何夢蝶 陳家鈴 羅丹 陳丹 洪延涵 劉衛(wèi)

研究白梅花油/白藜蘆醇納米乳（雙白納米乳）的黑素細胞攝取和美白功效。采用流式細胞儀，研究小鼠黑色素瘤細胞（B16F10）對雙白納米乳的攝取行為。采用體外細胞模型和3D黑素皮膚模型，評價雙白納米乳的細胞和皮膚組織模型美白功效。結(jié)果表明，雙白納米乳可顯著提高B16F10細胞的攝取，顯著抑制酪氨酸酶活性、減少黑色素生成及增強細胞抗氧化作用，效果優(yōu)于同劑量游離活性物。3D黑素皮膚模型研究結(jié)果顯示，與陰性對照相比，雙白納米乳能夠顯著提高表觀色度，提升黑素模型的L*值，降低黑素模型黑素含量，效果與陽性對照曲酸相當(dāng)。研究表明，雙白納米乳作為新型美白功效原料具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：白梅花油/白藜蘆醇納米乳；黑素細胞攝取；3D黑素皮膚模型；美白功效評價

皮膚內(nèi)黑色素含量決定膚色深淺，酪氨酸酶被視為黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶，抑制該酶活性直接影響黑色素合成量，抑制酪氨酸酶活性是目前肌膚美白研究和應(yīng)用的重要手段[1]。白梅花為薔薇科植物梅（Prunusmume（Sieb.）Sieb.etZucc.）的干燥花蕾，白梅花油具有抗血小板凝聚、抗抑郁、抗氧化和防止黑色素沉積的作用，其化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、黃酮類以及苯丙素類等[2]。白藜蘆醇是存在于葡萄、虎杖及桑椹等植物中的天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗衰老等生物學(xué)效應(yīng)[3]，研究表明，白藜蘆醇作為一種安全有效的天然植物美白劑具有較好的開發(fā)價值和應(yīng)用前景[4]。

納米乳是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)比例通過高壓勻質(zhì)等技術(shù)制備，呈透明或半透明狀的油水混合體系[5]。納米乳作為皮膚給藥載體具備諸多優(yōu)勢，如納米乳中的表面活性劑可顯著增加脂溶性藥物溶解度，從而增大藥物在皮膚上的濃度梯度；油相和表面活性劑具有皮膚促滲作用；水相能增加角質(zhì)層水化，提高藥物經(jīng)皮滲透能力，包載活性物可經(jīng)毛囊等附屬器滲透進皮膚等[6，7]。功效化妝品活性成分需要進入皮膚，按其功效需要作用于皮膚活性表皮或真皮，并在該部位積聚和發(fā)揮作用[8]?；诒緢F隊前期護膚功效成分納米載體研發(fā)工作基礎(chǔ)[9，10]，本文構(gòu)建了共載負(fù)白梅花油/白藜蘆醇納米乳——雙白納米乳，并對雙白納米乳的黑素細胞攝取行為及細胞和3D黑素皮膚模型的美白功效進行研究和評價，以期為新型美白護膚品的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

01材料與儀器

1.1實驗材料

白梅花油，浙江英樹生物科技有限公司；白藜蘆醇，陜西慧科植物開發(fā)有限公司；三辛酸/癸酸甘油酯，英國禾大；PEG-40氫化蓖麻油，日本日光化學(xué)；1，3-丙二醇、甘油，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明B（RhoB）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶，美國Gibco公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒，購自日本東仁化學(xué)科技有限公司；3%H2O2、α-促黑素細胞激素（α-MSH）、左旋多巴，購自Sigma公司。小鼠黑色素瘤細胞（B16F10），人角質(zhì)形成細胞（HaCaT），購自中國科學(xué)院昆明細胞庫。

1.2主要儀器

高速剪切儀，德國IKA公司；AMH-3微射流高壓均質(zhì)機，安拓思納米技術(shù)（蘇州）有限公司；Zetasizer/Nano-ZS90納米電位粒徑分析儀，英國Malvern公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；BB150CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；CytoFLEX流式細胞儀，美國BeckmanCoulter公司；FV3000激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；多標(biāo)記酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer公司。

