張鵬光，閆恩法，王黎琦，馬成宏，張 鑫，尹靖東

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

由于食物和環(huán)境的變化，斷奶仔豬呈現(xiàn)出腹瀉、消化能力下降和生長(zhǎng)緩慢等癥狀[1]。斷奶導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激，腸道中活性氧和硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)濃度增加，同時(shí)一氧化氮和過(guò)氧化氫濃度顯著增加，促進(jìn)了大腸桿菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腸道炎癥和氧化應(yīng)激的進(jìn)一步惡化[2]。腸道屏障功能對(duì)斷奶仔豬的健康狀況和生長(zhǎng)性能有重要影響，腸道的緊密連接在上皮屏障的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。緊密連接結(jié)構(gòu)包括跨膜蛋白(Claudin、Occludin等)、連接黏附分子以及帶狀閉合蛋白ZO等[3]。在炎癥性腸病下，Claudin、Occludin和ZO水平顯著下調(diào)，腸道對(duì)有害代謝產(chǎn)物的通透性增強(qiáng)，引起全身炎癥反應(yīng)[4-5]。因此，改善斷奶仔豬的腸道功能對(duì)于仔豬健康以及養(yǎng)豬業(yè)的高效生產(chǎn)具有重要意義。

L-蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸可以影響機(jī)體腸道微生物，在抗應(yīng)激和抗氧化方面有重要作用[6-7]。大鼠上的研究也表明，L-蘋果酸可以通過(guò)增加NADPH的生成，改善衰老鼠的能量狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[8]。目前，L-蘋果酸在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加L-蘋果酸制品可以改善斷奶仔豬機(jī)體抗氧化能力，增強(qiáng)有氧代謝，提高骨骼肌中氧化型肌纖維的比例[9]，但是L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬腸道功能的影響尚不清楚。本試驗(yàn)以斷奶仔豬為研究對(duì)象，在日糧中添加不同水平的L-蘋果酸制品，旨在研究L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬腸道健康和機(jī)體健康狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取體重相近(平均體重(9.12±0.52)kg)的28日齡“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬192頭，隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭豬(公母各半)。對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧，3個(gè)處理組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.25%、0.5%和1%的L-蘋果酸制品，試驗(yàn)期28 d。L-蘋果酸制品購(gòu)自安徽雪郎生物科技股份有限公司，成分為20% L-蘋果酸和80%載體(以沸石粉為主)。日糧營(yíng)養(yǎng)水平滿足NRC(2012)仔豬(11～25 kg)營(yíng)養(yǎng)需要。基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心動(dòng)物試驗(yàn)基地(河北豐寧)進(jìn)行，豬舍配備漏糞地板、不銹鋼料槽與乳頭式飲水器。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，仔豬自由采食和飲水。

1.2 樣品采集

于試驗(yàn)14和28 d，每個(gè)重復(fù)內(nèi)選取1頭接近本欄平均體重的健康仔豬，前腔靜脈采集血液約5 mL，靜置30 min。4 ℃條件下3 500 r·min-1離心15 min，收集血清于-20 ℃保存。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)處理選取6頭接近平均體重的仔豬，禁食12 h后肌肉注射戊巴比妥鈉進(jìn)行完全麻醉，屠宰解剖，取出心、肝、脾、肺、腎，吸水紙吸干表面血液后稱重。器官指數(shù)計(jì)算公式：器官指數(shù)(g·kg-1)=器官質(zhì)量(g)/豬活體重(kg)。剖開(kāi)腹腔，截取空腸中段約2 cm，用生理鹽水沖洗干凈后放入4%多聚甲醛溶液中固定；截取空腸中段約10 cm，排盡食糜后用生理鹽水沖洗干凈，使用載玻片輕輕刮取腸道內(nèi)部表層黏膜，于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。

1.3 血清和空腸炎癥指標(biāo)

使用相應(yīng)的商業(yè)化試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))，按照說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定血清和空腸黏膜中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的含量。

1.4 空腸抗氧化能力測(cè)定

測(cè)定空腸黏膜SOD、CAT和GSH-Px的活性，以及T-AOC和MDA的含量。所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(中國(guó))，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 腸道形態(tài)學(xué)分析

