鄒榮華，吳曉妮，陳啟偉，宮曉煒，王燕萍，鄭福英，儲岳峰

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046)

細菌性腦膜炎是一種較為嚴重的感染性疾病，會危害人類健康，影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1]。在人醫(yī)方面，細菌性腦膜炎是十大引發(fā)高死亡率的感染性疾病之一，且大部分幸存者會有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2-3]。在獸醫(yī)方面，養(yǎng)殖動物由于患腦膜炎失去了其經(jīng)濟價值，給畜牧業(yè)造成較大經(jīng)濟損失。

鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA) 是一種革蘭陰性菌，主要感染雛鴨，導致鴨漿膜炎和腦膜炎。RA也可以感染雞、火雞、鵝、部分野生水禽等多種禽類。感染RA的動物，尤其是易感鴨會出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，包括頭頸震顫或痙攣性點頭、共濟失調(diào)、頭頸歪斜、角弓反張、轉(zhuǎn)圈等，最后衰竭死亡[4]。目前已經(jīng)確定的RA血清型有21種，但每種血清型之間缺乏交叉保護，不利于疫苗免疫的普及。養(yǎng)鴨場在日常飼養(yǎng)中添加抗生素依然是最常用的防治RA的手段，但隨著抗生素的應用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)和播散[5]，給RA病的防控帶來極大挑戰(zhàn)。基于此，篩選并鑒定RA突破血腦屏障(blood brain barrier，BBB)而導致腦膜炎的相關毒力因子，研發(fā)出針對關鍵毒力因子的高免血清，并將其作為阻斷RA感染腦組織的一種生物制品，是一種可行的研究思路。

已有的研究對RA的致病機制了解甚少，僅僅發(fā)現(xiàn)了幾種與RA毒力相關的基因，包括OmpA[6]、VapD[7]、Yb2株的AS87_04050(參與脂多糖合成)[8]和AS87_03730[9]、CH-1株的B739_2187[10]和IX型分泌系統(tǒng)組分[11]。研究者發(fā)現(xiàn),這些基因缺失或突變后，菌株對雛鴨的致病力有不同程度的減弱，但并未說明這些毒力基因是否與RA導致的腦膜炎相關。對于介導RA突破BBB感染腦組織，進而導致腦膜炎的相關毒力因子的研究還未見報道。

當前研究表明，烯醇化酶(Enolase)是介導豬鏈球菌2型突破BBB的毒力因子[12-14]。肺炎鏈球菌Enolase除了利用宿主的纖溶系統(tǒng)促進病原對宿主的入侵外，還可與宿主細胞來源的胞外RNA(eRNA)結(jié)合，進而促進細菌對肺泡上皮細胞的入侵[15]。金黃色葡萄球菌Enolase定位于細菌表面，與宿主細胞外基質(zhì)的一種主要成分層黏連蛋白相互作用，參與細菌的擴散和侵染過程[16]。

迄今為止，關于RA Enolase的生物學功能還未見報道。本研究通過構(gòu)建enolase基因缺失株和回復株，測定菌株的生長速率，對鴨腦微血管內(nèi)皮細胞(DBMEC)的黏附和入侵能力，感染動物的血液及腦組織載菌量，以期明確enolase基因在RA突破BBB中是否發(fā)揮作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 鴨疫里默氏桿菌RA-LZ01菌株(GenBank登錄號：NZ_CP045564.1)保存于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物細菌病創(chuàng)新團隊；大腸桿菌ATCC25922購自美國菌種保藏中心(American type culture collection)；大腸桿菌X7213和自殺質(zhì)粒pRE112均購自NTCC國家典型培養(yǎng)物保藏中心；穿梭質(zhì)粒pCPRA由本實驗室構(gòu)建；Trans-1感受態(tài)細胞購自北京全式金公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)均購自美國 BD difcoTM公司；LB肉湯購自英國Oxoid 公司；瓊脂粉購自北京Solarbio公司；2,6-二氨基更二酸(DPA)購自東京化成工業(yè)株式會社；抗生素購自北京Solarbio公司；限制性內(nèi)切酶SacI、SphI，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；0.22 μm無菌硝酸纖維素膜和過濾器購自美國Millipore公司。