02實驗方法

2.1雙白納米乳的制備

稱取處方量白梅花油、白藜蘆醇、PEG-40氫化蓖麻油、1，3-丙二醇和三辛酸/癸酸甘油酯為A相，另稱取處方量甘油溶于適量超純水中為B相，分別于50℃下恒溫水浴溶解，磁力攪拌15min后勻速將B相加入A相中，邊加邊攪拌，繼續(xù)攪拌30min，采用微射流高壓均質(zhì)機均質(zhì)溶液后即得到得雙白納米乳。

2.2粒徑、PDI、Zeta電位

取適量雙白納米乳，超純水稀釋一定倍數(shù)，用納米電位粒徑分析儀測定粒徑、多分散系數(shù)（Polymerdispersityindex，PDI）和Zeta電位，粒徑測定角度為90°，測試溫度為25℃。

2.3細胞攝取研究

2.3.1流式細胞儀檢測細胞攝取行為

稱取適量FITC代替活性物作為熒光標(biāo)記，制備FITC納米載體，并配置等濃度的游離FITC。將B16F10細胞以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板中，孵育24h后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入含相同濃度FITC的游離FITC、FITC納米載體，以未經(jīng)任何處理的細胞作為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)2h和4h后，用冷PBS洗滌細胞，胰酶消化，離心，收集細胞沉淀然后重懸于0.5mL冷PBS溶液中，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)熒光強度。

2.3.2激光共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取行為

將處于對數(shù)生長期的B16F10細胞，以每皿3×105個細胞的密度接種于共聚焦皿中培養(yǎng)24h后，加入含有FITC的游離FITC、FITC納米載體的DMEM培養(yǎng)基分別孵育2h和4h。孵育后棄去培養(yǎng)基并用PBS溶液洗滌細胞3次，然后依次用羅丹明B溶液染色、4%多聚甲醛固定和DAPI溶液染色各15min，使用激光共聚焦顯微鏡在100倍物鏡下觀察拍照。

2.4細胞美白功效評價

2.4.1細胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定

采用L-Dopa氧化法測定細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性[11]。取B16F10以1×105個/mL接種于24孔板中培養(yǎng)24h。按照實驗分組加入100nMα-MSH進行誘導(dǎo)（除正常對照組），構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達模型。再加入500μL含有不同濃度的游離活性物（含有與雙白納米乳相同濃度的白梅花油和白藜蘆醇混合溶液）和雙白納米乳的DMEM完全培養(yǎng)基，對應(yīng)白藜蘆醇的濃度為2、8和32μg/mL，培養(yǎng)48h后，棄去上清液，用PBS清洗3次，每孔加入含1%TritonX-100的PBS緩沖液300μL，置于-80℃冰箱中冷凍1h，隨后室溫融化，將細胞裂解液在12000rpm離心20min，收集上清液。取上清液60μL于96孔板中，加入140μL的0.1%L-Dopa，37℃孵育1h，于490nm波長處測各孔的吸光度。

2.4.2細胞黑色素檢測

采用NaOH裂解法測定細胞內(nèi)黑色的含量[12]。取B16F10細胞以5×104個/mL接種于6孔板中，每孔2mL，培養(yǎng)24h。按照實驗分組加入100nMα-MSH進行誘導(dǎo)（除正常對照組），構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達模型，再加入500μL含有不同濃度的游離活性物和雙白納米乳的DMEM完全培養(yǎng)基，對應(yīng)白藜蘆醇的濃度為2、8和32μg/mL。培養(yǎng)48h后，棄去上清液，用PBS清洗3次后，每孔加入300μL的1mol/LNaOH溶液（含10%DMSO），在80℃充分裂解細胞1h，于405nm波長處測各孔吸光度。

