王立斌，王 萌，孫 瑩，陳 睿，張?zhí)鹛穑S振華，張 倩，余四九，潘陽(yáng)陽(yáng)*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

雌激素(17β-estradiol, E2)作為雌性動(dòng)物主要類固醇類激素，由膽固醇產(chǎn)生，性腺分泌[1]，在動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟、排卵、胚胎發(fā)育等生理過程中的生物效應(yīng)因動(dòng)物種類不同存在一定差異[2]。在水牛[3]、山羊[4]和豬卵母細(xì)胞成熟過程加入外源E2或促進(jìn)內(nèi)源E2合成與分泌，能夠改善卵母細(xì)胞成熟，增加卵丘細(xì)胞擴(kuò)散。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物機(jī)體中E2可激活機(jī)體多種細(xì)胞雌激素受體(estrogen receptor, ESR)，調(diào)控細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白，改變細(xì)胞和組織形態(tài)[5-6]。E2調(diào)控細(xì)胞自噬分子機(jī)制存在多樣性，如增加細(xì)胞溶酶體數(shù)量、抑制自噬相關(guān)micRNA、影響細(xì)胞組蛋白修飾等，且作用靶基因較多，如自噬相關(guān)基因5(autophagyrelated gene 5, ATG5)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3, LC3)和Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein, BECLIN1)[7]。

細(xì)胞自噬作為一種基本且相對(duì)保守的細(xì)胞分解代謝程序，在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中不斷變化，參與細(xì)胞成份降解與再利用[7]，同時(shí)參與機(jī)體眾多發(fā)育和生理生物學(xué)事件，如細(xì)胞存活與死亡、新陳代謝和天然免疫等。自噬可維持細(xì)胞在不同應(yīng)激條件下的存活，提高其對(duì)饑餓、低氧、生長(zhǎng)信號(hào)阻斷等應(yīng)激的適應(yīng)，降低應(yīng)激條件下機(jī)體疾病發(fā)生率、緩解發(fā)育障礙[8-9]。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過程中細(xì)胞自噬可改變胞內(nèi)線粒體分布和Ca2+含量，提高卵母細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)能力，并通過恢復(fù)線粒體功能、降低卵母細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶延緩細(xì)胞凋亡啟動(dòng)[10]。牦牛作為長(zhǎng)期生活在青藏高原地區(qū)的典型家畜，其生殖生理具備適應(yīng)高寒、低氧等特性[11]，分析牦牛卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟過程中生殖激素調(diào)控細(xì)胞自噬對(duì)提升牦牛繁殖水平具有重要意義。

細(xì)胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom, CYP19A1)作為大多數(shù)動(dòng)物性腺激素合成關(guān)鍵酶[12]，主要分布于動(dòng)物性腺、肝、脂肪和腦等組織[13]。降低人和其他動(dòng)物顆粒細(xì)胞CYP19A1表達(dá)水平，導(dǎo)致E2分泌減少[14-15]，機(jī)體內(nèi)CYP19A1表達(dá)量與類固醇類激素水平及生殖疾病緊密相關(guān)[15]。動(dòng)物顆粒細(xì)胞中CYP19A1表達(dá)受其他激素影響，如促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)可調(diào)控CYP19A1轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)E2合成，同時(shí)促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖[16]。本試驗(yàn)在牦牛卵母細(xì)胞體外成熟過程調(diào)控COCs中CYP19A1表達(dá)，分析其對(duì)內(nèi)源性E2合成和細(xì)胞自噬的影響，并與外源性E2調(diào)控牦牛卵母細(xì)胞自噬與發(fā)育能力的效果進(jìn)行比較，為進(jìn)一步探索細(xì)胞色素酶介導(dǎo)生殖激素調(diào)控家畜卵母細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牦牛卵巢采自青?；ブh牦牛屠宰場(chǎng)，M199家畜卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液、E2、FSH與促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、胚胎培養(yǎng)用G1液均購(gòu)自瑞典Vitrolife生物公司。透明質(zhì)酸酶、去離子霉素、二甲基氨基嘌呤等孤雌激活胚胎生產(chǎn)試劑、CYP19A1一抗(SAB4500606)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。微量細(xì)胞RNA提取試劑盒、兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)公司Omega生物公司，SYBR Green II熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)公司，牛E2ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海仁捷生物科技有限公司，細(xì)胞自噬相關(guān)因子一抗ATG5(bs-25013R)、BECLIN1 (bsm-33315M)、β-actin(bsm-33036M, 42 ku)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司、LC3(ab51520)抗體購(gòu)自abcam生物公司，Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)用的二抗均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，其中bs-0295D用于Western blot檢測(cè)CYP19A1、ATG5、LC3，bs-0297R用于Western blot檢測(cè)BECLIN1，bs-0295D-AF488用于免疫熒光檢測(cè)CYP19A1、ATG5，bs-0297R-FITC用于免疫熒光檢測(cè)BECLIN1，試驗(yàn)所用其他試劑均購(gòu)買碧云天(南京)生物公司。

