鄒 垚，王梓瑜，李 皎，李興欣，申亞瓊，徐 敬，金 焰

（昆明理工大學附屬昆華醫(yī)院/云南省第一人民醫(yī)院肝膽外科，云南 昆明 650032）

膽管細胞癌（cholangiocarcinoma，CCA）是一種具有高度惡性的難治性肝膽系統(tǒng)腫瘤，起源于膽管上皮細胞，約占所有原發(fā)性肝膽腫瘤的15%[1]。盡管在大多數(shù)國家膽管癌被認為是一種發(fā)病率 ＜6/100 000 的相對冷僻的疾病，但在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率及死亡率不斷上升[2-4]。CCA 主要生物學特征是在癌癥早期就有淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移擴散的侵襲性行為，盡管通過近幾十年的研究，對于CCA 的認識、診斷及治療有了很大程度提升，但在過去的10 a 中，患者的預后并沒有實質(zhì)性的進展，5 a 生存率（7%～20%）及術(shù)后復發(fā)率依然不盡人意[5-9]。近些年，在上皮起源的癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中，觀察到上皮細胞間連接、黏附的分解和細胞角蛋白絲的丟失，同時伴隨著遷移功能的獲得并產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)成分，轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細胞，細胞就可以離開其在上皮中的原始定位，從而向其它區(qū)域擴散，這一過程被命名為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn) 化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[10]。其中Snail 作為EMT 過程中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在體內(nèi)通過抑制E-鈣黏蛋白表達誘導上皮細胞發(fā)生EMT 的表型變化，使腫瘤細胞在進展期間獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性[11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2 參與了Snail 的基因表達及其所誘導的EMT 的調(diào)控，因此LOXL2 是Snail 的上游調(diào)節(jié)因子。

本實驗研究旨在了解LOXL2 及Snail 在膽管癌中的表達關系以及臨床意義，分析LOXL2 及Snail 與臨床病理特征的關系，初步探討LOXL2及Snail 在膽管癌的研究意義，為進一步在臨床前及臨床研究提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集云南省第一人民醫(yī)院于2014 年1 月至2021 年4 月肝膽外科收治并行根治性手術(shù)切除的膽管癌患者的病理組織標本31 例。31 例患者年齡46～76 歲，平均年齡60.1 歲，其中男性16 例，女性15 例。同時收集記錄臨床病理參數(shù)，包括腫瘤部位、腫瘤大?。ㄒ阅[瘤最大直徑表示）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、患者性別、年齡、術(shù)后生存時間。31 例患者在行根治性手術(shù)切除前均未接受放療、化療或其他輔助治療。所有病例均經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院病理科確診為膽管癌。以癌旁正常膽管組織作對照。隨訪日期到2022 年3月1 日結(jié)束。

1.2 免疫組化

病理組織采用10%甲醛固定、脫水透明后石蠟包埋、制作3 μm 厚組織切片，67 ℃烤片40 min，二甲苯溶液浸泡2 次各15 min，依次不同濃度乙醇（100%、100%、95%、85%、75%）各2 min，抗原修復采用檸檬酸鈉緩沖液（福州邁新生物，0.01 M pH6.0）高火加熱3 min，后自然冷卻至室溫，3%過氧化氫（福州邁新生物）避光孵育15 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%牛血清蛋白（德國Biofroxx 公司）封閉非特異性抗原位點60 min，孵育一抗：單克隆鼠抗Snail+SLUG 抗體（1∶500，英國Abcam 公司，貨號ab224731）4 ℃過夜；孵育一抗：多克隆兔抗LOXL2 抗體（1∶100，英國Abcam 公司，貨號ab96233）4 ℃過夜，孵育二抗（抗小鼠/兔IgG 聚合物，福州邁新生物，貨號KIT-9921）18 min，顯微鏡下控制DAB 顯色（北京中杉金橋公司），蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，溫水浸泡反藍，脫水，二甲苯透明，中性樹膠（福州邁新生物）封片，正置熒光顯微鏡（德國ZEISS公司）下鏡檢采集數(shù)據(jù)。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

評分方法參考既往研究[12-14]所述，對染色結(jié)果使用Image pro plus 軟件進行判定，綜合2 種蛋白的染色面積和強度分別進行評分，隨后得分相加得到2 種蛋白此次免疫組織化學染色結(jié)果。染色強度評判標準：棕褐色2 分，棕黃色1 分，淡黃色或無染色0 分。染色面積評判標準：棕色面積 ＜ 50%得分為0 分，棕色面積 ＞ 50%得分為1 分。染色結(jié)果分別交給2 名病理科醫(yī)師評估，染色面積和染色強度分值相加，總分≥2 分判定為高表達，＜ 2 分為低表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，2 種蛋白表達強度相關性分析采用Spearman 法，LOXL2、Snail 蛋白表達強度與臨床病理參數(shù)相關性分析使用Fisher 確切概率法。繪制Kaplan-Meier 總體生存曲線，Log-rank 檢驗分析總體生存率差異，采用Cox 回歸模型進行多因素生存分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌病理組織中LOXL2 和Snail 表達及相關性

