黃 菲，周 慧，毛云飛，沈 明，金黨琴，錢 琛

（1.揚州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225127；2.揚州大學(xué)，江蘇 揚州 225002）

神經(jīng)系統(tǒng)用藥是指一類作用于人體中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)，進而產(chǎn)生興奮、抑制、麻醉、鎮(zhèn)痛、修復(fù)等作用的藥物，廣義上包括抗精神病藥、抗抑郁藥、抗焦慮藥、鎮(zhèn)靜催眠藥、麻醉藥、止痛藥、抗癲癇藥、神經(jīng)退行性疾病治療藥、中樞興奮藥以及與之緊密相關(guān)的部分心腦血管系統(tǒng)用藥。［1］此類藥物具有重要的臨床價值，但大多具有一定的成癮性，濫用后極易產(chǎn)生難以逆轉(zhuǎn)的機體或組織損傷，因而被嚴(yán)格管控，其檢測一直都是研究熱點。電化學(xué)方法簡單、靈敏、快速，在該領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，成果豐碩。筆者曾撰寫多篇論文從宏觀層面展現(xiàn)了不同類型神經(jīng)系統(tǒng)藥物電化學(xué)檢測的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。［2～8］但是，如何從微觀細節(jié)方面來科學(xué)、合理地設(shè)計、完成和評價試驗，從整體上總結(jié)共通的規(guī)律，目前尚無相關(guān)報道。鑒于此，本文基于現(xiàn)有成果，結(jié)合筆者多年的實際研究經(jīng)驗，初步探討檢測過程中的一些關(guān)鍵之處，以期能與業(yè)界同仁交流學(xué)習(xí)。

一般而言，電化學(xué)檢測主要包括“目標(biāo)辨識、電極制備、方法選擇、效果評價”四個方面，故本文據(jù)此展開論述。需要說明的是，以液態(tài)汞電極為基礎(chǔ)的極譜分析方法因其嚴(yán)重的環(huán)境污染性已被歷史淘汰，這里就不再討論。

一、目標(biāo)辨識

分子自身的活性是實施電化學(xué)檢測的基礎(chǔ)，很大程度上決定了后續(xù)過程的難度。根據(jù)活性強弱及分子構(gòu)型，神經(jīng)系統(tǒng)藥物可粗略地分為四類。

1.強活性（Active，A型）。A型藥物通常結(jié)構(gòu)簡單，碳鏈較短，具有較多的酚羥基、氨基等電活性基團或叔醇、烯醇等不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，電子轉(zhuǎn)移速率較快，自身及其酸式鹽水溶性較好。A型藥物在電極上一般都能產(chǎn)生良好的伏安響應(yīng)，過電位很低，且測試條件溫和。代表性藥物如：腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)。

2.中等活性（Medium，M型）。M型藥物分子通常具有一定的平面共軛結(jié)構(gòu)或三維畸形空間構(gòu)象。前者分子中大多包含具有孤對電子的S或N原子，具有較強的給電子能力，電化學(xué)過程中容易失去電子形成陽離子自由基。后者由于空間受到一定限制、產(chǎn)生擠壓和變形，分子能量較高，不太穩(wěn)定，也能發(fā)生氧化還原反應(yīng)。它們自身水溶性一般，其酸式鹽卻易溶于水。M型藥物存在一定的過電位，在電極上能產(chǎn)生明顯的伏安響應(yīng)，但往往峰形較差，電流強度偏低。代表性藥物如：吩噻嗪類及二苯氧氮平類抗精神病藥、三環(huán)類抗抑郁藥、β受體阻滯劑、嗎啡類鎮(zhèn)痛藥、可卡因類局麻藥。

3.低活性（Weak，W型）。W型藥物分子中雖然可能存在少量電活性或給電子基團，但環(huán)狀結(jié)構(gòu)過多或碳鏈過長，位阻很大，電子傳遞受到阻礙，若無外部能量輸入，很難發(fā)生氧化還原反應(yīng)。它們水溶性較差，一般也不形成酸式鹽。W型藥物具有很高的過電位，通常只能在高酸度（或堿度）溶液、高氧化（或還原）電位條件下，在特定電極上產(chǎn)生非常微弱的伏安響應(yīng)。代表性藥物如：苯二氮?類鎮(zhèn)靜劑、丁酰苯類及苯甲酰胺類抗精神病藥。

4.非活性（Inactive，I型）。I型藥物分子中既無任何電活性或給電子基團，又沒有高能量、不穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)，故無法發(fā)生氧化還原反應(yīng)，基本上在任何電極上都不產(chǎn)生伏安響應(yīng)。代表性藥物如：氟烷類全麻藥。