1.1.3 主要儀器 紫外分光光度計和臺式高速離心機購自美國Beckman公司；PCR熱循環(huán)儀購自杭州博日科技公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；搖床購自上海蘇坤實業(yè)有限公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計 引物均用DNASTAR-Editseq軟件進行設計，由西安擎科生物有限公司合成。本研究中所使用的引物和擴增目的片段如表1所示。

1.2.2 鴨腦微血管內(nèi)皮細胞(DBMEC)的培養(yǎng)和鑒定 從櫻桃谷鴨胚中分離出大腦皮質(zhì)，除去腦膜等，反復用PBS沖洗干凈，將組織塊剪成約0.1 cm3的小塊，置于培養(yǎng)瓶中，加入2 mL DBMEC完全培養(yǎng)基，確保不能將組織塊懸浮，倒置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中2 h，然后將細胞培養(yǎng)瓶正置，待組織塊周圍生長的細胞融合成片，即可去除組織塊，用胰蛋白酶消化細胞，重新鋪瓶，傳3～4代，得到符合BMEC形態(tài)的細胞。利用血管假性血友病因子(vWF)免疫熒光染色進行鑒定，得到合適的DBMEC；SV40過表達慢病毒轉(zhuǎn)染DBMEC，利用嘌呤霉素(2 mg·L-1)的篩選培養(yǎng)基進行篩選。以未轉(zhuǎn)染的DBMEC細胞作為對照，該細胞被全部殺滅，而在同一時間點存活的轉(zhuǎn)染了SV40過表達慢病毒的細胞為轉(zhuǎn)染成功的DBMEC，將細胞傳代至12代以上，得到永生化的DBMEC。

1.2.3enolase基因缺失株的構(gòu)建 如表1所示，以親本株RA-LZ01菌株基因組作為模板，用Enolase-p1/Enolase-p2和Enolase-p5/Enolase-p6引物擴增出enolase基因的Enolase-UP和Enolase-DO；以LJW-2菌株基因組為模板，用ErmF-p3/ErmF-p4 引物擴增出ermF抗性基因；通過重疊PCR將Enolase-UP、ermF抗性基因和Enolase-DO依次進行融合，構(gòu)建出打靶片段；用SacΙ和SphΙ將打靶片段克隆進自殺質(zhì)粒pRE112，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌X7213，利用含DPA和氯霉素的LB平板篩選陽性供體菌，再與RA-LZ01菌株共培養(yǎng)，利用含紅霉素和多黏菌素B的TSA平板篩選缺失株，具體方法參考文獻[17-18]。得到的菌株用RA保守引物OmpA-F/OmpA-R、Enolase-p1/Enolase-p6、ErmF-p3/ErmF-p4、Enolase-F/Enolase-R進行PCR鑒定，并對Enolase-p1/Enolase-p6擴增得到的片段進行測序，得到的enolase基因缺失株命名為ΔEnolase。

1.2.4enolase基因回復株的構(gòu)建 用表1中cEnolase-p1/cEnolase-p2引物，PCR擴增出pro+Enolase基因目的條帶(含有enolase基因的啟動子)。將擴增出的片段用PstI和SphI克隆進pCPRA載體中，并轉(zhuǎn)化進X7213菌株中，利用氨芐青霉素抗性篩選供體菌，與ΔEnolase共培養(yǎng)，再利用頭孢西丁和多黏菌素B抗性篩選回復株，方法參考文獻[17-18]。用引物cEnolase-p1/cEnolase-p2、ErmF-p3/ErmF-p4和OmpA-F/OmpA-R進行鑒定，得到的回復株命名為cΔEnolase。

1.2.5 菌株生長曲線的測定 測定親本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase和回復株cΔEnolase 12 h內(nèi)的生長曲線，具體方法參考文獻[17-18]。