空腸樣品在4%甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)過(guò)修塊、脫水、透明和石蠟包埋后將包埋有樣品的石蠟塊切成5 μm厚的切片，隨后經(jīng)蘇木精-伊紅染色后晾干、制片。使用倒置顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)為CK40)對(duì)切片進(jìn)行觀察和分析，在每個(gè)組織切片上選取至少10個(gè)典型視野(絨毛清晰完整)，利用Adobe Photoshop軟件(版本CS6)測(cè)量絨毛高度和隱窩深度。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1.6 空腸黏膜蛋白提取和Western blot分析

取50～100 mg空腸黏膜樣品在液氮中充分研磨，加入0.5～1 mL RIPA組織裂解液(北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司，中國(guó))，提取總蛋白質(zhì)，使用BCA試劑盒(北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司，中國(guó))測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取約60 μg蛋白使用8%～10% SDS-PAGE進(jìn)行分離，使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。使用含有5% BSA的封閉液進(jìn)行封閉，加一抗(1∶1 000 Claudin-3多克隆抗體，1∶1 000 ZO-2多克隆抗體，1∶200 Occludin多克隆抗體，1∶10 000 GAPDH單克隆抗體)，4 ℃孵育過(guò)夜，使用TBST緩沖液漂洗3次后，加入二抗山羊抗兔抗體(1∶15 000)室溫孵育1 h。經(jīng)TBST緩沖液洗滌3次后，使用Odyssey Clx熒光系統(tǒng)進(jìn)行曝光和成像，最后通過(guò)ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析并相對(duì)定量。

抗體來(lái)源：兔抗Claudin-3、ZO-2及Occludin多克隆抗體(Omnimabs公司產(chǎn)品，貨號(hào)分別為OM123251、OM111126、OM200043)；兔抗GAPDH單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，貨號(hào)2118)；二抗山羊抗兔抗體(Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，貨號(hào)5151)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2013整理所有原始數(shù)據(jù)，使用SAS(SAS 9. 2)的GLM程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性和二次回歸分析以及單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P≤0.10為有變化趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和器官指數(shù)的影響

前期研究結(jié)果顯示，日糧添加L-蘋果酸制品對(duì)斷奶仔豬的平均日增重沒(méi)有顯著影響，斷奶仔豬的平均日采食量有升高的趨勢(shì)，飼料轉(zhuǎn)化效率有降低的趨勢(shì)(0.05≤P≤0.10)[9]。此外，如表2所示，日糧添加L-蘋果酸制品不影響斷奶仔豬心、肝、脾、肺以及腎重量。

表2 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬器官指數(shù)的影響

2.2 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬炎癥反應(yīng)的影響

TNF-α、IFN-γ和IL-6是典型的促炎因子，IL-10是典型的抗炎因子。如表3所示，與對(duì)照組相比，日糧中添加1% L-蘋果酸制品顯著降低了試驗(yàn)第14天仔豬血漿中TNF-α和IL-6的水平(P<0.01)，升高了IL-10的水平(P<0.01)；顯著降低了試驗(yàn)第28天血漿中IL-6的水平(P<0.01)，升高了IL-10的水平(P<0.01)，表明日糧添加1% L-蘋果酸制品降低了斷奶仔豬的炎癥反應(yīng)，而添加0.25%和0.5%的L-蘋果酸制品對(duì)抗炎能力產(chǎn)生了不利影響。

表3 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬血清炎癥因子水平的影響

2.3 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬空腸炎癥反應(yīng)和抗氧化能力的影響

鑒于日糧添加1% L-蘋果酸制品顯著改善了斷奶仔豬的抗炎能力，本研究進(jìn)一步關(guān)注了該濃度下小腸健康狀態(tài)的變化，并把1% L-蘋果酸制品組定義為L(zhǎng)-蘋果酸組。如圖1所示，日糧中添加L-蘋果酸顯著降低了空腸黏膜中促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平(P<0.05或P<0.01)，升高了抗炎因子IL-10的水平(P<0.01,圖1A～D)。同時(shí)，添加L-蘋果酸顯著升高了空腸黏膜中SOD、CAT和GSH-Px的活性(P<0.05或P<0.01)，顯著提高了T-AOC(P<0.01)、顯著降低了MDA的水平(P<0.05,圖1E～I(xiàn))。上述結(jié)果表明日糧添加1% L-蘋果酸改善了斷奶仔豬空腸的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)了抗氧化能力。