1.2 牦牛COCs采集與體外成熟培養(yǎng)

從屠宰牦牛體內(nèi)立刻采集卵巢，用含有1%雙抗(青鏈霉素)的生理鹽水約30 ℃洗滌3次，置于32～35 ℃無(wú)菌保溫壺，6 h內(nèi)帶回細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，用細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)平衡的生理鹽水洗滌卵巢3次，采用攜帶12～18 G針頭注射器從直徑為5～10 mm卵泡中抽吸牦牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)，體視顯微鏡下挑選形態(tài)完整，至少包裹3層顆粒細(xì)胞的未成熟COCs(圖1A)。用預(yù)熱洗卵液(M199+5%血清)在顯微鏡下輕微吹打洗滌3次，置于4孔板(Nunclon，176740)，每400 μL M199卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液(M199基礎(chǔ)液+5% FBS+50 μg·mL-1LH +100 μg·mL-1FSH 100 μg·mL-1鏈霉素+ 100 μg·mL-1青霉素)含50枚COCs，用200 μL礦物油覆蓋，放入37.5 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集成熟COCs。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)所需，參照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期研究成果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液分別加入10-7mol·L-1E2[17]、10-6mol·L-1黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)誘導(dǎo)CYP19A1表達(dá)[18]和10-5mol·L-1雙酚A(bisphenol A, BPA)抑制CYP19A1表達(dá)[19]，并設(shè)對(duì)照組(加入等體積生理鹽水)。

培養(yǎng)24 h后，收集成熟COCs(圖1B)，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)300枚COCs，其中230枚用DPBS清洗3次后置于-70 ℃保存，用于后續(xù)CYP19A1和細(xì)胞自噬相關(guān)因子mRNA和蛋白Western blot檢測(cè)，分別為30枚和200枚，20枚用DPBS清洗3次后置于免疫熒光固定液，用于后續(xù)CYP19A1和自噬相關(guān)蛋白免疫熒光檢測(cè)。剩余COCs用DPBS清洗3次，每次5 min，用0.1%的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行吹打清洗，直到完全去除卵丘細(xì)胞，獲得裸卵，將其置入DPBS清洗3次，用吸卵針輕微吹打旋轉(zhuǎn)卵母細(xì)胞，根據(jù)第一極體排出確定卵母細(xì)胞成熟(圖1C)，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率，并將成熟卵母細(xì)胞收集生產(chǎn)孤雌激活胚胎。

1.3 CYP19A1與細(xì)胞自噬相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.3.1CYP19A1與細(xì)胞自噬相關(guān)因子mRNA表達(dá)檢測(cè) 在不同處理組收集30枚牦牛COCs，DPBS清洗3次，參照微量細(xì)胞RNA提取試劑盒操作程序提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒程序合成cDNA，實(shí)驗(yàn)室冷凍保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank儲(chǔ)存的牛CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3 mRNA序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，具體信息見表1。反應(yīng)管中加入2.00 μL cDNA，正義鏈和反義鏈引物各0.50 μL，使其工作濃度為0.20 μmol·mL-1，qRT-PCR mix SYBR GreenⅡ(2×) 10 μL，最后加入7.00 μL滅菌水至終體積20.00 μL。采用Roche 480實(shí)時(shí)熒光定量RCR儀擴(kuò)增檢測(cè)不同處理組COCs中CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA水平，條件為96 ℃預(yù)變性1 min，PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)為38，包括變性(96 ℃, 20 s)、退火(59.5 ℃, 15 s)、延伸(72 ℃, 20 s)，β-actin作為內(nèi)參基因，等體積生理鹽水處理組為對(duì)照組，不同處理組mRNA水平采用相對(duì)模板量算法分析，用2-ΔΔct表示[20]。

