梁文清，劉忠華,，常曉月，何 婷，陳 嘉，馬曉莉，唐兆新*，余文蘭,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642； 2.華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心，廣州 510642)

銅是機體必需的微量元素之一，在增強機體免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝、參與解毒和造血等方面發(fā)揮重要作用[1]。自1945年銅被發(fā)現(xiàn)添加在飼料中對動物具有促生長作用后，含銅添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，但是銅的過量或不合理使用不僅會對動物產(chǎn)生毒性作用，還會通過環(huán)境污染或食物鏈危害人類健康[2]。研究表明，過量的銅主要蓄積在肝組織，高水平銅暴露會造成肝細胞的出血、變性和壞死[3-4]，然而目前高銅對肝的損傷機制尚不清楚。

線粒體自噬是選擇性自噬的一種，可以將受損的線粒體及時清除，是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要途徑。正常生理條件下，線粒體質(zhì)量控制系統(tǒng)積極地發(fā)揮作用，保護線粒體免受應(yīng)激和損傷，當線粒體發(fā)生損傷，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放，線粒體外膜膜電位丟失，線粒體自噬開始啟動調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量。細胞焦亡是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性細胞死亡方式，是Caspase 活化介導的程序性細胞死亡的結(jié)果，表現(xiàn)為細胞膜穿孔，細胞腫脹并破裂，內(nèi)容物的釋放并引起強烈的炎性反應(yīng)。線粒體自噬和細胞焦亡是程序性細胞死亡的不同形式，既是維持機體正常生命活動的保護形式，也可能是機體發(fā)生損傷時的表現(xiàn)，它們可以被多種刺激共同激活，參與多種疾病的發(fā)生或發(fā)展，二者之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控，線粒體自噬和細胞焦亡通路在重金屬中毒性疾病中的研究也得到了廣泛關(guān)注。大量研究表明，線粒體自噬途徑和細胞焦亡參與了多種肝疾病的發(fā)生，并且在不同途徑誘導的肝損傷中發(fā)揮不同作用[5-6]。同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高銅可以誘導線粒體自噬，促進線粒體自噬相關(guān)基因的表達[7-8]。為進一步探究高銅對大鼠肝毒性的作用機制，本研究通過對大鼠連續(xù)灌胃不同水平的銅建立銅的肝毒性模型，檢測線粒體自噬和細胞焦亡途徑相關(guān)基因和蛋白的表達，旨在為臨床銅中毒提供分子病理學研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與設(shè)計

120只4周齡SPF級SD大鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，隨機分為5組(每組24只)，以堿式氯化銅(tribasic copper chloride，TBCC)為銅源，灌胃銅含量分別為：0(對照組，灌胃不含銅的同體積分散劑溶液0.5%羧甲基纖維素鈉)、20(高銅Ⅰ組)、40(高銅Ⅱ組)、80(高銅Ⅲ組)、160 mg·kg-1(高銅 Ⅳ組)，各組大鼠自由飲水、采食，連續(xù)灌胃63 d。大鼠飼料符合國家實驗動物飼料營養(yǎng)標準(GB14924.3—2010)，基礎(chǔ)日糧中的銅含量為10 mg·kg-1。試驗結(jié)束后，用1.5%戊巴比妥鈉按150 mg·kg-1腹腔注射安樂死，分離肝組織，用提前預(yù)冷的生理鹽水沖洗，吸干水后一部分組織用4%多聚甲醛溶液固定，剩余的組織立即儲存在-80 ℃下待用。本試驗經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物福利倫理委員會批準(編號：2019e007)。

1.2 試驗試劑與儀器

TBCC來自北京金潤木豐生物營養(yǎng)科技有限公司。TRIzol、Prime ScriptRTMaster Mix購自TaKaRa公司；2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白一抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；蛋白二抗、預(yù)染Marker、ECL化學發(fā)光試劑盒購于廣州凱閣生物科技有限公司；蛋白定量測試盒購于南京建成生物工程研究所；多聚甲醛購于Sigma公司；切片石蠟、中性樹膠購于國藥集團公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS，購自美國熱電公司；TDZ5-WS型冷凍離心機，購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LightCycler480型熒光定量PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；5200型凝膠成像系統(tǒng)，購自上海醫(yī)科大學儀器廠；Unique-R10型超純水儀，購自廈門銳思捷科學儀器有限公司；DM1000型光學顯微鏡，購自廣州德真科學儀器有限公司。

