楊芷清，張浩權(quán)，冼潤(rùn)浠，李欣然，2*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225； 2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院附屬教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院，佛山 528225)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)對(duì)動(dòng)物的健康問(wèn)題危害嚴(yán)重。TBI主要是由機(jī)械外力引起的，造成的主要原因：打架、撞擊、墜落等。TBI所造成的原發(fā)性損傷往往不可逆轉(zhuǎn)，會(huì)直接導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，只能通過(guò)干預(yù)TBI造成的繼發(fā)性損傷來(lái)治療，但TBI的病理機(jī)制較為復(fù)雜，損傷過(guò)程包括線粒體損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，細(xì)胞能量產(chǎn)生降低和彌漫性軸索損傷等[1-2]。TBI具有高致殘率、高死亡率、高治療費(fèi)的特點(diǎn)，它的發(fā)生會(huì)降低患畜的生活質(zhì)量，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的殘疾或死亡，且預(yù)后不良[3]。雖然人們已經(jīng)意識(shí)到TBI的危害，但目前對(duì)治療TBI的特效藥物研究仍處于起步階段，缺乏有效的治療藥物去治療由TBI引起的各種損傷，如不及時(shí)治療，會(huì)造成不可逆的損傷，是一項(xiàng)迫切需要解決的公共衛(wèi)生和醫(yī)療問(wèn)題。所以需要繼續(xù)探索對(duì)TBI有修復(fù)作用的藥物，以進(jìn)一步改善TBI的預(yù)后。3, 6-二溴-beta-氟-N-(3-甲氧基苯基)-9H-咔唑-9-丙胺(P7C3-A20)是一種穩(wěn)定細(xì)胞能量水平的化合物，可以通過(guò)血腦屏障，具有治療TBI的潛力[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，P7C3-A20能對(duì)中風(fēng)大鼠的腦細(xì)胞提供保護(hù)作用，在抑制成熟神經(jīng)細(xì)胞死亡的同時(shí)，也可以增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的通量，并且接受P7C3-A20治療的大鼠肢體性能和認(rèn)知功能得到了改善[6-7]。即使大鼠在中風(fēng)后延遲6 h腹腔注射P7C3-A20，依然具有減輕神經(jīng)變性和促進(jìn)慢性功能恢復(fù)的治療效果[8]。研究也證實(shí)P7C3-A20的治療可以恢復(fù)正常的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)度，增加腦毛細(xì)血管周細(xì)胞密度，增加血腦屏障緊密連接蛋白的表達(dá)，減少腦內(nèi)免疫球蛋白的浸潤(rùn)，阻止慢性神經(jīng)變性和恢復(fù)認(rèn)知[4]。雖然P7C3-A20已被證實(shí)在缺血性中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病等各種疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但是在大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)TBI模型中，P7C3-A20與神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在通過(guò)CCK8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡、活性氧含量，熒光定量PCR檢測(cè)mRNA等方法探明P7C3-A20在PC12細(xì)胞TBI模型中所起的作用，為臨床合理用藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

3,6-二溴-beta-氟-N-(3-甲氧基苯基)-9H-咔唑-9-丙胺(P7C3-A20)，分子式為C22H19Br2FN2O，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技有限公司；TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master購(gòu)自Roche公司。

1.2 主要儀器

Biotek 800TS吸收光酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；ECHO revolve FL正置倒置一體熒光顯微鏡(北京深藍(lán)云生物科技有限公司)；Roche LightCycler480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株(PC12細(xì)胞)，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床教研室高利教授課題組饋贈(zèng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將PC12細(xì)胞分為6組，分別為對(duì)照組(A組)、模型組(B組)和造模加藥物治療組，其中藥物濃度分為0.03、0.3、和3 μmol·L-13組(C～E組)和藥物空白組(F組)。A組不造模，在添加含100 mL·L-1血清、10 mL·L-1雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，并把細(xì)胞放置于37 ℃，50 mL·L-1CO2的培養(yǎng)箱中。B～E組模型通過(guò)使用10 μL槍頭劃出橫豎相間4 mm的直線來(lái)制備[9]。B組造模后，后續(xù)處理與對(duì)照組相同。C～E組造模后使用不同濃度的P7C3-A20藥物溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行治療。F組不造模，只在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加3 μmol·L-1的P7C3-A20藥物溶液。

1.4.2 酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活力 在96孔板中，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×105·mL-1，待細(xì)胞貼壁完全后處理細(xì)胞，各組培養(yǎng)24 h后加入CCK8液，在培養(yǎng)箱避光孵育1 h，然后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。采用說(shuō)明書(shū)中“細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[ A(0加藥)-A(空白)] ×100”公式對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行計(jì)算。

1.4.3 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡、活性氧情況 在24孔板中，每孔接種500 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×105·mL-1，待細(xì)胞貼壁完全后處理細(xì)胞，然后按說(shuō)明使用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒與細(xì)胞活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，最后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡與活性氧的情況。