表1 Real-time PCR所用引物信息表

1.3.2 CYP19A1與細(xì)胞自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè) 參照英文特(SD-001)動(dòng)物細(xì)胞蛋白提取試劑盒，從每個(gè)處理組中選取200枚牦牛COCs提取總蛋白，100 ℃水浴10 min進(jìn)行蛋白SDS變性，等量上樣至10%凝膠，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白。220 mA冰浴電轉(zhuǎn)1 h，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脫脂奶粉溶解于TBST溶液常溫封閉2 h，CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3蛋白一抗4 ℃孵育至少10 h，TBST溶液清洗3次，每次10 min，生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST溶液清洗5次，每次5 min，采用ECL試劑發(fā)光顯色，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行拍照。通過灰度值分析，以β-actin蛋白作為參照，采用相對(duì)定量方法比較不同處理組CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 CYP19A1與細(xì)胞自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)免疫熒光技術(shù)檢測(cè) 每個(gè)處理組選取40枚COCs，DPBS清洗3次，每次5 min，用免疫染色液進(jìn)行固定，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｌ暨x15枚用于CYP19A1與細(xì)胞自噬相關(guān)因子蛋白表達(dá)定位檢測(cè)，因LC3含有兩個(gè)亞型，無(wú)法用免疫熒光抗體進(jìn)行區(qū)分，細(xì)胞自噬相關(guān)因子只檢測(cè)ATG5、BECLIN1蛋白熒光。從固定液取出，DPBS清洗3次，每次5 min，用含有0.25% TritonX-100封閉液室溫作用1 h，進(jìn)行透化、封閉，DPBS清洗3次，每次5 min，加入一抗室溫孵育2 h，DPBS清洗3次，每次5 min，加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗室溫孵育1 h，DPBS清洗3次，加入2.5 ng·mL-1DAPI 避光室溫孵育3～5 min，清洗3次，每次5 min，將染色COCs轉(zhuǎn)移至載玻片，加入5 μL DPBS，蓋玻片封片，其中COCs中CYP19A1蛋白熒光單獨(dú)檢測(cè)，ATG5、BECLIN1蛋白熒光進(jìn)行雙染檢測(cè)。熒光顯微鏡檢測(cè)不同處理組COCs中CYP19A1、ATG5、BECLIN1蛋白熒光。

1.4 AFB1和BPA影響COCs分泌E2的檢測(cè)

牦牛COCs成熟培養(yǎng)24 h后，收集不同處理組M199培養(yǎng)液，10倍稀釋后置于-20 ℃冷凍保存，用于E2檢測(cè)。參照試劑盒說(shuō)明采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)E2濃度，標(biāo)準(zhǔn)品分別為0、7.5、15、30、60、120 pg·mL-1，檢測(cè)靈敏度小于1.0 pg·mL-1。

1.5 孤雌激活胚胎發(fā)育能力統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)不同處理組卵母細(xì)胞成熟率后，將成熟裸卵置入含有5 μmol·L-1(Micromolar)去離子霉素的mSOF液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱避光作用5～10 min，用mSOF液于37 ℃吹打清洗3次，每次不少于5 min，然后將其放入含有2 mmol·L-1二甲基氨基嘌呤mSOF液內(nèi)，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)5 h，用預(yù)熱DPBS清洗3次，每次5 min，再轉(zhuǎn)移至G1胚胎培養(yǎng)液，清洗3次，每次1 min，然后轉(zhuǎn)移到預(yù)平衡的G1微滴培養(yǎng)液，每個(gè)微滴100 μL含有20枚胚胎，用礦物油覆蓋置入38 ℃、飽和濕度、5.5% CO2條件培養(yǎng)，分別在48 和192 h觀察卵裂胚胎(圖1D)和囊胚數(shù)量(圖1E)，以成熟卵母細(xì)胞數(shù)為基數(shù)統(tǒng)計(jì)卵裂率，以卵裂胚胎數(shù)為基數(shù)統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS16.0，進(jìn)行單因素方差試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，每個(gè)處理設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。P<0.05 表示差異具有顯著性，所有數(shù)據(jù)以重復(fù)組之間“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。