1.2.6 菌株對DBMEC的黏附和入侵 將親本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase以及回復株cΔEnolase分別增菌至OD600約為1.0。用無菌0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)調(diào)整至OD600值均為1.0，測定每株菌的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。用無血清內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)基稀釋菌液，用100個MOI(multiplicity of infection)將菌液(1 mL·孔-1)接入鋪滿了單層DBMEC的24孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄上清后用無菌PBS重復洗滌3次，每孔加入1 mL 0.25%的胰酶消化細胞，轉(zhuǎn)移進1.5 mL離心管中，5 000 r·min-1離心后棄上清，并用PBS重復洗滌2次，加入0.5 mL無菌雙蒸水，室溫作用30 min，用PBS以10倍梯度稀釋，涂板于含多黏菌素B的TSA平板上，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落，計算黏附菌株的CFU。每株菌做3個重復，進行3次獨立試驗。

另外，菌液(1 mL·孔-1)接入鋪滿單層DBMEC的24孔細胞培養(yǎng)板中后，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，用無菌 PBS充分洗滌3次后，加入用內(nèi)皮細胞基礎培養(yǎng)基稀釋好的終濃度為100 mg·L-1的氨芐青霉素鈉，0.5 mL·孔-1，孵育1 h后，棄上清，經(jīng)過胰酶消化、PBS洗滌以及雙蒸水作用后，測定入侵菌株的CFU。每株菌做3個重復，進行3次獨立試驗[19-20]。

黏附率和入侵率的計算：黏附率(%)=黏附菌株的CFU/接種菌株的CFU×100；入侵率(%)=入侵菌株的CFU/接種菌株的CFU×100[21]。菌株之間的差異以相對黏附率和入侵率進行比較，把親本株RA-LZ01對DBMEC的黏附率和入侵率設置為100%[21]。

1.2.7 動物試驗 30只7日齡櫻桃谷雛鴨隨機分為3組，每組10只，用親本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase和回復株cΔEnolase對雛鴨進行攻毒，攻毒劑量為107CFU·只-1，攻毒后40 h檢測雛鴨血液和腦組織中的載菌量[4]。

1.3 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)由3次重復試驗結(jié)果得到，數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA進行分析，P<0.05認為差異顯著，具有生物統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 DBMEC的培養(yǎng)和鑒定

利用vWF免疫熒光對傳至12代以上的DBMEC進行鑒定后，對照細胞Vero無綠色熒光出現(xiàn)，而DBMEC觀察到綠色熒光，說明DBMEC攜帶vWF，為血管內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)成功永生化的DBMEC，細胞形態(tài)如圖1所示。

2.2 enolase基因缺失株和回復株的構(gòu)建

用Enolase-p1/Enolase-p6引物擴增出2 025 bp大小的目的條帶(經(jīng)測序確定為打靶片段)；用ErmF-p3/ErmF-p4引物擴增出801 bp大小的ermF基因；用OmpA-F/OmpA-R引物擴增出1 467 bp大小的目的條帶；用Enolase-F/Enolase-R引物未擴增出條帶，說明缺失株ΔEnolase構(gòu)建成功(圖2A)。

用cEnolase-p1/cEnolase-p2引物擴增出1 829 bp大小的目的條帶(測序確定)；用ErmF-p3/ErmF-p4引物擴增出801 bp大小的ermF基因；用OmpA-F/OmpA-R引物擴增出1 467 bp大小的目的條帶，說明回復株cΔEnolase構(gòu)建成功(圖2B)。

2.3 生長曲線的測定

與親本株RA-LZ01相比，在測定的12 h內(nèi)，缺失株ΔEnolase在4～10 h內(nèi)的生長速率顯著下降(P<0.01,圖3)；回復株cΔEnolase的生長速率與親本株相比慢約1 h(達到基本一致的OD600 nm值的時間)，相較缺失株其生長速率稍有提高，但沒有完全恢復。