1.3 肝組織銅含量的測定

采集新鮮肝組織，將收集的組織用微波消解系統(tǒng)進行消化，按照食品安全國家標準GB5009.268—2016《食品中多元素的測定》中ICP-MS法，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS分析樣品中的銅含量[9-10]。

1.4 肝組織病理學觀察

將組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h，組織塊流水沖洗過夜，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片并烘干。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木精核染，鹽酸酒精分色，自來水返藍，伊紅復(fù)染，酒精脫色脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠進行封片，顯微鏡觀察組織病理變化。

1.5 透射電鏡觀察

各試驗組肝組織切碎成小于1 mm3，用2.5%戊二醛固定，用0.1 mol·L-1PBS 緩沖液漂洗4次，每次漂洗15 min；再用1%鋨酸固定過夜后，再用0.1 mol·L-1PBS緩沖液漂洗4次，每次漂洗15 min； 乙醇進行梯度脫水(30%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇)后，用100%丙酮進行脫水2次，將丙酮與樹脂混合液(V/V=3/1)比例滲透4.5 h；丙酮與樹脂混合液(V/V=1/1)滲透過夜，再將丙酮與樹脂按1∶3的比例滲透7 h；用純樹脂進行包埋過夜，用70 ℃聚合24 h。最后用超薄切片機修塊，切片，用醋酸雙氧鈾和與檸檬酸鉛雙染色，晾干后，美國FEI公司的Talos L120C型透射電鏡中觀察。

1.6 實時熒光定量PCR

所測基因序列從GenBank中獲得，選用管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，由上海生物工程有限公司(廣州合成部)合成，Primer Express 6.0軟件設(shè)計。引物序列如表1所示。TRIzol法提取肝總RNA，并用Nanodrop-2000超微量分光光度計檢測RNA的總濃度和純度，RNA反轉(zhuǎn)錄嚴格按照試劑盒說明書進行，生成的cDNA用DEPC水稀釋10倍，采用染料法進行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL：2×ChamQ SYBR premix Ex TaqTM5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共進行40個循環(huán)；檢測相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 基因名稱和引物序列

1.7 免疫印跡分析

取30 mg肝組織，RIPA裂解液(RIPA∶PSMF=100∶1)提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白含量，使用RIPA裂解液稀釋，稀釋后的樣品與4×Loading Buffer以3∶1比例混勻。SDS-PAGE凝膠電泳分離目標蛋白并轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育60 min，用發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.8 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0進行分析。所有組均進行兩兩比較。采用單因素方差分析評價差異。數(shù)據(jù)以“平均值±SEM”表示(n=12)，P<0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織銅含量結(jié)果

隨著灌胃銅濃度的升高，大鼠肝組織中的銅含量呈劑量依賴性增加，高銅Ⅳ組肝組織銅含量較對照組顯著上升(P<0.01，圖1)。

**. P<0.01；*. P<0.05。下同**. P<0.01; *. P<0.05. The same as below圖1 肝組織銅含量Fig.1 Cu content in liver

2.2 肝組織病理學觀察結(jié)果

肝組織病理切片HE染色見圖2。如圖2A所示，對照組的肝細胞排列整齊，以中央靜脈(central veins，CV)為中心，向四周呈放射狀排列，胞核明顯，門管區(qū)(portal area，PT)結(jié)構(gòu)完整。隨著銅含量的增加，門管區(qū)和肝細胞結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯的病理學改變，門管區(qū)小葉間靜脈上皮細胞出現(xiàn)脫落、管壁增厚、炎性細胞浸潤，肝細胞空泡變性等變化。高銅Ⅱ組開始呈現(xiàn)不同程度的肝細胞排列紊亂，并出現(xiàn)肝細胞胞核溶解或消失、空泡變性(紅色箭頭)和出血(藍色箭頭)，PT小葉間靜脈上皮細胞逐漸脫落，特別是高銅Ⅳ組中的小葉間靜脈和小葉間膽管管壁明顯增厚，表現(xiàn)炎性細胞浸潤(如圖2B～E)。結(jié)果表明，高水平的銅暴露會誘導肝組織出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)變化和病理學改變。

