徐紅艷 張守華 黃 慧 雷 俊 綜述 梅金紅 審校

小分子RNA(microRNA，miRNA)被稱為微小RNA，目前已經(jīng)在自然界中的哺乳動物、植物以及線蟲等真核生物中鑒定發(fā)現(xiàn)超過千種miRNAs[1]。微小RNA作為一類長度在19～22個核苷酸大小內(nèi)源性非編碼的一組遺傳基因，其作用主要是通過與下游靶基因信使脫氧核糖核酸(mRNA)堿基進(jìn)行配對從而抑制轉(zhuǎn)錄或阻礙蛋白翻譯過程，并在轉(zhuǎn)錄后水平起到對靶基因表達(dá)的有效控制。相關(guān)研究資料顯示，在人類基因組中，有接近1/3為微小RNA的靶基因[2]。而在最新的研究中，提示這類遺傳因子可能通過全方位、多層次的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)而扮演著在基因表達(dá)調(diào)控過程中的分子開關(guān)角色，并且同動植物的一系列生理學(xué)和病理學(xué)過程緊密相關(guān)，諸如胚胎發(fā)育、器官生長、細(xì)胞的增殖、分化、自噬和凋亡、免疫應(yīng)答以及脂肪代謝等生命活動[3]。既往大量研究表明，miRNAs的異常表達(dá)在腫瘤的形成和進(jìn)展過程中起到了十分關(guān)鍵的作用，其中諸多miRNAs在某些類型腫瘤中體現(xiàn)了表達(dá)特異性，因此為臨床腫瘤患者接受有效的靶向治療提供了機(jī)會[4]。

1 miRNAs生物學(xué)特點(diǎn)

1.1 結(jié)構(gòu)及合成

據(jù)推測多數(shù)已鑒定的miRNAs具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，miRNA的合成初始步驟為發(fā)生于細(xì)胞核中的多級式反應(yīng)過程[5]。在細(xì)胞核中，約70個堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA最初由核糖核酸聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉(zhuǎn)錄形成初級miRNA(Pri-miRNA)，其在受到酶-蛋白復(fù)合體(Drosha酶-DGCR8)的作用下，形成長度71～85個核苷酸大小的含缺陷莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(Pre-miRNA)。隨后該pre-miRNA在Ran/GTP及Exportin-5的輔助作用下向胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，到達(dá)胞質(zhì)后的pre-miRNA由Dicer酶剪切為大約22個核苷酸長度的雙鏈miRNA，這陣雙鏈微小RNA中一條單鏈可選擇性的同RISC(RNA-induced silencing complex)發(fā)生結(jié)合，最后形成成熟的微小RNA分子，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能的作用[6]。

1.2 生物學(xué)功能

從物種進(jìn)化角度分析，微小RNA顯示出了高度保守性，這意味著miRNAs在細(xì)胞的各項(xiàng)功能活動中起到了十分重要的調(diào)控作用。miRNA同RISC的結(jié)合過程，可通過與下游靶基因發(fā)生互補(bǔ)或非完全互補(bǔ)方式的識別和結(jié)合，通過RNA干擾途徑導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，或引起靶基因mRNA直接發(fā)生裂解或阻抑蛋白的翻譯過程，由轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7]。基因表達(dá)受到miRNA所節(jié)制，多個基因可受到某一種miRNA的調(diào)控作用，而同一個靶基因的表達(dá)可受到多個miRNA的組合調(diào)控而實(shí)現(xiàn)精密調(diào)控[8]。盡管目前已經(jīng)認(rèn)識鑒定了人類超過幾百個miRNA基因，隨著近年來計(jì)算機(jī)信息技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)過精密的推算，在人類基因組中有超過1000個微小RNA，其中有某一個微小RNA能夠調(diào)節(jié)超過200個下游靶基因，并且有接近30%的蛋白編碼基因的表達(dá)受到miRNA所調(diào)節(jié)。這些研究均顯示出這類遺傳因子在基因表達(dá)調(diào)節(jié)領(lǐng)域所扮演的關(guān)鍵角色。國際上大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9]，miRNAs往往存在于這些生物細(xì)胞染色體的相關(guān)脆性位點(diǎn)或出現(xiàn)雜合子缺失，并參與到調(diào)控組織細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)活動中，包括細(xì)胞的增殖、分化及凋亡活動，并且被證實(shí)同人類惡性腫瘤、糖尿病、關(guān)節(jié)炎以及紅斑狼瘡等疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，但是miRNA在這些疾病中所發(fā)揮的作用及具體分子機(jī)制仍不明確。

