任 曼，劉 欣，唐玉林，張瑞雪，秦俊杰，朱 浩，郭延生*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021； 2.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102600)

產(chǎn)后奶牛受分娩影響，干物質(zhì)采食量下降，泌乳啟動，能量需求極速升高，極易引起能量負(fù)平衡，誘發(fā)多種產(chǎn)后疾病[1]。瘤胃微生物區(qū)系維系著瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和對飼料的消化能力，因此其變化與奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡密切相關(guān)[2-4]。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)物，約占總揮發(fā)性脂肪酸的95%，反芻動物約75%的能量由其提供[5]，另外SCFAs還參與了腸道免疫和炎癥反應(yīng)[6-8]。在亞洲，中醫(yī)藥被廣泛用于治療畜禽疾病已有數(shù)千年的歷史，中藥口服后其活性成分往往不是直接被宿主吸收，而是被腸道菌群利用和轉(zhuǎn)化后，形成新的活性成分進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮藥理作用[9]。歸芪益母復(fù)方制劑是經(jīng)典方劑歸芪益母散的新劑型，出自《牛經(jīng)備要醫(yī)方》，能補(bǔ)氣活血，可用于治療產(chǎn)后氣虛血虛之證。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，歸芪益母復(fù)方制劑能提高奶牛產(chǎn)后免疫機(jī)能和產(chǎn)奶量[10]，但其作用機(jī)制目前尚未見相關(guān)報道。因此，本試驗(yàn)采用16S rRNA高通量測序和GC-MS/MS靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究了歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃微生物菌群豐度及短鏈脂肪酸含量的調(diào)節(jié)作用，旨在從瘤胃微生物發(fā)酵角度闡明該方劑對產(chǎn)后奶牛的保健機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)分組和瘤胃液樣品采集

從寧夏某奶牛養(yǎng)殖場選取2～3胎次和體況評分相近的19頭臨產(chǎn)健康荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為試驗(yàn)組(G組，n=9)與對照組(B組，n=10)。試驗(yàn)組每頭奶牛產(chǎn)后每日灌服500 mL歸芪益母復(fù)方制劑(黃芪∶當(dāng)歸∶益母草=2∶2∶1，由愛迪森(北京)生物科技有限公司制備，每1 mL相當(dāng)于原生藥0.5 g)，對照組每日灌服等體積飲用水，連續(xù)6 d。試驗(yàn)期兩組奶牛均采用相同全混合日糧(TMR)飼喂。產(chǎn)后第7天晨飼前按參考文獻(xiàn)[11]方法采集瘤胃液，-80 ℃保存。

1.2 瘤胃微生物菌群種類與數(shù)量測定

從瘤胃液樣品中提取瘤胃微生物總DNA(十二烷基硫酸鈉法)，采用16S rRNA法擴(kuò)增V3～V4區(qū)域，引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(3′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′)，擴(kuò)增產(chǎn)物在NovaSeq6000平臺測序，原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)經(jīng)過濾、去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)，Uparse軟件對其聚類為OTUs(97%的一致性)，采用Mothur方法與SILVA132數(shù)據(jù)庫對OTUs進(jìn)行物種注釋。Alpha和Beta多樣性采用Qiime軟件分析，R軟件繪制物種累積箱形圖和主坐標(biāo)分析圖，T-test進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

1.3 瘤胃短鏈脂肪酸GC-MS/MS靶向代謝組學(xué)分析

樣本解凍后混勻，取50 μL于1.5 mL 離心管，加100 μL 36%磷酸溶液混勻，加150 μL含內(nèi)標(biāo)的MTBE溶劑，冰浴超聲5 min；4 ℃條件下12 000 r·min-1離心10 min；取上清液90 μL至進(jìn)樣瓶中，-20 ℃保存。

使用7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，美國，配備有電子轟擊(EI)離子源和四級桿質(zhì)量分析儀)，配合乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸、己酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行GC-MS/MS檢測分析。檢測參數(shù)設(shè)置如下：采用Agilent DB-FFAP色譜柱，1.2 mL·min-1柱流速，2 μL進(jìn)樣量，95 ℃保持1 min后25 ℃·min-1升至100 ℃，再以17 ℃·min-1升至130 ℃，保持0.4 min；以25 ℃·min-1升至200 ℃，保持3.5 min。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)考察線性，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各物質(zhì)的線性回歸方程。利用Agilent MassHunter 定性定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并通過SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)求出P-value，計(jì)算差異倍數(shù)值(Fold Change)，使用Origin 2019b軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛產(chǎn)后各組瘤胃樣本的測序與物種注釋