2.3 肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

由肝組織超微結(jié)構(gòu)(圖3)可知，銅處理組均出現(xiàn)不同程度的線粒體自噬，高銅Ⅱ組、高銅Ⅲ組出現(xiàn)明顯的線粒體自噬小體，對照組、高銅Ⅰ組、高銅Ⅱ組的線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)都比較正常，而高銅Ⅲ組和高銅Ⅳ組的線粒體出現(xiàn)線粒體空泡、變長、腫脹，脊變少或消失，且高銅Ⅳ組線粒體數(shù)量減少，極少觀察到線粒體自噬小體。

2.4 高銅對肝細胞線粒體自噬的影響

如圖4所示，隨著銅暴露劑量增加，線粒體自噬相關(guān)基因Parkin、Pink1和LC3的mRNA和蛋白表達水平表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，底物蛋白p62的表達趨勢相反。高銅Ⅱ組和高銅Ⅲ組自噬相關(guān)基因PINK1、Parkin和LC3的mRNA和蛋白表達水平高于對照組，且PINK1和LC3的表達量與對照組差異顯著(P<0.05)，而當銅含量超過80 mg·kg-1時，高銅Ⅳ組自噬相關(guān)基因的相對表達量顯著低于高銅Ⅱ組(P<0.05)，p62的表達量表現(xiàn)為先下降后上升。結(jié)果表明，適量的銅可以激活自噬，但長期高水平的銅暴露會抑制自噬通路。

2.5 高銅對肝細胞焦亡的影響

如圖5所示，與對照組相比，隨著肝組織中銅含量的增加，細胞焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表達量呈劑量依賴性增加，與對照組相比，高銅Ⅲ組焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA相對表達顯著升高(P<0.05)，高銅Ⅲ組NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β的蛋白表達極顯著高于對照組(P<0.01)；與高銅Ⅲ組相比，高銅Ⅳ的Caspase-1、GSDMD和IL-18的mRNA相對表達顯著降低(P<0.05)。

A～E. 分別為對照組(0 mg·kg-1)、高銅 Ⅰ 組(20 mg·kg-1)、高銅 Ⅱ 組(40 mg·kg-1)、高銅 Ⅲ 組(80 mg·kg-1)和高銅 Ⅳ組(160 mg·kg-1)。a. 不同組門管區(qū)病理變化(100×)，CV. 中央靜脈；PT. 門管區(qū)。b. 不同組的肝細胞病理學改變(400×)；黑色箭頭指向細胞核；紅色箭頭指向空泡變性；藍色箭頭指向肝出血A-E. Represent control group (0 mg·kg-1), high level copper group I (20 mg·kg-1), high level copper group Ⅱ (40 mg·kg-1), high level copper group Ⅲ (80 mg·kg-1) and high level copper group Ⅳ (160 mg·kg-1), respectively. a. Pathological changes of portal area in different groups (100×); CV. Central vein; PT. Portal area. b. Pathological changes of hepatocytes in different groups (400×); Black arrows point to nucleus; Red arrows point to vacuolar degeneration; Blue arrows point to liver hemorrhage圖2 肝組織病理切片HE染色圖Fig.2 Pathological section of liver tissues

A～E. 分別為對照組(0 mg·kg-1)、高銅 Ⅰ 組(20 mg·kg-1)、高銅 Ⅱ 組(40 mg·kg-1)、高銅 Ⅲ 組(80 mg·kg-1)和高銅 Ⅳ組(160 mg·kg-1)。N. 細胞核；M. 線粒體；黑色箭頭指向線粒體自噬小體A-E. Represent control group (0 mg·kg-1), high level copper group I (20 mg·kg-1), high level copper group Ⅱ (40 mg·kg-1), high level copper group Ⅲ (80 mg·kg-1) and high level copper group Ⅳ (160 mg·kg-1), respectively. N. Nucleus; M. Mitochondria; Black arrows point to mitophagosomes圖3 肝組織超微結(jié)構(gòu)圖(13 500×)Fig.3 Changes in ultrastructure of liver tissue of rats in each group (13 500×)