1.3 失調(diào)分子機(jī)制

既往miRNA與腫瘤性疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究能夠清晰闡明miRNAs表達(dá)失調(diào)相關(guān)分子機(jī)制，對人類認(rèn)識腫瘤的起病和發(fā)展的具體過程、提升腫瘤的診斷水平以及找到更加高效的治療靶點(diǎn)等有重要的意義。研究證據(jù)表明[10]，微小RNA表達(dá)失調(diào)的因素多種多樣，歸納其主要原因包括：基因轉(zhuǎn)位、DNA甲基化、基因擴(kuò)增、癌性轉(zhuǎn)錄因子活化、低氧狀態(tài)、miRNA點(diǎn)突變或基因多態(tài)化以及致癌病毒蛋白產(chǎn)物等。

2 miRNAs在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

2.1 miRNAs與肝癌的發(fā)生

肝癌作為一種原發(fā)于人類肝臟的惡性腫瘤，其發(fā)病因素較多，最常見的因素有長期過度飲酒、病毒性肝炎、食用霉變食物以及遺傳因素等[11]。大量分子生物學(xué)研究表明，微小RNA同肝細(xì)胞癌的發(fā)病關(guān)系緊密，具體可能同多個不同癌基因、抑癌基因及其相應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)和結(jié)構(gòu)異常改變有關(guān)，miRNA在其中不僅可扮演癌基因發(fā)揮致癌作用，還可參與到抑癌基因相關(guān)途徑發(fā)揮抗癌作用[12]。國外的相關(guān)研究分別對肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的189個miRNAs分子表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于正常肝細(xì)胞中miR-221表達(dá)水平，肝癌組織中表達(dá)明顯增高，接近正常肝細(xì)胞的9倍[13]。值得引起注意的是，當(dāng)肝細(xì)胞中miR-221表達(dá)水平增高時，可引起PTEN基因蛋白表達(dá)減少，提示miR-221的靶向目標(biāo)分子可能為PTEN。而在相關(guān)研究中[14]，高水平表達(dá)的miR-221可起到對PTEN基因翻譯過程的抑制作用，該基因表達(dá)受阻可觸發(fā)一系列細(xì)胞多種生物學(xué)行為，包括增殖活動、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及侵襲浸潤等，由此推測miR-221可能在肝細(xì)胞癌的起病和發(fā)展過程中起到了始動效應(yīng)。國外相關(guān)研究中[15]，某課題組應(yīng)用致癌藥Tamoxifen對大鼠進(jìn)行飼喂若干周后，誘導(dǎo)獲得肝癌大鼠模型，分別在12周和24周檢測荷瘤老鼠肝臟組織細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)同正常對照組相比，肝癌組大鼠中有34個(21個表達(dá)增加，13個下調(diào))miRNAs呈異常差異化表達(dá)，其中部分被視為癌基因的miRNAs均呈現(xiàn)明顯過表達(dá)[16]，包括miR-16、miR-21、miR-17-5p、miR-20b、miR-34、miR-106a以及miR-146a等。同時研究還發(fā)現(xiàn)這些miRNAs所對應(yīng)的Bcl-2、Notch1、E2F1以及RB1等多個下游靶基因蛋白的表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢，而這些活性蛋白對細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)修飾、DNA復(fù)制及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均有重要影響。除了上述幾種miRNAs外[17]，還檢測到包括miR-18、miR-31、miR-25、miR-15a、miR-193、miR-345、miR-193、miR-375在內(nèi)的16個miRNAs表達(dá)上調(diào)，同時還檢測到包括miR-27a、miR-28、miR-361、miR-195、miR-350、miR-203以及miR-191在內(nèi)的14個miRNAs表達(dá)下調(diào)，同時指出miRNA的異常差異化表達(dá)開始于腫瘤形成的初始階段，是一類在評估腫瘤形成過程的重要潛在生物學(xué)標(biāo)志物，可為肝癌的預(yù)防、診斷和靶向治療提供重要依據(jù)。