*．P<0.05，**．P<0.01。下同*．P<0.05，**．P<0.01. The same as below圖1 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬空腸炎癥反應(yīng)和抗氧化能力的影響Fig.1 Effects of dietary supplementation of L-malic acid on the inflammatory response and antioxidant capacity in jejunum of weaned piglets

2.4 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響

本研究利用HE染色，進(jìn)一步分析了L-蘋果酸對(duì)空腸形態(tài)的影響。如圖2所示，與對(duì)照組相比，日糧添加L-蘋果酸顯著增加了空腸的絨毛高度(P<0.01)，對(duì)隱窩深度沒(méi)有顯著影響，顯著升高了絨毛高度與隱窩深度的比值(P<0.05)。

2.5 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬空腸屏障功能的影響

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)水平的分析，進(jìn)一步研究了日糧添加L-蘋果酸對(duì)腸道屏障功能的影響。與對(duì)照組相比，L-蘋果酸組Occludin的蛋白表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)(P=0.07)，Claudin-3的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，ZO-2表達(dá)無(wú)顯著變化(圖3)。

A.對(duì)照組和L-蘋果酸組空腸HE染色(100×)；B.對(duì)照組和L-蘋果酸組的空腸絨毛高度；C.對(duì)照組和L-蘋果酸組的隱窩深度；D.對(duì)照組和L-蘋果酸組的絨毛高度與隱窩深度的比值A(chǔ). Jejunum HE staining in control group and L-malic acid group (100×); B. Villus height of jejunum in control group and L-malic acid group; C. Crypt depth of control group and L-malic acid group; D. Ratio of villus height to crypt depth in control and L-malic acid groups圖2 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬空腸形態(tài)的影響Fig.2 Effects of dietary supplementation of L-malic acid on jejunal morphology in weaned piglets

A.Occludin多克隆抗體、ZO-2多克隆抗體和Claudin-3多克隆抗體蛋白免疫印記分析；B.Occludin、ZO-2和Claudin-3在對(duì)照組和L-蘋果酸組中的相對(duì)表達(dá)量A. Western blotting analysis of Occludin, ZO-2 and Claudin-3; B. The relative expression levels of Occludin, ZO-2 and Claudin-3 in control group and L-malic acid group圖3 L-蘋果酸對(duì)斷奶仔豬空腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of dietary supplementation of L-malic acid on the tight junction protein expression in the jejunum of weaned piglets

3 討 論

小腸具有消化和吸收功能，腸道上皮是腸道的第一道防線[10]。同時(shí)，小腸也是重要的免疫器官。應(yīng)激源可以通過(guò)激活腸道免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6等一系列特殊細(xì)胞和信號(hào)分子的產(chǎn)生。隨著炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，腸道形態(tài)遭到破壞，黏膜和屏障功能受損，動(dòng)物的采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率降低[11-13]，并且斷奶應(yīng)激對(duì)早期斷奶仔豬免疫功能和腸道屏障功能的影響會(huì)一直延續(xù)到成年[13]。因此，改善腸道健康對(duì)于提升斷奶仔豬的消化吸收能力、免疫功能以及全期的生長(zhǎng)性能至關(guān)重要。

L-蘋果酸是自然界廣泛存在的一種有機(jī)酸，是動(dòng)植物新陳代謝的產(chǎn)物。作為三羧酸循環(huán)中間體，L-蘋果酸可以促進(jìn)NADH從細(xì)胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高老齡大鼠電子傳遞鏈酶的活性并提高還原性谷胱甘肽的水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，緩解脂質(zhì)過(guò)氧化狀態(tài)[14]。與模式動(dòng)物上的研究結(jié)果相一致，本研究中，日糧添加L-蘋果酸提高了空腸黏膜SOD、CAT和GSH-Px的活性，提高了T-AOC，顯著降低了MDA的水平，意味著斷奶仔豬腸道的抗氧化能力得到增強(qiáng)。