2 結(jié) 果

2.1 外源E2、AFB1和BPA調(diào)控COCs中CYP19A1表達(dá)

收集不同處理組牦牛COCs，qRT-PCR檢測(cè)CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果如圖2A所示，在AFB1處理組，CYP19A1 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，為對(duì)照組的(10.45±0.39)倍，在10-7mol·L-1E2和BPA處理組CYP19A1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，分別為對(duì)照組的(0.56±0.42)倍和(0.32±0.06)倍。

Western blot檢測(cè)不同處理組CYP19A1蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖2B所示，根據(jù)灰度值分析不同處理組蛋白相對(duì)表達(dá)水平如圖2C所示，AFB1處理組CYP19A1蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，為對(duì)照組的(8.23±0.68)倍，10-7mol·L-1E2和BPA處理組CYP19A1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，分別為對(duì)照組的(0.42±0.08)和(0.39±0.06)倍。

不同處理組COCs中CYP19A1蛋白免疫熒光檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組COCs中卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞均可檢測(cè)到CYP19A1蛋白熒光。AFB1處理組CYP19A1蛋白熒光在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞強(qiáng)度高于對(duì)照組和其他處理組。10-7mol·L-1E2處理組卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中CYP19A1蛋白熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組和AFB1處理組，BPA處理組中僅可在擴(kuò)散卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞局部位置檢測(cè)到微弱CYP19A1蛋白熒光。

A. CYP19A1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B. CYP19A1 蛋白表達(dá)檢測(cè)；C. CYP19A1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。柱上不同字母表示差異顯著(P < 0.05)，下同A. Relative levels of CYP19A1 mRNA; B. The detection of CYP19A1 protein; C. Relative levels of CYP19A1 protein. Bars with different superscripts are significantly different (P<0.05), the same as below圖2 不同處理組牦牛成熟COCs中CYP19A1表達(dá)的檢測(cè)Fig.2 Detection for CYP19A1 in yak mature COCs from different groups

2.2 AFB1和BPA對(duì)COCs成熟過程中E2合成的影響

為確定AFB1和BPA在上調(diào)或下調(diào)CYP19A1時(shí)對(duì)E2合成的影響，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)比較AFB1和BPA處理組與對(duì)照組E2的表達(dá)水平與變化，結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組中E2含量(334.27±12.90) pg·mL-1相比，AFB1處理組E2含量顯著增加(P<0.05)，為(426.54±14.26) pg·mL-1，BPA處理組E2水平顯著下降(P<0.05)，為(214.52±10.68) pg·mL-1。

2.3 外源E2和CYP19A1調(diào)控影響細(xì)胞自噬相關(guān)因子表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)不同處理組細(xì)胞自噬相關(guān)因子ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA水平結(jié)果如圖5A所示，在10-7mol·L-1E2和AFB1處理組，ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，其中LC3-Ⅰ在10-7mol·L-1E2處理組表達(dá)水平最高，與AFB1處理組差異顯著(P<0.05)。LC3-Ⅱ在AFB1處理組最高，與對(duì)照組差異顯著。ATG5、BECLIN1 mRNA水平在10-7mol·L-1E2和AFB1處理組差異均不顯著(P>0.05)，增加幅度也低于LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ幅度。與對(duì)照組相比，BPA處理組ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，而LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

不同處理組細(xì)胞自噬相關(guān)因子ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)相對(duì)水平如圖5B、5C所示，ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)水平均顯著增加(P<0.05)，其中LC3-Ⅱ和ATG5在10-7mol·L-1E2處理組表達(dá)水平最高，與AFB1處理組差異顯著(P<0.05)，LC3-Ⅰ和BECLIN1在兩組差異不顯著(P>0.05)。BPA處理組ATG5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，而BECLIN1表達(dá)水平與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。比較不同處理組LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比率相對(duì)量，結(jié)果如圖6所示，其在10-7mol·L-1E2和AFB1處理組顯著上升(P<0.05)，其中10-7mol·L-1E2最高，為對(duì)照組的(2.02±0.32)倍，AFB1處理組為對(duì)照組(1.96±0.15)倍。BPA處理組LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比率相對(duì)量顯著降低(P<0.05)，為對(duì)照組的(0.82±0.25)倍。