1.4.4 熒光定量PCR檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、HO-1、NQO1和GCLCmRNA相對(duì)表達(dá)量 應(yīng)用SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)在PC12細(xì)胞中的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)與合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為L(zhǎng)ightCycler 480 SYBR Green I Master 10 μL、Double Distilled Water 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s；65 ℃ 1 min；每間隔5 s上升0.5 ℃至97 ℃。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Caspase-3、Bcl-2、HO-1、NQO1、GCLC的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 P7C3-A20對(duì)細(xì)胞活力的影響

PC12細(xì)胞活力結(jié)果如圖1所示。數(shù)據(jù)顯示模型組對(duì)比對(duì)照組，細(xì)胞活力極顯著下降(P<0.01)。0.03 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組，細(xì)胞活力顯著上升(P<0.05)。0.3 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組，細(xì)胞活力極顯著上升(P<0.01)。

A. 對(duì)照組；B. 模型組；C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1 P7C3-A20藥物治療組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖1 細(xì)胞活力Fig.1 Cell viability

2.2 P7C3-A20對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

PC12細(xì)胞凋亡情況如圖2和圖3所示，圖3的結(jié)果為各試驗(yàn)組凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例的比值。數(shù)據(jù)顯示，相對(duì)于對(duì)照組，模型組早晚期凋亡細(xì)胞比例均極顯著增加(P<0.01)。0.03 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組早期凋亡細(xì)胞比例顯著減少(P<0.05)，晚期凋亡細(xì)胞比例極顯著減少(P<0.01)。0.3 μmol·L-1和3 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組早晚期凋亡細(xì)胞比例均極顯著減少(P<0.01)。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D.0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group圖2 PC12細(xì)胞凋亡檢測(cè)(Annexin V-FITC/PI染色，標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 PC12 cell apoptosis detection (Annexin V-FITC/PI stain, Bar=100 μm)

A. 對(duì)照組；B. 模型組；C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1 P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖3 凋亡細(xì)胞比例Fig.3 Proportion of apoptotic cells

2.3 P7C3-A20對(duì)PC12細(xì)胞活性氧的影響

PC12細(xì)胞活性氧情況如圖4和圖5所示，圖5的結(jié)果為各試驗(yàn)組活性氧細(xì)胞比例與對(duì)照組活性氧細(xì)胞比例的比值。數(shù)據(jù)顯示，相對(duì)于對(duì)照組，模型組活性氧細(xì)胞比例極顯著增加(P<0.01)。0.03 μmol·L-1和3 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組活性氧細(xì)胞比例均顯著減少(P<0.05)。0.3 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組活性氧細(xì)胞比例極顯著減少(P<0.01)。

A.對(duì)照組；B.模型組；C.0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D.0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group圖4 PC12細(xì)胞活性氧檢測(cè)(DCFHDA染色，標(biāo)尺=100 μm)Fig.4 PC12 cell ROS detection (DCFHDA stain, Bar=100 μm)

A. 對(duì)照組；B. 模型組；C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1 P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖5 活性氧細(xì)胞比例Fig.5 Proportion of reactive oxygen cells

2.4 P7C3-A20對(duì)PC12細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、HO-1、NQO1和GCLC mRNA表達(dá)的影響

Caspase-3和Bcl-2 mRNA熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，0.3 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組Caspase-3 mRNA表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。HO-1、NQO1和GCLCmRNA熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，0.3 μmol·L-1藥物治療組對(duì)比模型組NQO1、HO-1和GCLCmRNA表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。

A. 對(duì)照組；B. 模型組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖6 PC12細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2 mRNA的表達(dá)量Fig.6 The relative expression of Caspase-3, Bcl-2 mRNA in PC12 cells

A. 對(duì)照組；B. 模型組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，*.P<0.05，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05A. Control group; B. Model group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, *.P<0.05，**. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05圖7 PC12細(xì)胞中HO-1、NQO1、GCLC mRNA的表達(dá)量Fig.7 The relative expression of HO-1, NQO1, GCLC mRNA in PC12 cells

