xiàn)為MDA水平的升高。在本研究中，四氯化碳顯著增加了肝臟中MDA的含量，復(fù)方組明顯抑制MDA的產(chǎn)生，比葛根素、姜黃素、沙棘黃酮單獨作用效果顯著提升，復(fù)方可減輕肝細(xì)胞過氧化損傷。在本研究中，四氯化碳顯著降低了谷胱甘肽的含量，谷胱甘肽是參與細(xì)胞抗氧化防御的重要分子，還原型GSH通過清除一些過氧化物，與具有毒性的外來的親電子物質(zhì)相結(jié)合，從而維持細(xì)胞和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的完整性[11]，同時也降低了抗氧化酶(SOD)的活性。復(fù)方組顯示具有較強的抗氧化作用，提高了谷胱甘肽濃度，增加了SOD酶活性。研究結(jié)果顯示，四氯化碳模型組與對照組相比，肝臟的TG值會顯著增高，表明四氯化碳明顯影響肝細(xì)胞脂肪代謝。而TCHO的含量并未出現(xiàn)顯著差異，推測是因為影響2種物質(zhì)代謝的原因不一樣，提示肝臟脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，復(fù)方組與模型組比較顯著降低TG含量，起到穩(wěn)定脂質(zhì)代謝作用。

復(fù)方組之所以護(hù)肝效果更好應(yīng)該是多種組分之間相互協(xié)同作用的結(jié)果，中藥抗氧化應(yīng)激和肝纖維化的作用機制特點為多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點，并涉及多種細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)信號分子網(wǎng)絡(luò)[12]。復(fù)方能更好的清除體內(nèi)活性氧自由基，清楚炎癥，阻止機體產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使得抗氧化酶SOD更好的發(fā)揮抗氧化作用。進(jìn)而減少GSH的消耗，而且細(xì)胞內(nèi)GSH合成增多可以明顯抑制肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)的活化。

綜上所述，葛根素、姜黃素、沙棘黃酮組成的復(fù)方可以緩解四氯化碳引起的肝損傷，包括抑制脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激。幾種有效成分物質(zhì)其他的比例是否有更好的護(hù)肝作用和其他潛在機制和信號通路有待進(jìn)一步研究。