A～D. Parkin、Pink1 、LC3B、p62的mRNA相對表達水平；E. Parkin、PINK1、LC3B、p62和內(nèi)參β-actin的蛋白條帶；F～I. Parkin、PINK1、LC3B和p62的蛋白相對表達分析。P<0.001，下同A-D. Relative mRNA expression of Parkin, PINK1, LC3B and p62; E. Protein bands of Parkin, PINK1, LC3B, p62 and internal reference β-actin; F-I. The analysis of protein expression of Parkin, PINK1, LC3B and p62. P<0.001, the same as below圖4 不同水平銅暴露對大鼠肝線粒體自噬的影響Fig.4 Effect of different levels of copper exposure on mitochondrial autophagy in rat liver

A～E. NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA相對表達水平；F. NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β及內(nèi)參actin和β-actin的蛋白條帶；G-J. NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的蛋白相對表達分析A-E. Relative mRNA expression of NLRP3, Caspase-1, GSDMD, IL-1β and IL-18; F. Protein bands of NLRP3, Caspase-1, GSDMD, IL-1β, actin and β-actin; G-J. The analysis of protein expression of NLRP3, Caspase-1, GSDMD and IL-1β圖5 不同水平銅暴露對大鼠肝細胞焦亡的影響Fig.5 Effect of different levels of copper exposure on pyroptosis in rat liver

3 討 論

銅是一種常見的有毒重金屬，廣泛分布于各種流域、土壤、空氣等環(huán)境中，通過食物鏈的累積和放大，最終對人和動物的健康造成威脅[11-12]。銅可通過血液循環(huán)，長期銅暴露可對機體肝、腎、腦組織等器官和系統(tǒng)造成不可逆的毒性作用。雷鳴等[13]和趙春雨等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銅會在肝組織蓄積并造成實質(zhì)損傷。研究發(fā)現(xiàn)，雞攝入過量納米氧化銅會造成肝局部出血[15]；大鼠連續(xù)食用高銅飼料(700 mg·kg-1)28 d，肝出現(xiàn)變性、纖維增生和炎性細胞浸潤[16]。本試驗結(jié)果表明，隨著銅暴露劑量的增加，各組大鼠肝組織銅含量也隨之增加，且攝入過量的銅會對肝造成損傷。在正常生理耐受范圍內(nèi)，飼養(yǎng)63 d，高銅Ⅱ組和高銅Ⅲ組銅含量升高不明顯，機體通過正常的代謝可把多余的銅排出體外，但當添加含量達到160 mg·kg-1時，過量的銅會大量蓄積在肝中，并造成肝細胞病變，發(fā)生大面積空泡變性，胞核濃縮甚至消失，門管區(qū)結(jié)締組織增生。