2.4.3細胞抗氧化檢測

參照文獻方法[13]，研究對H2O2氧化損傷HaCaT細胞的保護作用。取處于對數(shù)生長期的HaCaT細胞，以每孔1.5×104個/mL的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，將細胞分為對照組、模型組、給藥組，每組3個復(fù)孔，對照組僅添加DMEM完全培養(yǎng)基，模型組僅添加含H2O2的DMEM完全培養(yǎng)基，給藥組分別加入含有0.8mmol/LH2O2和不同濃度游離活性物和雙白納米乳的DMEM完全培養(yǎng)基（對應(yīng)白藜蘆醇的濃度為2、8和32μg/mL），繼續(xù)孵育24h后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔吸光度，計算HaCaT細胞存活率。

2.53D黑素皮膚模型美白功效評價

參照文獻方法[14，15]，準(zhǔn)備6孔板，每孔加3.7mLM-TA培養(yǎng)液，將氣液面培養(yǎng)第3天即模型接收當(dāng)天的模型轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的6孔板中，每個試驗分組需要6個模型，將所有放有模型的6孔板轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?？瞻讓φ眨˙C）不進行UVB輻照；陰性對照（NC）、陽性對照（PC，曲酸500μg/mL）及1%雙白納米乳（含白藜蘆醇200μg/mL）每天進行UVB輻照處理（50mJ/cm2）。陽性對照組和樣品組在第3天，第5天分別進行兩次給藥，給藥體積為10μL。模型連續(xù)培養(yǎng)7天后，收樣待測。模型培養(yǎng)結(jié)束后，進行表觀色度、表觀亮度（L*）及黑素含量的檢測。

2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均采用X±S表示，組間比較采用單因素方差分析，使用ANOVA法評估兩組結(jié)果差異，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

03結(jié)果與討論

3.1粒徑、PDI和Zeta電位

雙白納米乳為淺黃色透明澄清液體，檢測其粒徑為23.8±0.1nm，PDI為0.178±0.003，Zeta電位為-30.1±0.4mV，雙白納米乳中白梅花油和白藜蘆醇的載負(fù)量分別為5.0%和2.0%。

3.2黑素細胞攝取行為

黑素細胞是美白作用的靶細胞，采用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡研究B16F10細胞對納米載體攝取行為，結(jié)果如圖1和圖2所示。

由圖1可知，孵育2h和4h后，用FITC納米乳處理組的細胞平均熒光強度分別為2938和6364，與游離FITC組相比，其平均熒光強度分別提高了40.98%和61.24%。實驗結(jié)果表明納米乳可以顯著提升B16F10細胞對其包載物的細胞攝取和細胞內(nèi)蓄積。

由圖2可知，隨著時間的延長，孵育4h時的細胞內(nèi)熒光強度明顯強于孵育2h時的熒光強度。孵育相同時間，F(xiàn)ITC納米乳細胞質(zhì)中熒光強度明顯強于游離FITC，而游離FITC主要聚集于B16F10細胞表面。結(jié)果表明，F(xiàn)ITC納米乳能夠被快速攝取進入B16F10細胞。

3.3美白功效研究結(jié)果

3.3.1細胞酪氨酸酶活性的測定

相同白藜蘆醇濃度的游離活性物組和雙白納米乳組對B16F10細胞中酪氨酸酶活性的影響如圖3所示。

由圖3可知，與模型組相比，游離活性物中白藜蘆醇濃度為8和32μg/mL時，雙白納米乳中白藜蘆醇濃度為2、8和32μg/mL時，B16F10細胞酪氨酸酶活性顯著降低（P<0.01）。與游離活性物組相比，雙白納米乳組能更顯著抑制B16F10細胞酪氨酸酶活性（P<0.05或P<0.01）。

3.3.2細胞黑素含量的測定

游離活性物和雙白納米乳對B16F10細胞中黑色素合成量的影響如圖4所示。

由圖4可知，白藜蘆醇濃度為2、8和32μg/mL時，與模型組相比，游離活性物和雙白納米乳能顯著降低B16F10細胞黑素含量（P<0.01）。白藜蘆醇濃度為8、32μg/mL時，與游離活性物相比，雙白納米乳能更顯著地降低B16F10細胞中黑色素合成量（P<0.05或P<0.01）。