A. 對(duì)照組COCs中CYP19A1蛋白檢測(cè); B. AFB1處理組中COCs中CYP19A1蛋白檢測(cè)；C. 10-7mol·L-1 E2處理組COCs中CYP19A1蛋白檢測(cè); D. BPA處理組中COCs中CYP19A1蛋白檢測(cè)。標(biāo)尺=100 μmA. Fluorescence of CYP19A1 in COCs from control group; B. Fluorescence of CYP191 in COCs from AFB1 group; C. Fluorescence of CYP19A1 in COCs from 10-7 mol·L-1 E2 group; D. Fluorescence of CYP19A1 in COCs from BPA group. Bar=100 μm圖3 不同處理組牦牛成熟COCs中CYP19A1蛋白免疫熒光標(biāo)記Fig.3 Staining of CYP19A1 protien in yak mature COCs from different groups

免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同處理組COCs細(xì)胞自噬相關(guān)因子ATG5、BECLIN1蛋白如圖7所示，對(duì)照組COCs中卵母細(xì)胞和周圍卵丘細(xì)胞均可觀察到ATG5蛋白熒光，BECLIN1僅在擴(kuò)散卵丘細(xì)胞和局部卵母細(xì)胞弱表達(dá)。10-7mol·L-1E2和AFB1處理組ATG5和BECLIN1蛋白熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，卵母細(xì)胞和擴(kuò)散卵丘細(xì)胞均可檢測(cè)到ATG5和BECLIN1蛋白，BECLIN1在10-7mol·L-1E2處理組熒光分布更廣，強(qiáng)度高于AFB1處理組。BPA處理組僅可檢測(cè)到微弱ATG5和BECLIN1蛋白熒光，且卵丘細(xì)胞未發(fā)生充分?jǐn)U散。

圖4 不同處理組E2的表達(dá)水平Fig.4 Levels of E2 in different groups

2.4 外源E2和CYP19A1調(diào)控影響牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力

統(tǒng)計(jì)不同處理組牦牛卵母細(xì)胞成熟率、孤雌激活胚胎卵裂率和囊胚率，結(jié)果如表2所示，10-7mol·L-1E2和AFB1處理組卵母細(xì)胞成熟率和胚胎卵裂率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中10-7mol·L-1E2和AFB1處理組卵母細(xì)胞成熟率差異顯著(P<0.05)，以成熟卵母細(xì)胞為基數(shù)，10-7mol·L-1E2和AFB1處理組胚胎卵裂率差異不顯著(P>0.05)。BPA處理組中，卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率與對(duì)照組相比，顯著降低(P<0.05)。以卵裂胚胎為基數(shù)統(tǒng)計(jì)囊胚率，結(jié)果顯示4個(gè)處理組囊胚率差異不顯著(P>0.05)。

A. ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B. ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)檢測(cè)；C. ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平A. Relative levels of ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA; B. The detection of ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ protein; C. Relative levels of ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ protein圖5 不同處理組牦牛成熟COCs中ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ 表達(dá)的檢測(cè)Fig.5 Detection for ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ in yak mature COCs from different groups

圖6 不同處理組LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比率的變化Fig.6 Changes of ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰ in different groups

3 討 論

細(xì)胞色素家族成員參與動(dòng)物下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控[21-22]，CYP19A1作為細(xì)胞色素家族核心成員，牛顆粒細(xì)胞中miR-326和CYP19A1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，調(diào)控miR-326可通過環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)下調(diào)CYP19A1轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致靶細(xì)胞E2分泌減少[13-14]。除CYP19A1對(duì)激素調(diào)控外，卵巢中激素水平在一定程度也可以影響CYP19A1表達(dá)，如FSH可激活CYP19A1基因啟動(dòng)子而改變其表達(dá)水平，誘導(dǎo)E2合成，進(jìn)而影響卵丘細(xì)胞質(zhì)量[16]。本研究參照前人研究成果，在牦牛COCs成熟過程中加入AFB1或BPA[18-19]均可調(diào)控CYP19A1表達(dá)，證實(shí)AFB1或BPA在生殖細(xì)胞作用效果與人絨毛膜癌細(xì)胞作用效果具有相似性，并影響生殖細(xì)胞E2合成，造成卵母細(xì)胞成熟率和早期胚胎發(fā)育能力發(fā)生改變。牦牛COCs成熟過程中加入10-7mol·L-1外源E2，CYP19A1表達(dá)水平下降，證實(shí)高濃度外源E2負(fù)反饋調(diào)節(jié)CYP19A1表達(dá)，表明動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過程中CYP19A1與E2之間存在相互調(diào)控關(guān)系。