有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶后第2天腸道CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量急劇增加，空腸中部炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)以及白細(xì)胞介素-8(IL-8)的mRNA表達(dá)水平升高[15-16]。此外，斷奶應(yīng)激可以通過(guò)激活免疫細(xì)胞和下調(diào)空腸黏膜I類主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶局部表達(dá)增加，造成絨毛萎縮[15,17]。在本研究中，日糧添加1%的L-蘋果酸制品顯著降低了空腸黏膜促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平，升高了抗炎因子IL-10的水平。IFN-γ和TNF-α等促炎因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答作用，是臨床上常見(jiàn)的抗病毒細(xì)胞因子[18]。IL-6由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用，作為主要炎癥細(xì)胞因子，在機(jī)體感染后的病理生理過(guò)程中起到重要作用[19]。而幾乎所有淋巴細(xì)胞均能合成IL-10，IL-10等抗炎因子主要介導(dǎo)體液免疫。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果分析可知，日糧中添加L-蘋果酸可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫來(lái)提高空腸的免疫能力，從而降低斷奶仔豬腸道炎癥反應(yīng)，這很可能跟空腸抗氧化能力的提升有關(guān)。值得關(guān)注的是，添加1%的L-蘋果酸制品同樣降低了第14天血漿中TNF-α和IL-6的水平，顯著降低了第28天血漿中IL-6的水平，升高了第14和28天血漿中IL-10的水平，說(shuō)明添加1%的L-蘋果酸制品可能通過(guò)增強(qiáng)腸道的抗炎能力緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)。但令人迷惑的是，與對(duì)照組相比，日糧添加0.25%和0.5%的L-蘋果酸制品對(duì)機(jī)體抗炎能力產(chǎn)生了不利影響，其中的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

有研究報(bào)道，增強(qiáng)小腸的抗炎能力可以減輕腸道損傷，提高小腸絨毛高度[20]。微絨毛是腸黏膜上皮的特殊結(jié)構(gòu)，大量的上皮細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)吸收的功能[21]。研究人員指出，氧化應(yīng)激導(dǎo)致了十二指腸細(xì)胞周轉(zhuǎn)減少、微絨毛高度降低、部分微絨毛糜爛[22]。本研究顯示，添加L-蘋果酸顯著提高了空腸絨毛高度，升高了絨毛高度與隱窩深度的比值。腸道絨毛高度和隱窩深度作為腸道物理屏障功能的重要組成部分，與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收密切相關(guān)[23]。絨毛高度/隱窩深度反映了斷奶仔豬腸道功能狀況，比值上升表示腸道健康且消化能力較強(qiáng)，下降表示腸道黏膜受損，消化吸收功能降低[24]。因此，L-蘋果酸能夠改善空腸形態(tài)，提高腸道的消化吸收能力，這可能得益于空腸抗炎能力提升和氧化應(yīng)激的緩解。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致過(guò)多活性氧的釋放，引發(fā)促炎細(xì)胞因子的上調(diào)，增強(qiáng)腸道通透性[25]，這表明氧化應(yīng)激對(duì)仔豬腸道屏障功能也會(huì)產(chǎn)生不利影響。本研究中，添加L-蘋果酸顯著降低了斷奶仔豬空腸黏膜Claudin-3的蛋白表達(dá)水平，Occludin的蛋白表達(dá)水平有升高的趨勢(shì)。Occludin介導(dǎo)了緊密連接鏈分支點(diǎn)的形成和穩(wěn)定，并有助于維持上皮屏障的完整性[26]。緊密連接調(diào)節(jié)的細(xì)胞旁通透性的主要決定因素是Claudins，Claudin-3的降解是腸道屏障功能受損的典型特征[27]。細(xì)胞因子能夠通過(guò)與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)的信號(hào)通路直接改變緊密連接的組成和結(jié)構(gòu)[28]。緊密連接蛋白能夠適應(yīng)細(xì)胞因子的刺激，在結(jié)構(gòu)完整的情況下具有分子重塑的潛力[29]。因此，在本研究中，Claudin-3和Occludin蛋白表達(dá)水平的變化可能與L-蘋果酸引起的炎癥因子水平的變化有關(guān)，但是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)緊密連接的過(guò)程尚不清楚，L-蘋果酸對(duì)腸道屏障功能的影響還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究表明，日糧添加1% L-蘋果酸制品可以降低斷奶仔豬的炎癥反應(yīng)，改善空腸炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài)，影響空腸形態(tài)和屏障功能，進(jìn)而發(fā)揮改善腸道健康的作用。