A. Vero細胞DAPI染色(200×)；B. Vero細胞vWF免疫熒光(200×)；C. DBMEC DAPI染色(200×)；D. DBMEC vWF免疫熒光(200×)；E. DBMEC(200×)A. DPAI staining of Vero cells (200×); B. vWF immunofluorescence from Vero cell (200×); C. DPAI staining of DBMEC (200×); D. vWF immunofluorescence from DBMEC (200×); E. DBMEC (200×)圖1 DBMEC的鑒定Fig.1 Identification of DBMEC

A. enolase基因缺失株ΔEnolase的鑒定；M. DL5000分子質(zhì)量標準；1. Enolas-p1/Enolase-p6引物鑒定(2 025 bp)；2. ErmF-p3/ErmF-p4引物鑒定(801 bp)；3. OmpA-F/OmpA-R引物鑒定(1 467 bp)；4. Enolase-F/Enolase-R引物鑒定。B. enolase基因回復株cΔEnolase的鑒定；M. DL2000分子質(zhì)量標準；1. cEnolase-p1/cEnolase-p2引物鑒定(1 829 bp)；2. OmpA-F/OmpA-R引物鑒定(1 467 bp)；3. ErmF-p3/ErmF-p4引物鑒定(801 bp)A. Identification of enolase gene deletion mutant ΔEnolase; M. DL5000 relative molecular mass standard; 1. Enolase-p1/Enolase-p6 primer identification (2 025 bp)； 2. ErmF-p3/ErmF-p4 primer identification (801 bp); 3. OmpA-F/OmpA-R primer identification (1 467 bp)； 4. Enolase-F/Enolase-R primer identification. B. Identification of the complemented strain cΔEnolase; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. cEnolase-p1/cEnolase-p2 primer identification (1 829 bp); 2. OmpA-F/OmpA-R primer identification (1 467 bp); 3. ErmF-p3/ErmF-p4 primer identification (801 bp)圖2 enolase基因缺失株ΔEnolase和回復株cΔEnolase的鑒定Fig.2 Identification of enolase gene deletion mutant ΔEnolase and complemented strain cΔEnolase

**. P<0.01，下同**. P<0.01, the same as below圖3 親本株、缺失株及回復株生長曲線Fig.3 Growth curves of parent strain, deletion mutant and complemented strain

2.4 菌株對DBMEC的黏附和入侵

與親本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase對BMEC的相對黏附率和入侵率均極顯著降低(P<0.001，P<0.0001)，分別為親本株黏附率的5.9%和入侵率的2.5%；回復株cΔEnolase顯著恢復了對DBMEC的黏附能力，為親本株黏附率的79.6%；幾乎完全恢復了對DBMEC的入侵能力，為親本株入侵率的97.5%(圖4)。

2.5 動物試驗

感染親本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase及回復株cΔEnolase的雛鴨，其血液載菌量差異不顯著；但感染ΔEnolase的雛鴨，其腦組織中的載菌量極顯著降低(P<0.01,圖5)。

3 討 論

細菌導致宿主發(fā)生腦膜炎，首先要突破宿主的血腦屏障(BBB)，進而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和腦膜炎。BBB是指腦毛細血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細胞形成的血液與腦組織之間，以及由脈絡叢形成的血液和腦脊液之間的屏障，BBB也是機體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之一[22-23]。BBB的細胞組分主要包括腦微血管內(nèi)皮細胞(BMEC)、周細胞和星形膠質(zhì)細胞。大量研究表明，BMEC是研究細菌突破BBB的經(jīng)典模式細胞，以宿主的BMEC作為體外細胞模型，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個與細菌侵襲血腦屏障相關的毒力因子[12-13,20-21]。本研究成功培養(yǎng)了DBMEC，用于篩選并鑒定鴨疫里默氏桿菌侵襲鴨BBB的相關毒力因子。

A.血液載菌量；B.腦組織載菌量A. The amount of bacteria in blood; B. Bacterial count in brain 圖5 RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株感染雛鴨血液及腦組織載菌量的測定Fig.5 Determination of bacteria loads in blood and brain of duckling infected by RA-LZ01, ΔEnolase and cΔEnolase strains, respectively