3.3.3細胞抗氧化作用的檢測

游離活性物和雙白納米乳對氧化損傷的HaCaT細胞修復(fù)效果如圖5所示。

由圖5可知，模型組HaCaT細胞經(jīng)0.8mmol/LH2O2損傷后細胞存活率下降至45.36%，細胞損傷效果明顯，表明H2O2氧化損傷HaCaT細胞模型建立成功。與模型組相比，游離活性物和雙白納米乳均可顯著提高氧化損傷細胞的活性（P<0.05或P<0.01）。白藜蘆醇濃度為8、32μg/mL時，與游離活性物比較，雙白納米乳對氧化損傷細胞的活性提高更為顯著（P<0.05或P<0.01）。

3.43D黑素皮膚模型檢測結(jié)果

3.4.1表觀色度比較

3D黑素皮膚模型給藥結(jié)束后進行表觀色度檢測，正常組、對照組和雙白納米乳組對3D黑素皮膚模型表觀色度的影響如圖6所示。

由圖6可知，與空白對照（BC）相比，陰性對照組（NC）經(jīng)UVB刺激后，3D黑素皮膚模型表觀色度明顯變黑，表明UVB照射誘導(dǎo)了3D皮膚模型中黑色素的生成。與NC組相比，陽性對照（PC，曲酸）組模型表觀色度明顯變白，說明本次實驗條件有效。與NC組相比，經(jīng)雙白納米乳處理后，3D黑素皮膚模型的表觀色度顯著變白，且與PC組色度相當(dāng)。

3.4.2表觀亮度結(jié)果（L*值）

對表觀色度檢測結(jié)束后的模型進行L*值測定，不同組對3D黑素皮膚模型L*值的影響檢測結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，與BC組相比，NC組經(jīng)UVB刺激后，皮膚模型L*值顯著降低（P<0.01），表明紫外線照射誘導(dǎo)皮膚模型變黑、變暗。與NC組相比，PC組L*值顯著上升（P<0.01），說明本次實驗條件有效。與NC組相比，經(jīng)雙白納米乳處理后，3D黑素皮膚模型的L*值顯著提升（P<0.01），且與PC組的L*值相當(dāng)，表明雙白納米乳具有顯著提升皮膚L*值，提亮肌膚的功效。

3.4.3黑色素含量結(jié)果

對表觀色度檢測結(jié)束后的模型進行黑色素含量測定，不同組對3D黑素皮膚模型黑色素含量的影響如圖8所示。

由圖8可知，與BC組相比，NC組經(jīng)UVB刺激后，皮膚模型的黑色素含量顯著上升（P<0.01），表明紫外線照射誘導(dǎo)了皮膚模型中黑色素的生成。與NC組相比，PC組黑素含量顯著下降（P<0.01），說明本次實驗條件有效。與NC組相比，雙白納米乳對3D黑素皮膚模型黑色素含量降低具有顯著作用（P<0.01），且與PC組黑色素含量相當(dāng)，表明雙白納米乳具有顯著抑制黑色素合成的功效。

04結(jié)論

成功制備白梅花油、白藜蘆醇等皮膚美白活性成分經(jīng)皮共輸送納米載體—雙白納米乳，其平均粒徑為23.8±0.1nm，PDI為0.178±0.003，Zeta電位為-30.1±0.4mV。黑素細胞攝取實驗表明，雙白納米乳可顯著提高B16F10細胞對活性成分的攝取，從而提高活性成分的生物利用度。細胞功效實驗結(jié)果顯示，雙白納米乳具有提高酪氨酸酶抑制率、減少黑色素生成及增強抗氧化的功效，且效果優(yōu)于同劑量的游離活性物。3D黑素皮膚模型實驗結(jié)果顯示，雙白納米乳可明顯改善黑素皮膚模型的表觀色度，顯著提升黑素皮膚模型的L*值及顯著降低黑色素合成量，且效果與陽性對照組曲酸相當(dāng)。研究結(jié)果表明，采用經(jīng)皮共輸送納米載體技術(shù)構(gòu)建的雙白納米乳可顯著增強細胞及3D皮膚模型美白功效，雙白納米乳作為新型美白功效原料具有良好的應(yīng)用前景。