B組和G組瘤胃液原始序列數(shù)量、過濾和去嵌合體后的有效序列及長度、優(yōu)化比例詳見表1。兩組樣本總OTU數(shù)目為2 478，其中B組和G組檢測到的OTU數(shù)分別是2 240和2 322個，共有OTU數(shù)為2 084，占總OTU數(shù)的82.65%(圖1a)。物種累積曲線已趨于平緩，說明樣本數(shù)據(jù)量充足，可以反映產(chǎn)后7 d奶牛瘤胃微生物種類(圖1b)。

表1 產(chǎn)后奶牛瘤胃液樣本序列信息

圖1 OTU韋恩圖(a)和物種累積箱形圖(b)Fig.1 OTU Venn diagram (a) and species accumulation boxplot (b)

由圖2a可知，在門水平上，B組與G組的優(yōu)勢菌群都是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)，B組中厚壁菌門占比60.19%，擬桿菌門占比33.57%；G組中厚壁菌門占比61.06%，擬桿菌門占比31.44%。在屬水平上(圖2b)，兩組的優(yōu)勢菌屬均為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、克里斯滕森菌屬(Christensenellaceae)和瘤胃球菌科_NK4A214菌屬(NK4A214_group)，其中B組各菌屬平均相對豐度分別為13.62%、12.95%和17.14%，G組平均相對豐度分別為13.24%、13.40%和17.02%。

圖2 基于門水平(a)和屬水平(b)的物種分布圖Fig.2 Species distribution map based on phylum level (a) and genus level (b)

2.2 歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃微生物菌群多樣性的影響

由表2可知，G組奶牛Alpha多樣性指數(shù)中Chao1和ACE較B組顯著升高(P<0.05)，二者均是評估群落內(nèi)OTU 數(shù)目的指數(shù)，說明灌服歸芪益母復(fù)方制劑后奶牛瘤胃菌群總數(shù)顯著升高。Beta 多樣性分析中PCoA可視化了兩組瘤胃樣品微生物群落的差異，可以看出，B組和G組有明顯夾角，表明灌服歸芪益母復(fù)方制劑明顯改變了產(chǎn)后奶牛瘤胃菌群構(gòu)成(圖3)。

表2 瘤胃樣品Alpha多樣性指數(shù)

圖3 兩組瘤胃樣品PCoA圖Fig.3 PCoA images of two groups of rumen samples

2.3 歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃微生物菌群的調(diào)節(jié)作用

T檢驗(yàn)考察了B組和G組在門水平和屬水平上的差異物種，在門水平上，G組變形菌相對豐度極顯著高于B組(P<0.01)；在屬水平上，G組擬桿菌屬(Bacteroides)和Escherichia-Shigella屬的相對豐度極顯著高于B組(P<0.01)，乳桿菌屬(Lactiplantibacillus)和Subdoligranulum屬顯著高于B組(P<0.05)，見圖4。

2.4 短鏈脂肪酸組間差異分析

各短鏈脂肪酸的回歸方程見表3，根據(jù)回歸方程，計(jì)算出了各組奶牛瘤胃短鏈脂肪酸的含量(表4)。由圖5可知，灌服歸芪益母復(fù)方制劑后，G組除己酸外其余6種短鏈脂肪酸含量均高于B組，且丙酸的含量顯著高于B組(P<0.05)；異丁酸的含量極顯著高于B組(P<0.01)。

圖4 兩組奶牛在門水平(a)和屬水平(b)的組間差異物種Fig.4 Differences in species at phylum level (a) and genus level (b) between the two groups of cows

表3 短鏈脂肪酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程

表4 奶牛瘤胃短鏈脂肪酸含量

a～g.分別為戊酸、丁酸、丙酸、乙酸、己酸、異丁酸和異戊酸濃度。*.表示差異顯著(P<0.05)；**.表示差異極顯著(P<0.01)a-g. Represent valeric acid, butyric acid, propionic acid, acetic acid, caproic acid, isobutyric acid and isovaleric acid concentrations, respectively. *. Means the difference is significant (P<0.05); **. Means the difference is extremely significant (P<0.01)圖5 兩組奶牛短鏈脂肪酸含量箱形圖和散點(diǎn)圖Fig.5 Box plot and scatter plot of the concentration of short-chain fatty acids in two groups of dairy cows