總而言之，A型藥物實施電化學(xué)檢測最為簡便，I型藥物則毫無意義，M型和W型藥物需要選擇合適的電極進行檢測。這里有一個經(jīng)驗規(guī)律，即：在不確定藥物類型的情況下，可在pH=1～13的磷酸緩沖溶液中，采用裸玻碳或碳糊電極于-0.4 V至+1.2 V進行伏安掃描，若能發(fā)現(xiàn)藥物分子產(chǎn)生響應(yīng)，就可進行電化學(xué)檢測，反之則很困難。

二、電極制備

工作電極是實施分析測試的工具，直接影響檢測效能，如何構(gòu)建應(yīng)基于藥物分子的性質(zhì)。普通的裸固體電極（金屬電極、碳基電極、離子選擇電極、導(dǎo)電玻璃等）因表面富集、催化、抗污染等性能不足，目前已很少直接用于檢測，取而代之的主要是化學(xué)修飾電極。通過對表面進行適當(dāng)?shù)夭眉艋蚬δ芑?，賦予電極特殊的空腔結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的導(dǎo)電性能、催化活性和分子識別性能，達到靈敏檢測的目的。［9～10］文獻［9～10］對各種修飾電極的制備工藝及影響因素進行了系統(tǒng)總結(jié)，這里不再贅述，主要討論篩選電極的思路。

1.A型藥物。由于其電活性強，可采用的電極范圍廣。通常有如下幾種選擇：第一，藥物水溶性好，電離后易帶電荷，可考慮在電極界面構(gòu)建單層或多層具有羧基、磺酸基的結(jié)構(gòu)，例如表面經(jīng)陽極化處理的熱解石墨電極、3-巰基丙酸自組裝膜修飾金電極、聚對氨基苯磺酸修飾玻碳電極等。在特定酸度的溶液中，利用兩者pKa不同導(dǎo)致所帶電荷相反這種現(xiàn)象，通過靜電吸引作用進行檢測。第二，藥物中活性基團較多，易于氧化，可在電極界面引入含有過渡金屬的催化物質(zhì)，例如普魯士藍修飾電極、雜多酸修飾電極、超分子-過渡金屬配合物修飾電極、金屬-有機框架材料修飾電極等。利用過渡金屬可提供不穩(wěn)定的d軌道單電子充當(dāng)親核試劑或空的價層d軌道作為親電試劑，形成中間產(chǎn)物，降低反應(yīng)活化能，促進氧化還原反應(yīng)進行。第三，利用納米材料及其復(fù)合物自身的電子效應(yīng)、催化效應(yīng)和吸附效應(yīng)，降低藥物分子的過電位，增加峰電流，提高靈敏度。

2.M型藥物。由于其電活性和水溶性一般，選擇工作電極必須有針對性。一般來說，可考慮如下幾種方案：第一，藥物分子自身難溶于水，其酸式鹽卻易溶于水，可在電極界面制備一層具有疏水性的長烷基鏈，例如十六烷基硫醇自組裝膜修飾金電極、十八烷基胺修飾碳糊電極等。在中性或弱堿性水溶液中，質(zhì)子化的藥物分子脫去H+后變成中性分子滲透至密集的烷基鏈中，借助兩者之間強烈的疏水作用進行萃取，實現(xiàn)藥物分子在電極界面的有效富集，增加微區(qū)濃度，進而提高檢測信號強度。第二，在電極界面固定諸如Nafion之類的離子交換樹脂或者杯芳烴、環(huán)糊精、冠醚、卟啉、酞菁之類的超分子結(jié)構(gòu)，利用其與藥物分子之間的親-疏水或者主-客體分子識別作用，通過增強富集效果實現(xiàn)靈敏檢測。第三，和A型藥物類似，采用納米材料修飾電極進行測定，尤其是碳納米管、石墨烯等寬電位窗口、高導(dǎo)電性、強疏水性的碳質(zhì)納米材料，效果顯著。

3.W型藥物。此類藥物電化學(xué)活性低下，水溶性較差，實施檢測的關(guān)鍵在于同時增強富集的有效性和電極的導(dǎo)電性。最常用的對策是采用納米復(fù)合材料，例如“分子印跡膜+貴金屬納米顆?！?、“導(dǎo)電聚合膜+碳納米管”、“離子液體+石墨烯”、“殼聚糖+無機氧化物納米顆?！钡润w系。上述雙元體系中，分子印跡膜具有和藥物分子相匹配的空間結(jié)構(gòu)，可實現(xiàn)專一性識別；殼聚糖具有特殊的生物兼容性，能固定藥物分子；導(dǎo)電聚合膜和離子液體本身就兼具導(dǎo)電性和疏水性。這些物質(zhì)再與納米材料相結(jié)合，就能發(fā)揮協(xié)同作用，增強響應(yīng)信號。