A. 對(duì)照組COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測(cè); B. 10-7mol·L-1 E2處理組COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測(cè); C. AFB1處理組中COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測(cè)；D. BPA處理組中COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測(cè)。標(biāo)尺=100 μmA. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from control group; B. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from 10-7mol·L-1 E2 group; C. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from AFB1 group; D. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from BPA group. Bar=100 μm圖7 不同處理組牦牛成熟COCs中ATG5和BECLIN1蛋白免疫熒光標(biāo)記Fig.7 Immunofluorescence staining of ATG5 and BECLIN1 protein in yak mature COCs from different groups

表2 不同處理組卵母細(xì)胞成熟率與胚胎發(fā)育能力統(tǒng)計(jì)

為模擬牦牛COCs體內(nèi)生長(zhǎng)條件，研究中并未采用基因干擾技術(shù)精確調(diào)控卵丘細(xì)胞CYP19A1表達(dá)，而利用安全生理濃度AFB1或BPA改變牦牛COCs中CYP19A1表達(dá)，在有效避免AFB1或BPA細(xì)胞毒性效應(yīng)的基礎(chǔ)上，探索其對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響。相關(guān)研究證實(shí)在體細(xì)胞中，BPA除調(diào)控CYP19A1外，還可調(diào)控CYP1A1表達(dá)[19]，表明AFB1和BPA對(duì)細(xì)胞色素酶家族成員的調(diào)控具有多樣性和復(fù)雜性，提示后續(xù)建立卵丘-卵母細(xì)胞共培養(yǎng)體系實(shí)現(xiàn)CYP19A1基因精確調(diào)控技術(shù)，對(duì)于探索CYP19A1調(diào)控COCs發(fā)育分子機(jī)制至關(guān)重要。除CYP19A1外，CYP2C8、CYP17A1、CYP11A1也參與動(dòng)物生理調(diào)控，且多數(shù)參與細(xì)胞自噬調(diào)控[23-25]，而其是否參與牦牛生殖調(diào)控仍需結(jié)合牦牛自身生殖特性進(jìn)一步探索。

E2作為內(nèi)源性激素可調(diào)控多種動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)育等生物學(xué)事件，如E2刺激豬卵母細(xì)胞成熟過程中Ca2+離子釋放[26]，維持動(dòng)物COCs活力，促進(jìn)卵子發(fā)育[27-28]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，10-7mol·L-1E2調(diào)控牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中卵丘擴(kuò)散相關(guān)因子前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2 (prostaglandin endoperoxide synthase 2, PTGS2)、透明質(zhì)酸合成酶2(hyaluronan synthase 2, HAS2)、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(tumour necrosis factor alpha-induced protein 6, TNFAIP6)表達(dá)，利于卵丘細(xì)胞擴(kuò)散[29]。本研究用外源性E2作用牦牛COCs，在證實(shí)其可調(diào)控卵母細(xì)胞自噬水平，并影響其早期發(fā)育能力的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)CYP19A1調(diào)控的內(nèi)源性E2也具有相似生物學(xué)功能，如BPA抑制CYP19A1表達(dá)下調(diào)內(nèi)源性E2合成(圖4)，進(jìn)而影響卵丘細(xì)胞擴(kuò)散程度(圖7)，進(jìn)一步表明E2促進(jìn)動(dòng)物卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的生理功能。豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中高濃度外源E2降低卵母細(xì)胞成熟率，但可抑制細(xì)胞凋亡水平[26]，表明E2生理功能具有物種差異性。除此之外，卵母細(xì)胞成熟過程中E2分子機(jī)制存在復(fù)雜性，如本研究證實(shí)外源性和內(nèi)源性E2均可調(diào)控牦牛卵母細(xì)胞自噬，該發(fā)現(xiàn)與相關(guān)研究證實(shí)E2可激活其受體ESR調(diào)控細(xì)胞自噬具有相似性[26]。E2調(diào)控自噬的效果受低氧、溫度應(yīng)激等因素影響，如溫度應(yīng)激時(shí)，熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)作為分子伴侶導(dǎo)致ESRs構(gòu)象改變，影響自噬相關(guān)基因表達(dá)[26]，提高卵母細(xì)胞對(duì)熱休克等生理應(yīng)激的適應(yīng)性[26]，使家畜性腺細(xì)胞中其他激素合成發(fā)生改變[30-31]。