3 討 論

瘤胃是由多種微生物組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，這些微生物可發(fā)酵飼料中的粗纖維，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，為宿主提供能量，并介導(dǎo)了腸道免疫和炎癥反應(yīng)[12-13]。歸芪益母方出自《牛經(jīng)備要醫(yī)方》，具有補(bǔ)氣生血、活血祛瘀功效，主治產(chǎn)后氣血虛弱和血瘀證。但其作用機(jī)制的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵還有待于進(jìn)一步探索。眾多研究已證實(shí)，奶牛產(chǎn)后食欲下降和泌乳啟動所導(dǎo)致的能量負(fù)平衡，易誘發(fā)各種圍產(chǎn)期疾病[14]。鑒于此，本試驗(yàn)從瘤胃微生物及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的角度揭示該方對產(chǎn)后奶牛的保健機(jī)制。

3.1 歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃變形菌門和乳桿菌屬菌群的影響

Alpha和Beta多樣性結(jié)果顯示，歸芪益母復(fù)方制劑使產(chǎn)后奶牛瘤胃菌群種類和數(shù)量發(fā)生明顯改變，其中變形菌門極顯著升高。變形菌等兼性厭氧菌可以通過消耗氧氣、改變pH、降低氧化還原電位以及產(chǎn)生二氧化碳使環(huán)境更適于厭氧菌的定植與生存[15-16]，由此推測，歸芪益母復(fù)方制劑有利于瘤胃厭氧環(huán)境的維持，對產(chǎn)后奶牛瘤胃厭氧菌的定植有促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，歸芪益母復(fù)方制劑能明顯增高產(chǎn)后奶牛瘤胃乳桿菌屬的相對豐度。乳桿菌屬是瘤胃中降解淀粉的主要菌屬，具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)[17]，維持腸道健康[18]，調(diào)節(jié)免疫[19]和減少甲烷產(chǎn)生[20]等作用。它通過分解淀粉產(chǎn)生乳酸、短鏈脂肪酸和細(xì)菌素等物質(zhì)抑制病原菌的增殖[21]，對乳房炎具有良好的療效[22]。另外乳酸桿菌NK318.1可誘導(dǎo)分化腸道巨噬細(xì)胞，并能擴(kuò)大抗炎巨噬細(xì)胞[23]。趙潔等[24]發(fā)現(xiàn)，乳房炎奶牛腸道乳酸桿菌數(shù)量較健康奶牛明顯降低。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，歸芪益母復(fù)方制劑能夠增強(qiáng)產(chǎn)后奶牛免疫機(jī)能，降低乳中體細(xì)胞數(shù)[10]，可能還與其增加乳桿菌屬豐度密切相關(guān)。

3.2 歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃擬桿菌屬菌群及其代謝產(chǎn)物丙酸和異丁酸的影響

擬桿菌屬含有大量的碳水化合物活性酶基因，具有很強(qiáng)的聚糖利用能力[25]，能從飲食中解構(gòu)植物纖維、宿主黏蛋白層和糖胺聚糖，并利用多糖產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽，為宿主提供能量[26]。Smith等[27]研究發(fā)現(xiàn)，給GF小鼠提供乙酸鹽和丙酸鹽后，可激活GPR43上調(diào)Foxp3表達(dá)從而刺激結(jié)腸Treg的擴(kuò)增，以增加IL-10 的表達(dá)，提高免疫功能。除此之外，Yioshida等[28]發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬的菌株可抑制腸道微生物產(chǎn)生脂多糖，降低促炎性免疫反應(yīng)。Aktar等[29]也確認(rèn)擬桿菌屬的菌株對宿主免疫T細(xì)胞的功能有促進(jìn)作用。其代謝物乙酸不但能提供能量，還能維持腸道穩(wěn)態(tài)，抑制病原菌生長和炎癥反應(yīng)[30]，丙酸能降低β-羥丁酸濃度, 減少尿酮的產(chǎn)生并預(yù)防脂肪肝[31]，并且在緩解炎癥和提高免疫方面有效[32]。本研究結(jié)果表明，歸芪益母復(fù)方制劑可使產(chǎn)后奶牛瘤胃擬桿菌屬豐度及其代謝產(chǎn)物丙酸含量顯著升高，乙酸略有升高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，歸芪益母復(fù)方制劑能提高產(chǎn)后奶牛宿主外周淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[33]。由此可見，灌服歸芪益母復(fù)方制劑有利于預(yù)防產(chǎn)后奶牛能量負(fù)平衡，提高免疫力，減少產(chǎn)后炎癥疾病的發(fā)生。