不過，電極制備過程中，有三點需要注意。

一是電極制備的簡便性。相對而言，多組分修飾材料功能要豐富一些，但無謂地增加組分也會降低檢測效能。例如，在常見的“碳納米管+Nafion”體系中，前者起導(dǎo)電、催化作用，后者行使富集功能。如再往體系中添加不導(dǎo)電的殼聚糖，電極的富集功能倒是得到提高，但導(dǎo)電性能卻大幅下降，極大抑制電流信號，靈敏度反而降低。此外，組分越多，由于各自理化性質(zhì)截然不同，導(dǎo)致自組裝、電聚合、電沉積等精細修飾方式難以實施，滴涂、混合等粗放型固定手段則會頻繁使用，極大地影響電極性能的均勻性和穩(wěn)定性。再如，多層膜修飾電極雖然設(shè)計巧妙、結(jié)構(gòu)有序，可以發(fā)展成某些具有特殊功能的分子器件，但結(jié)構(gòu)及尺寸的擴大不僅極大地限制電子的傳遞能力，同樣顯著增加了電極制備難度，除了理論意義外，對檢測并無實質(zhì)性幫助。

二是電極表征的針對性。工作電極制備完成后，并非一定要進行“大而全”式的表征堆砌，應(yīng)著眼性能指標(biāo)進行相關(guān)測試。例如，導(dǎo)電性采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗法足以；親—疏水性可借助接觸角試驗說明；表面形貌通過掃描電鏡和原子力顯微鏡便可直接觀測；修飾材料自身內(nèi)部結(jié)構(gòu)可利用X射線衍射譜、紅外-反射光譜、拉曼光譜、透射電鏡來確定。

三是電極性能的實用性。使用何種工作電極應(yīng)根據(jù)藥物分子自身的性質(zhì)和檢測要求來確定。例如，測定兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，所有電極的檢測限都相差不大，均為10-8～10-7mol/L。此時更適宜采用普通化學(xué)修飾電極，如化學(xué)修飾碳糊電極、自組裝膜修飾電極、導(dǎo)電聚合膜修飾電極等。與之相比，納米材料的合成與組裝不僅煩瑣，且修飾電極的穩(wěn)定性大多不及前者。再如，對于常規(guī)的藥樣分析，檢測限通常只需達到μmol/L級即可，一般的離子選擇電極就能滿足要求，根本無需使用化學(xué)修飾電極。

三、方法選擇

檢測方法關(guān)乎結(jié)果的準(zhǔn)確度及可信度，目前主要采用示差脈沖伏安法和方波伏安法進行定量分析，一般具有高精度、高分辨率的優(yōu)點。但問題在于：一是這兩種方法受背景噪聲影響較大，尤其是在對藥物進行超痕量（n mol/L或f mol/L級）分析時，很難判斷響應(yīng)信號的來源，檢測限不易認定；二是它們僅適用于直接檢測A型、M型和部分W型藥物，對于其它藥物亦無能為力。

一般而言，檢測前會盡可能優(yōu)化及固定各種試驗參數(shù)，比如溶液酸度、緩沖溶液種類和濃度、富集時間及電位、掃描速度等。對于低濃度測定，通常加做空白試驗進行比對，可采用半經(jīng)驗的外推法來預(yù)估檢測限，即：檢測限通常比能直接觀測到的藥物最低響應(yīng)信號強度低0.5～1個數(shù)量級。

對于極低活性的W型藥物，可考慮采用不以伏安或電流為主要響應(yīng)信號的間接測定法。例如，讓藥物分子與某種過渡金屬離子按確定比例形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，通過考察絡(luò)合物的電位響應(yīng)，借助能斯特方程檢測其濃度，進而換算成藥物分子濃度。或者固定金屬離子的濃度，改變藥物分子濃度，通過檢測金屬離子電流或電位的變化值，考察信號變化值與濃度變化值之間的關(guān)系，依此建立濃度分析曲線。再如，對于結(jié)構(gòu)及位阻較大的藥物分子，在電流和電位都不易測定的情況下，可利用其自身的體積效應(yīng)，選擇特定電化學(xué)探針，通過考察電極容抗或阻抗的變化值來進行測定。當(dāng)然，間接測定法的檢測限都不會太低，一般只能達到μmol/L級。如果要進行低濃度測定，那就只能采用電致化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)免疫分析之類的高靈敏度分析方法了。

四、效果評價

電化學(xué)檢測完成后需要對試驗進行客觀評價，這關(guān)系到所使用的工作電極和建立的分析方法能否得到推廣應(yīng)用。一般來講，主要指標(biāo)有如下幾個方面。