雖然不同物種間生殖激素調(diào)節(jié)自噬機(jī)制不同，但啟動(dòng)細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)因子存在相似性[32-33]。本研究通過改變CYP19A1水平，影響了E2合成，或加入外源性E2，發(fā)現(xiàn)采用兩種不同方法調(diào)控E2水平均可改變自噬相關(guān)因子ATG5、BECLIN1、LC3表達(dá)(圖5)。ATG5、BECLIN1、LC3表達(dá)水平在促進(jìn)內(nèi)源E2表達(dá)和加入外源E2的兩個(gè)處理組之間存在差異，抑制內(nèi)源E2，ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ 降低幅度也存在差異，表明內(nèi)源E2和外源E2調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制及其主要作用靶標(biāo)基因存在一定差異。細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)LC3-II/LC3-I比率差異提示LC3核心因子轉(zhuǎn)化發(fā)生改變，且LC3-II水平與自噬小體的數(shù)量相關(guān)[34-36]。本研究中加入外源E2和促進(jìn)內(nèi)源E2表達(dá)均可提高LC3-II/LC3-I比率相對(duì)水平，抑制內(nèi)源E2降低兩者比率相對(duì)水平，提示LC3在E2調(diào)控哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞自噬中的生物學(xué)作用不能忽視。

為探索COCs成熟過程中調(diào)控CYP19A1對(duì)牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力影響，研究分別以未成熟卵母細(xì)胞數(shù)量、成熟卵母細(xì)胞數(shù)量和卵裂胚胎為基數(shù)比較各處理組成熟率、卵裂率和囊胚率差異，發(fā)現(xiàn)CYP19A1主要影響早期卵母細(xì)胞成熟和胚胎卵裂，在卵裂胚胎發(fā)育至囊胚階段影響并不顯著，而胚胎早期發(fā)育卵裂之前主要生物事件為胚源基因激活[37-38]，可見CYP19A調(diào)控雌激素合成主要影響卵母細(xì)胞的早期發(fā)育能力。豬早期胚胎發(fā)育研究表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)卵母細(xì)胞自噬可改變囊胚細(xì)胞凋亡水平，并通過細(xì)胞命運(yùn)改變囊胚細(xì)胞數(shù)、ICM和TE分布，影響囊胚質(zhì)量[39]。因此，后續(xù)仍需通過檢測(cè)囊胚相關(guān)分子變化，從囊胚質(zhì)量、胚胎附植潛能、細(xì)胞分化等角度深入探索CYP19A1促進(jìn)E2調(diào)控細(xì)胞自噬，影響卵母細(xì)胞后續(xù)發(fā)育能力的分子機(jī)制。

牦牛長(zhǎng)期生活在高原環(huán)境，為季節(jié)性發(fā)情家畜，其生殖能力相對(duì)同種屬其他家畜處于較低水平[40-41]。改善牦牛繁殖調(diào)控技術(shù)已成為牦牛高效繁育的核心問題，而提高生殖激素的作用效果對(duì)牦牛繁殖調(diào)控技術(shù)的提升至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)利用小分子藥物調(diào)控CYP19A1水平影響牦牛COCs激素合成，進(jìn)一步影響卵母細(xì)胞成熟和胚源基因激活前的發(fā)育潛能，揭示牦牛繁殖調(diào)控過程中CYP19A1可作為標(biāo)靶分子改善生殖激素作用效果，提示篩選相關(guān)藥物或靶標(biāo)信號(hào)分子調(diào)控CYP19A1表達(dá)水平，有助于協(xié)同生殖激素調(diào)控牦牛繁殖狀態(tài)，促進(jìn)牦牛輔助繁殖技術(shù)發(fā)展。

4 結(jié) 論

牦牛COCs成熟過程中CYP19A1上調(diào)內(nèi)源性E2水平，其上調(diào)的E2與外源性E2生理功能具有相似性，均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生，提升早期卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。研究結(jié)果為深入探索生殖激素調(diào)控哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。