3 討 論

3.1 PC12細(xì)胞造模模擬TBI的可行性分析

TBI對(duì)動(dòng)物危害嚴(yán)重，任何對(duì)頭部的強(qiáng)烈撞擊都可能導(dǎo)致TBI的發(fā)生，隨后會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和認(rèn)知等功能障礙，另外還促進(jìn)氧自由基增多和細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程，且這種損害常常持續(xù)很久，甚至持續(xù)終生[10-11]。動(dòng)物在體試驗(yàn)昂貴且費(fèi)力，細(xì)胞體外模型具有易于構(gòu)建，費(fèi)時(shí)短，花費(fèi)低，干擾因素少，試驗(yàn)條件可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[12]。PC12細(xì)胞系是神經(jīng)科學(xué)研究中最常用的細(xì)胞之一，源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤[13]。細(xì)胞體外TBI模型通過(guò)機(jī)械橫斷體外細(xì)胞，已被許多研究者認(rèn)可并使用[9,12,14-15]。本試驗(yàn)通過(guò)使用10 μL移液槍頭劃斷神經(jīng)元神經(jīng)突來(lái)制備細(xì)胞體外TBI模型，能夠模擬神經(jīng)元的軸索損傷，是一種操作簡(jiǎn)單，效果顯著的體外模型，用于模擬體外TBI后的各種腦組織病變[9]。P7C3-A20能增強(qiáng)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NAD補(bǔ)救途徑的通量，阻止細(xì)胞死亡[6]。NAD在調(diào)節(jié)線粒體代謝的基本底物方面起重要作用，也是ATP產(chǎn)生的主要底物，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，能量代謝和細(xì)胞保護(hù)方面發(fā)揮重要作用。TBI模型中，對(duì)PC12細(xì)胞使用P7C3-A20能提高細(xì)胞活力。

3.2 P7C3-A20對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后的PC12細(xì)胞具有抗凋亡的作用

細(xì)胞凋亡指的是特定蛋白相互作用，程序化傳遞死亡誘導(dǎo)信號(hào)，從而進(jìn)行細(xì)胞分解的過(guò)程[16]。凋亡細(xì)胞以核小體結(jié)構(gòu)、脫落受體、抗炎代謝物或者包裝在凋亡細(xì)胞外囊泡(ApoEVs)中的分子形式釋放信使[17]。在此試驗(yàn)中，Annexin V-FITC能在Ca2+環(huán)境下與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合，早期凋亡細(xì)胞PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻，會(huì)被Annexin V-FITC染料染成綠色。PI不能透過(guò)完整細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞膜破損后，PI則能滲透進(jìn)去，故晚期凋亡細(xì)胞會(huì)被Annexin V-FITC與PI同時(shí)染成綠色與紅色。半胱氨酸蛋白酶(caspase)可以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，其家族成員Caspase-3是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵的因子，細(xì)胞凋亡信號(hào)出現(xiàn)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Caspase-3裂解并被激活，而活化后的Caspase-3又會(huì)進(jìn)一步放大蛋白酶級(jí)聯(lián)切割效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞最終走向死亡，Caspase-3一旦被激活，細(xì)胞凋亡則不可避免[10,18]。Caspase-3是重要的凋亡蛋白酶，其表達(dá)量可直接反映細(xì)胞凋亡的程度[18]。Bcl-2是典型的抗凋亡蛋白，可以通過(guò)形成異源二聚體來(lái)抑制凋亡，還可以通過(guò)抗氧化作用來(lái)提高細(xì)胞存活率[16]。TBI后使用P7C3-A20治療，凋亡面積減少，Caspase-3 mRNA表達(dá)量下降，Bcl-2 mRNA表達(dá)量上升，表明P7C3-A20可以減少TBI后的神經(jīng)元凋亡，具有抗凋亡的功能。

3.3 P7C3-A20對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后的PC12細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激的作用

ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化在細(xì)胞死亡中起重要作用，由于多不飽和脂肪酸含量較高，細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜很容易受到ROS損傷，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。ROS包括過(guò)氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、超氧陰離子(·O2-)、羥基自由基(·OH)、過(guò)氧化自由基(ROO·)、過(guò)氧羥自由基(HOO·)和單線態(tài)氧(1O2)等，它們會(huì)被DCFHDA熒光探針標(biāo)記成綠色。ROS的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)攻擊生物膜，對(duì)細(xì)胞成分產(chǎn)生不利的影響，增強(qiáng)各種致病機(jī)制，引起氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激會(huì)引起大腦神經(jīng)損傷，誘導(dǎo)不同類(lèi)型的細(xì)胞死亡。HO-1、NQO1和GCLC是Nrf2下游的抗氧化基因，上調(diào)HO-1、NQO1和GCLC基因的表達(dá)可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[20-22]。HO-1在其啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)抗氧化反應(yīng)元件，HO-1直接影響機(jī)體的抗氧化平衡，并具有抗凋亡的作用[23]。NQO1能以NAD (P) H為受體，將醌類(lèi)物質(zhì)通過(guò)雙電子還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為低毒性的氫醌類(lèi)物質(zhì)，從而避免細(xì)胞氧化損傷[24-25]。GCLC是抗氧化蛋白酶，能提高抗氧化應(yīng)激的能力[20]。TBI后使用P7C3-A20治療，活性氧面積減少，HO-1、NQO1和GCLCmRNA的表達(dá)量上升，說(shuō)明PC12細(xì)胞在TBI后使用P7C3-A20會(huì)使氧化應(yīng)激減少。

4 結(jié) 論

P7C3-A20對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷后的PC12細(xì)胞有抗凋亡、減輕氧化應(yīng)激的修復(fù)作用。