1.靈敏度。作為最重要的效能指標(biāo)“檢測限”反映了電極的探測能力，理論上越低越好。但是，過分追求較低的檢測限也不足取，這意味著電極修飾的復(fù)雜程度和制備成本會成倍增加，應(yīng)根據(jù)藥物的試樣形態(tài)和活性來確定。一方面，對于普通的藥樣，檢測限為μmol/L級即可；對于血樣、尿樣、唾液樣、腦脊液樣等人體體液樣品，正常應(yīng)達到n mol/L級；而對于糞便樣、毛發(fā)樣等特殊形態(tài)試樣，則需低至f mol/L級。另一方面，正常條件下，對于A型藥物，由于電極反應(yīng)迅速，信號變化太快，檢測限通常控制在10-8～10-7mol/L；對于M型藥物，精細修飾后，電極檢測效能會大幅提升，檢測限可低至10-9～10-8mol/L；而對于W型藥物，由于電化學(xué)反應(yīng)速度過慢，信號難以監(jiān)測，達到10-7～10-6mol/L亦能接受。

2.選擇性。電極分子識別能力的強弱決定了其能否有效應(yīng)對多組分或復(fù)雜樣品分析。根據(jù)經(jīng)驗，正常情況下，一般通過觀察峰電位差值或峰形好壞來判斷電極的選擇性。以雙組分試樣為例，對于結(jié)構(gòu)相似的同系列藥物，如果兩者的峰電位差不低于50 mV，即可認為電極可以區(qū)分。對于非同系列藥物，如果其中一組分產(chǎn)生響應(yīng)，而另一組分50倍濃度于前者情況下都不形成明顯干擾，則可認為電極選擇性良好。需要特別指出的是，對于手性藥物，由于光學(xué)對映體具有完全對稱的分子結(jié)構(gòu)，理論上兩者的電化學(xué)活性完全等同。此時，若采用電化學(xué)方法進行區(qū)分并非良策。這是因為：高效液相色譜、毛細管電泳等傳統(tǒng)手段通常需要在固定相和流動相中借助上萬個塔板對藥物分子進行反復(fù)分配才能加以分離，而電化學(xué)方法僅僅只有數(shù)個塔板和分配機會，其識別能力完全不能和前者相提并論。

3.穩(wěn)定性。使用壽命是決定電極能否商業(yè)化生產(chǎn)的重要指標(biāo)。一般來說，電極連續(xù)使用一段時間后，表面歷經(jīng)多次氧化還原過程，導(dǎo)致修飾層脫落或產(chǎn)生鈍化現(xiàn)象，致使響應(yīng)信號質(zhì)量變差。以電流型傳感器為例，連續(xù)使用4周后，如還能保持信號強度在初始值的90%以上，就可認為電極具有高穩(wěn)定性。事實上，由于組裝方式的巨大差異，納米材料修飾電極的穩(wěn)定性一般不如傳統(tǒng)的化學(xué)修飾電極，不僅膜層易發(fā)生脫附，表面也容易老化失活，不宜長時間使用和貯存。

4.再現(xiàn)性。檢測結(jié)果能否重現(xiàn)關(guān)系到檢測方法的可靠性。一般來說，在外部環(huán)境、試驗條件、人為操作沒有明顯異常的情況下，再現(xiàn)性與電極的穩(wěn)定性息息相關(guān)，穩(wěn)定性高，再現(xiàn)性好，反之亦然。通常，同一試樣經(jīng)5～8次平行測定后，所得結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如不高于5%，則可認為電極具有較高的再現(xiàn)性。

5.再生性。電極表面的可更新能力極大影響檢測效率及結(jié)果的再現(xiàn)性。通常來講，每次測試完成后，電極在空白溶液中經(jīng)過數(shù)次循環(huán)掃描，其性能如能恢復(fù)到使用前狀態(tài)，就能判定具有良好的再生性。一般而言，借助親-疏水作用、分子印跡或免疫傳感等技術(shù)進行檢測識別的電極，由于分子間相互作用過于強烈，結(jié)合力大，不易洗脫，因而再生性要差一些，基本上屬于一次性使用，再次測試前電極需重新制備，極其煩瑣耗時。

6.線性范圍。工作曲線是進行定量分析的基礎(chǔ)。濃度線性范圍一般越寬越好，利于擴大適用面。通常在低濃度段和高濃度段各自會出現(xiàn)一個線性區(qū)間，相對而言，前者更具有實際意義。

7.準(zhǔn)確度、精密度。準(zhǔn)確度和精密度關(guān)系到檢測方法的公信度。普通的加標(biāo)回收試驗不足以說明其有效性，較為理想的做法是設(shè)置一定的置信區(qū)間，采用數(shù)理統(tǒng)計中的F檢驗和t檢驗，比較所提方法與經(jīng)典方法所得結(jié)果，如兩組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，則可判定檢測方法較為可靠。

8.適用性。對不同環(huán)境的適用性反映了工作電極和檢測方法的實用價值，尤其是面對復(fù)雜的生物樣品。單純的藥樣分析因試驗條件過于理想，局限性太強，僅具有理論意義。