線粒體自噬是控制線粒體質(zhì)量的重要機制，可以清除細胞內(nèi)受損或多余的線粒體，與多種蛋白有關(guān)，其中Pink1/Parkin信號通路是線粒體自噬的經(jīng)典途徑[17-18]。線粒體正常時，Pink1通過線粒體外膜和內(nèi)膜復(fù)合物轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，繼而被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解；線粒體在受到損傷時，內(nèi)膜復(fù)合物功能障礙，通透性發(fā)生改變并去極化，Pink1由線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)到線粒體外膜，Pink1在線粒體外膜集聚并招募胞質(zhì)的Parkin轉(zhuǎn)移至線粒體，Parkin通過磷酸化作用與其結(jié)合，進而泛素化線粒體外膜蛋白，使線粒體被“標記”，啟動線粒體自噬[19-20]。本試驗結(jié)果顯示，隨著銅劑量的增加，肝組織中Pink1和Parkin的mRNA和蛋白表達水平隨之增加，表明銅可誘導肝組織發(fā)生自噬，但隨著銅含量的進一步升高，Pink1和Parkin 的mRNA和蛋白表達量呈現(xiàn)下降趨勢，表明線粒體自噬過程受到抑制或阻滯。微管相關(guān)蛋白1輕鏈 3 (protein light chain3，LC3)通過接頭蛋白p62與被標記的線粒體結(jié)合，分隔膜繼續(xù)彎曲延伸形成線粒體自噬體，最后與溶酶體融合并被降解[21]。自噬發(fā)生時，胞漿型(LC3B-Ⅰ)會轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?LC3B-Ⅱ)，而p62作為自噬底物，表達量會下降。因此，p62和LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值的可作為評估自噬流的標志蛋白[22]。本試驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著銅暴露水平的增加，LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達量增加，而p62蛋白表達下降，而隨著銅的進一步濃度加大，LC3B-Ⅱ/Ⅰ和p62蛋白表達結(jié)果表現(xiàn)相反的趨勢，表明適量的銅可以促進整個自噬過程的發(fā)生，但高水平的銅會抑制自噬的發(fā)生。推測銅的濃度已超過生理耐受范圍，銅對肝細胞的損傷作用過強，導致線粒體功能障礙，線粒體自噬過程已無法完全抵抗銅誘導的損傷，這與Yang等[23-24]的研究結(jié)果一致。

細胞焦亡是另一種細胞程序性死亡的方式，細胞受到內(nèi)源性和外源性信號的刺激，與相關(guān)蛋白組裝成炎性小體，進而激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割pro-IL-1β和pro-IL-18，產(chǎn)生成熟的IL-1β和IL-18，后者作為炎癥介質(zhì)，能誘導其他免疫細胞的聚集，進而放大炎癥反應(yīng)；另一方面，Caspase-1切割GSDMD使其產(chǎn)生具有活性的N端結(jié)構(gòu)域，活化后的GSDMD-N與細胞膜上的磷脂酰肌醇特異性結(jié)合，形成孔道，導致細胞內(nèi)外滲透壓改變，大量水分子進入細胞，細胞腫脹破裂而死[25-26]。其中NLRP3炎性小體是目前研究比較廣泛的一種炎性小體，由NLRP3受體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和 pro-Caspase-1 構(gòu)成，LRP3炎性小體激活產(chǎn)生活化的Caspase-1，從而誘導GSDMD蛋白的裂解，介導細胞焦亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，銅可以調(diào)節(jié)細胞焦亡，用不同濃度的硫酸銅處理雞原代肝細胞，發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18表達顯著上調(diào)；NAC與銅聯(lián)合作用于肝細胞，發(fā)現(xiàn)焦亡相關(guān)基因表達顯著下降，表明銅可通過活性氧誘導雞肝細胞發(fā)生焦亡[27]。由此可見，銅可以通過激活NLRP3炎癥小體，導致肝炎性反應(yīng)，發(fā)揮銅的肝毒性效應(yīng)。本試驗結(jié)果顯示，隨著銅暴露濃度的升高，肝組織中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的基因表達水平升高，NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β的蛋白表達升高。試驗結(jié)果提示銅通過誘導NLRP3炎性小體產(chǎn)生，激活Caspase-1，促進IL-1β和IL-18釋放，從而GSDMD蛋白表達增加，引起肝細胞焦亡，對肝造成損傷。

近年來的研究表明，自噬與焦亡之間存在復(fù)雜的聯(lián)系。研究表明，自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin-1 的缺失可以激活炎癥小體，同時增強了Caspase-1的激活和IL-1β和IL-18的分泌；誘導線粒體功能障礙可通過活化NLRP3炎癥小體誘導細胞損傷，而阻斷線粒體功能障礙可以抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕細胞損傷[28-30]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，當灌胃銅濃度為80 mg·kg-1時，肝組織線粒體自噬水平開始下降，而細胞焦亡水平繼續(xù)升高，表明線粒體自噬的抑制可能可以激活細胞焦亡。然而當銅濃度到達160 mg·kg-1時，線粒體自噬被進一步抑制，但細胞焦亡水平并沒有繼續(xù)升高，也呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢，推測高水平的銅可能通過抑制自噬和焦亡進一步造成機體的損傷，但是具體的機制有待進一步研究。