Enolase是糖酵解過程中的關鍵酶，在細胞糖酵解過程中發(fā)揮催化作用，為細菌細胞的生長提供能量[24-25]，廣泛存在于真核和原核生物中。Enolase有3種異構(gòu)體(α、β、γ)，原核生物中一般僅存在α-enolase，因此多種細菌表面存在α-enolase，通常稱為Enolase?，F(xiàn)有研究表明，Enolase是多種細菌的毒力因子，可介導細菌與宿主靶細胞發(fā)生黏附和結(jié)合，在細菌感染宿主過程中發(fā)揮著重要作用。尤其是有研究表明，Enolase可與豬鏈球菌2型(SS2)的BMEC結(jié)合，直接介導SS2對宿主BBB的侵襲；還可以促進IL-8細胞因子的釋放，增強BBB的通透性[12-14]。在肺炎鏈球菌中，Enolase除了能夠利用宿主的纖溶系統(tǒng)促進病原對宿主的入侵外，還可與宿主細胞的胞外RNA(eRNA)結(jié)合，從而促進了細菌對肺泡上皮細胞的入侵[15]。對福賽斯坦納菌Enolase的研究表明，Enolase在細菌感染機體誘導炎癥的過程中發(fā)揮了重要作用[26]。金黃色葡萄球菌的Enolase定位于細菌的表面，與宿主細胞外基質(zhì)的一種主要成分層黏連蛋白相互作用，參與細菌的擴散和侵染過程[16]。Enolase是銅綠假單胞菌RNA降解體的重要組成成分之一，參與銅綠假單胞菌RNA的加工和基因的調(diào)節(jié)過程；Enolase也是銅綠假單胞菌的重要毒力因子，在誘導小鼠急性肺炎模型中發(fā)揮重要作用，缺失enolase基因使銅綠假單胞菌對氧化應激的耐受能力減弱，使得銅綠假單胞菌更容易被宿主體內(nèi)的中性粒細胞所殺傷[27]。

Enolase在已知的測通全序的鴨疫里默氏桿菌中高度保守，核苷酸序列同源性為97.37%～100%，氨基酸序列同源性為93.95%～100%，目前對于該基因的生物學功能還未見報道。本研究構(gòu)建了鴨疫里默氏桿菌的enolase基因缺失株和回復株，對缺失株的生物學表型進行了研究，發(fā)現(xiàn)與親本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase的生長速率顯著變慢，說明enolase基因缺失后會影響RA-LZ01菌株的生長，在RA-LZ01的生長中發(fā)揮重要作用。

對DBMEC的黏附侵襲試驗中，發(fā)現(xiàn)ΔEnolase對DBMEC的相對黏附率和相對入侵率均極顯著降低，而cΔEnolase對DBMEC的黏附侵襲均有回補作用，且其相對入侵率與親本株相比差異不顯著，說明Enolase在RA-LZ01黏附和侵襲DBMEC過程中發(fā)揮重要作用。

為進一步驗證enolase基因缺失后菌株在黏附和侵襲DBMEC中發(fā)生的表型改變，對櫻桃谷雛鴨進行了攻毒試驗，確定各菌株對雛鴨BBB的侵襲能力。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染親本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase及回復株cΔEnolase的雛鴨，其血液中的載菌量沒有顯著差異，說明enolase基因不影響菌株在雛鴨血液中的存活；但與感染親本株和回復株的雛鴨相比，感染缺失株的雛鴨腦組織中的載菌量極顯著下降，且雛鴨的精神狀態(tài)相對較好，說明enolase基因缺失致弱了菌株入侵腦組織的能力，提示enolase基因在鴨疫里默氏桿菌突破BBB中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建了鴨疫里默氏桿菌enolase基因缺失株ΔEnolase和回復株cΔEnolase，發(fā)現(xiàn)enolase基因參與菌株的生長，顯著影響菌株對DBMEC的黏附、入侵以及對雛鴨腦組織的入侵，在鴨疫里默氏桿菌突破鴨BBB中發(fā)揮重要作用。