2.2 miRNAs與肝細(xì)胞癌分化

國外研究學(xué)者對入院治療的28例肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、24例HCC周邊正常組織(Normal tissue，NT)及11例慢性肝炎(Chronic hepatitis，CH)進(jìn)行粗針穿刺后，通過芯片技術(shù)檢測分析其miRNAs表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組同NT組相比，一共有32個miRNAs存在明顯差異[18]。研究表明，相對于NT組檢測結(jié)果，HCC組表達(dá)呈現(xiàn)出顯著增高的miRNA共有3個：分別為miR-18、miR-224及pre-miR-18，存在顯著下調(diào)的一共有5個：分別為miR-125a、miR-192-3p、miR-165a、miR-222和miR-200a[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)同HCC分化程度存在一定相關(guān)性的miRNAs有3個：分別為miR-18、miR-92、pre-miR-18，這些異常因子的表達(dá)量在分化差的HCC組織中最高，在分化好的HCC組織中處于低水平[20]；而miR-92的實(shí)際表達(dá)量同癌細(xì)胞的分化程度呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性。由此認(rèn)為，miR-18可能在HCC的發(fā)生和分化成熟過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。此外，研究人員對入院患者中16例肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和14例CH樣本進(jìn)行分析，結(jié)果一共找到14個miRNAs呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)差異，其中LC組的miR-28、miR-143、miR-126、miR-199a以及miR-145b等8個表達(dá)明顯高于CH組；而miR-182、miR-15b以及miR-224等6個較CH組表達(dá)明顯降低。而在對入選HCC患者的病因?qū)W分析中[21]，研究組發(fā)現(xiàn)伴HBV或HCV感染的HCC組miRNAs表達(dá)譜之間并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。國外某課題組進(jìn)行的大鼠對照研究中，應(yīng)用含246種不同miRNAs的芯片分別對正常大鼠肝臟和葉酸、甲基、膽堿缺乏性大鼠肝腫瘤模型的微小RNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析，結(jié)果在腫瘤組中一共發(fā)現(xiàn)了26種表達(dá)增加，3個表達(dá)下調(diào)。在臨床實(shí)驗(yàn)中[22]，研究者應(yīng)用miRNA芯片檢測42例肝細(xì)胞癌組織中的微小RNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)有6種表達(dá)超過正常組兩倍，分別為miR-23a、miR-24、miR-130、miR-130a、miR-328-1和miR-219-1；在所有腫瘤樣本中僅miR-22表達(dá)降低50%，部分miRNA在不同組織樣本中降低程度不一致，如miR-123和miR-235等。國內(nèi)臨床研究報(bào)道中[23]，有學(xué)者對24例肝細(xì)胞癌組織進(jìn)行測定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同癌周肝組織相比較，12例肝癌樣本中的miR-122表現(xiàn)出顯著降低趨勢，在人、大鼠及小鼠的HepG2、H4及H7等多個肝癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)為低表達(dá)或不表達(dá)。有證據(jù)提示[24]，miR-122是肝臟發(fā)育過程具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的“肝特異性miRNA”，對肝臟器官的發(fā)育、分化和結(jié)構(gòu)功能維持有重要作用。在細(xì)胞學(xué)研究中，在大鼠母體置入受精卵后約13天則可在其體內(nèi)檢測到miR-122的表達(dá)；在大量腫瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)中同樣檢測到miR-122的異常過表達(dá)現(xiàn)象，包括肝腺瘤及肝細(xì)胞局部結(jié)節(jié)性增生等[25]。值得關(guān)注的是，一些微小RNA的表達(dá)與肝臟惡性腫瘤有關(guān)危險(xiǎn)因素存在一定關(guān)聯(lián)，以miR-96為例，其表達(dá)變化被證實(shí)同乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染后出現(xiàn)的肝細(xì)胞癌密切相關(guān)；miR-126同酒精性肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)[26]。與此同時，近年來開展的相關(guān)研究大多側(cè)重于miRNA對mRNA功能的調(diào)節(jié)方面，但微小RNA的自身表達(dá)和功能發(fā)揮同時受到其他相關(guān)因素影響的研究尚不多見。

2.3 miRNAs與肝細(xì)胞癌侵襲及轉(zhuǎn)移

miRNAs的異常差異化表達(dá)還同惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性有關(guān)。研究資料表明[27]，導(dǎo)致臨床中肝癌患者死亡的最主要原因是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)，因此相關(guān)領(lǐng)域研究專家致力于探索某些特定miRNAs表達(dá)水平同肝細(xì)胞癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和侵襲性之間的關(guān)聯(lián)。國外某研究小組[28]在收集獲得的452個HCC癌性樣本(分為侵襲性樣本和非侵襲性腫瘤組織樣本)和260個非癌性樣本(僅為非侵襲性腫瘤樣本)后，應(yīng)用RNA芯片miRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有20種可以作為同腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志物，可用于原發(fā)性HCC的預(yù)測評估，主要包括miR-1-2、miR-194、miR-9-2、miR-207、miR-34a、miR-48b等。但在與之相對應(yīng)的非癌性組織樣本中并未檢測到這些miRNAs的表達(dá)。這些在癌性樣本中的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物顯示出了與臨床中原發(fā)性肝癌患者存活時間及手術(shù)治療后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的緊密相關(guān)性[29]。miRNAs的表達(dá)模式可為研究者鑒定腫瘤及其侵襲轉(zhuǎn)移性提供更為簡單的方式方法。國內(nèi)某課題組的研究中[30]，研究人員應(yīng)用含有145個miRNA的液相芯片和Luminex100檢測系統(tǒng)對20個HCC樣本和20個NT組織進(jìn)行檢測分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其miRNAs表達(dá)譜中有32個呈差異化表達(dá)，其中24個表達(dá)下調(diào)，8個表達(dá)上調(diào)；在其入選所有樣本中，表現(xiàn)為共存性異常表達(dá)的共10個，其中有2個表達(dá)上調(diào)，即miR-222和miR-224，呈下調(diào)趨勢的6個：miR-122a、miR-200a、miR-195、miR-182、miR-15b及miR-199a-3p。選擇呈過表達(dá)的miR-224及其預(yù)測靶基因結(jié)締組織生長因子(CTGF)于兩個樣本采用Wetern blot 和RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證分析[31]，結(jié)果其CTGF中的mRNA表達(dá)水平在HCC及NC組織并不存在差異性，但蛋白水平在原發(fā)性肝癌組顯著降低，推測miR-224是通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制而對CTGF蛋白的表達(dá)起到了阻抑效應(yīng)，最終促進(jìn)了癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和浸潤侵襲。