擬桿菌和變形菌門，尤其是擬桿菌與氨基酸代謝有關(guān)，可產(chǎn)生異丁酸等支鏈脂肪酸[34]。異丁酸屬于異位酸的一種，是瘤胃內(nèi)瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等纖維分解菌生長因子，當(dāng)異丁酸含量較低時就會限制這些微生物的生長，影響營養(yǎng)物質(zhì)消化與代謝[35]。飼糧中補(bǔ)充異丁酸可改善泌乳奶牛瘤胃發(fā)酵、泌乳性能和生長發(fā)育[36]，提高肉牛瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸濃度、纖維分解菌數(shù)量和飼料纖維消化率[37]。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)后奶牛灌服歸芪益母復(fù)方制劑后，隨著變形菌門和擬桿菌屬菌群數(shù)量的增加，其瘤胃代謝物異丁酸含量也極顯著升高，說明歸芪益母復(fù)方制劑可能對產(chǎn)后奶牛瘤胃纖維分解菌菌群的恢復(fù)和營養(yǎng)物質(zhì)消化有積極影響。

3.3 歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃Subdoligranulum屬菌群及其代謝產(chǎn)物丁酸的影響

Van Hul等[38]研究發(fā)現(xiàn)，Subdoligranulum豐度與脂聯(lián)素(ADPN)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平呈正相關(guān)。Takahashi等[39]發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期健康奶牛血液HDL-C水平明顯高于脂肪肝和泌乳熱奶牛。ADPN具有改善肝糖脂代謝紊亂的作用，并且可以通過降低TNF-α 和IL-6的釋放以達(dá)到抗炎的作用[40-41]。另外，Subdoligranulum可以產(chǎn)生丁酸，發(fā)揮抗炎的作用[42-43]。Van Immerseel等[44]和Kaakoush等[45]研究指出，炎癥性腸病與Subdoligranulum等丁酸生成菌的豐度降低有關(guān)。Schulthess等[46]發(fā)現(xiàn)，丁酸能抑制組蛋白去乙?；? (HDAC3)，分化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)抗菌功能。本研究表明，灌服歸芪益母復(fù)方制劑后奶牛瘤胃Subdoligranulum豐度明顯增加，其代謝產(chǎn)物丁酸的含量也有升高趨勢。陶柱萍等[30]也發(fā)現(xiàn)，黃芪有效成分黃芪苷可以升高Butyricimonas,Roseburia和Subdoligranulum等產(chǎn)丁酸菌的豐度。據(jù)此推測，歸芪益母復(fù)方制劑可通過增加產(chǎn)后奶牛瘤胃Subdoligranulum的豐度發(fā)揮調(diào)節(jié)肝糖脂代謝紊亂和抗炎作用。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)，變形菌門下Escherichia-Shigella屬在灌服歸芪益母復(fù)方制劑后顯著升高，由于本研究所采用的SLIVE數(shù)據(jù)庫將Escherichia和Shigella歸為同一個屬[47]，很難在種水平用16S rRNA技術(shù)進(jìn)行鑒別區(qū)分，故其生理意義尚不清楚。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用16S rRNA高通量測序和GC-MS/MS靶向代謝組學(xué)技術(shù)，研究了灌服歸芪益母復(fù)方制劑對產(chǎn)后奶牛瘤胃微生物菌群及其發(fā)酵產(chǎn)物短鏈脂肪酸的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示歸芪益母復(fù)方制劑能顯著提高產(chǎn)后奶牛瘤胃變形菌門、乳桿菌屬、擬桿菌屬和Subdoligranulum屬微生物菌群豐度，并能顯著提高瘤胃短鏈脂肪酸丙酸和異丁酸的含量。研究結(jié)果從瘤胃微生物菌群及短鏈脂肪酸角度揭示了歸芪益母方對產(chǎn)后奶牛的保健機(jī)制。