3 miRNAs在肝細(xì)胞癌中的潛在治療作用

基于miRNA在腫瘤中的重要價值潛力，研究專家們長期致力于miRNA治療腫瘤疾病的研究中。目前此方面的策略主要包括兩個途徑，第一種通過干預(yù)使腫瘤中miRNA表達(dá)下調(diào)，通過轉(zhuǎn)染pre-miRNA而起到對相應(yīng)miRNA表達(dá)的糾正性作用，從而達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞異常增殖和(或)促凋亡目的。如同pre-let-7進(jìn)行干預(yù)可發(fā)揮抗肺癌細(xì)胞株A549增殖作用；第二種策略是利用反義技術(shù)使過度表達(dá)的miRNA下調(diào)。在國外相關(guān)報(bào)道中[32]，研究者通過將已經(jīng)修飾的反義RNA轉(zhuǎn)入至大鼠體內(nèi)，結(jié)果檢測到包括肝臟在內(nèi)多種器官的miR-122、miR-194及miR-16表達(dá)水平均明顯降低。近期研究表明，miR-122在肝臟發(fā)育過程中呈特異性表達(dá)。在動物實(shí)驗(yàn)中[33]，采用miR-122反義寡核苷酸進(jìn)行干預(yù)后，可觀察到其明顯的肝功能改變，如膽固醇的合成水平顯著降低，提示該微小RNA對于肝功能維持正常有重要意義。在肝癌細(xì)胞株MHCC97的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)miR-122a具有調(diào)控細(xì)胞周期蛋白(Cyclin G1)表達(dá)作用，在HCC中二者表達(dá)趨勢顯示出明顯的負(fù)相關(guān)，提示Cyclin G1可能為miR-122a的作用靶點(diǎn)之一[34]。而Cyclin G1同人類基因組的不穩(wěn)定性緊密相關(guān)，并在人乳腺癌等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)異常過表達(dá)。國內(nèi)有關(guān)報(bào)道[35]，指出Stathmin1為miR-223下游的一個作用靶點(diǎn)。Stathmin為一種主要的微管不穩(wěn)定蛋白，可通過磷酸化和去磷酸化作用間接控制細(xì)胞周期作用。大量腫瘤基因?qū)W實(shí)驗(yàn)表明[36]，該蛋白的在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在異常過表達(dá)現(xiàn)象，通過干預(yù)抑制其表達(dá)后可起到一定的抗腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移作用。以上研究結(jié)論均提示我們，采取一定措施干預(yù)HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的某些“原癌基因”或“抑癌基因”的miRNAs表達(dá)，有望為今后實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞癌病患接受更加有效的基因靶向治療奠定基礎(chǔ)。

基于近年來國內(nèi)外有關(guān)miRNA參與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)研究，其作用已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，但其表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生過程的具體機(jī)制仍然有待進(jìn)一步的研究。目前的研究，已經(jīng)對轉(zhuǎn)錄異常、基因突變、miRNA生物合成過程中關(guān)鍵酶缺陷、表觀遺傳型改變以及DNA拷貝異常等多種調(diào)節(jié)機(jī)制有了初步認(rèn)識。在腫瘤的診斷中，目前miRNA的應(yīng)用仍然存在一定局限性，如通過小樣本、單中心的檢查來獲得差異性標(biāo)志物，不能通過大樣本人群進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，其敏感性和特異性結(jié)果存在較大差異。目前miRNA在肝臟惡性腫瘤領(lǐng)域的研究尚不成熟，在治療方面仍然處于體外細(xì)胞學(xué)研究和動物實(shí)驗(yàn)階段，某些miRNA類似物及antagomiRNA是否安全和有效性還有待評估驗(yàn)證。將miRNA用作為肝癌診斷、治療及預(yù)后評估的標(biāo)志物仍需克服諸多問題[37]。