LOXL2 表達集中在胞質(zhì)和核周，以胞質(zhì)為主，見圖1；Snail 表達集中在胞質(zhì)及胞核，癌旁正常膽管組織未見2 種蛋白表達，見圖1。LOXL2 高表達有16 例，低表達有15 例；Snail 高表達有13 例，低表達有18 例。其中10 例樣本同時存在2 種蛋白的高表達，12 例同時存在2 種蛋白的低表達。LOXL2 蛋白的表達與Snail 蛋白的表達存在著一定的正相關關系（r=0.430，P=0.016），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見表1。

圖1 膽管癌病理組織和癌旁正常膽管組織LOXL2 和Snail 表達（×200）Fig. 1 Expression of LOXL2 and Snail in pathological tissues and adjacent normal bile duct tissues of cholangiocarcinoma（×200）

表1 膽管癌病理組織中LOXL2 和Snail 表達相關性（n）Tab.1 Correlation between LOXL2 and Snail expression in pathological tissues of cholangiocarcinoma（n）

2.2 膽管癌病理組織中LOXL2 和Snail 表達與臨床病理參數(shù)的關系

Snail 高表達與膽管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系（P=0.025），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），與其余臨床病理參數(shù)均無顯著相關性（P＞ 0.05）；LOXL2 表達與腫瘤大小、腫瘤位置、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者性別、年齡等臨床病理特征均無顯著相關性（P＞ 0.05），見表2。

2.3 31 例膽管癌患者生存分析

LOXL2 與Snail 免疫組化染色結(jié)果與生存結(jié)果分析表明，Snail 高表達的病例術(shù)后總體生存率較低（LogRankP=0.032），見圖2，同時LOXL2 高表達的病例術(shù)后總體生存率較低（LogRankP=0.046），見圖3。單因素總體生存率分析結(jié)果表明Snail 高表達、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與膽管癌患者更差的預后相關（P＜ 0.05）；多因素Cox 回歸模型分析結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能是影響膽管癌患者預后的獨立因素（P=0.017），見表3。

表3 膽管癌患者總生存率預后因素的單因素和多因素分析Tab.3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors for overall survival of patients with cholangiocarcinoma

圖2 膽管癌患者術(shù)后總生存期與Snail 表達的關系Fig. 2 Association between postoperative overall survival and Snail expression in patients with cholangiocarcinoma

圖3 膽管癌患者術(shù)后總生存期與LOXL2 表達的關系Fig. 3 Association between postoperative overall survival and LOXL2 expression in patients with cholangiocarcinoma

3 討論

由于膽管癌早期就表現(xiàn)出侵襲性行為，導致手術(shù)相關風險較大、根治性手術(shù)切除率低、術(shù)后復發(fā)率高以及較低的術(shù)后總生存率。因此了解膽管癌中導致侵襲性行為的相關機制是目前研究的一個重點，從而為預防癌癥進展和復發(fā)提供一些新的治療靶點，進而改善膽管癌的治療效果。

2003 年，G Akiri 等[15]首次證明LOXL2 可以促進腫瘤纖維化并增強乳腺癌的侵襲性。自那時以來，LOXL2 因其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中復雜且關鍵作用而引起了越來越多的關注。在許多癌癥中觀察到LOXL2 異常高表達。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸部鱗狀細胞癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18]、結(jié)腸癌[19]、胃癌[20]、宮頸癌[21]、肝癌[22]和食管癌[23]中，LOXL2 高表達與生存時間縮短和預后不良有關。LOXL2 促進腫瘤的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，導致癌癥的惡性進展[24-25]。LOXL2 可以通過多種信號通路促進EMT 并參與腫瘤微環(huán)境的組成，是腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的“幫兇”，其高表達是許多癌癥患者的風險因素[26]。同時，高應鴻等[27]研究發(fā)現(xiàn)在48 例膽管癌患者中，LOXL2 的高表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關。D Bergeat 等[28]通過對80例肝內(nèi)膽管癌患者進行研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2 的高表達與不良預后有關，LOXL2 高表達是影響肝內(nèi)膽管癌患者總生存期和無病生存期的獨立預后因素，并提出LOXL2 有希望成為肝內(nèi)膽管癌新的預后標志物和治療靶點。在本研究中，LOXL2 在膽管癌病理組織中呈現(xiàn)異常表達，然而其高表達與患者臨床病理參數(shù)無明顯相關性，這可能與本研究的樣本容量小、免疫組織化學染色半定量分析結(jié)果準確性的差異有關，希望未來能有多中心、更大樣本量以及更精細的實驗設計進行更深入的研究。對膽管癌患者術(shù)后生存的隨訪分析顯示，LOXL2高表達患者的術(shù)后生存率相對較低，提示在一定程度上LOXL2 的表達可以預測膽管癌患者的預后。

Snail 最早在黑腹果蠅中被發(fā)現(xiàn)[29]，并被證明對中胚層的形成至關重要[30]。EMT 可由不同的信號分子觸發(fā)，如WNTs、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生 長因子（epidermal growth factor）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、轉(zhuǎn)化生 長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Notch、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），并且這些信號分子都已被證實可以在不同的細胞環(huán)境中誘導Snail，從而使得腫瘤細胞獲得侵襲性，向遠處轉(zhuǎn)移。過往研究表明，Snail 在正常膽管細胞中不表達，但在膽管癌細胞中存在過表達情況，且其過表達促進腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強?？祻姷萚14]對55 例肝內(nèi)膽管癌患者病理組織標本進行Snail 蛋白免疫組織化學染色研究，結(jié)果提示肝內(nèi)膽管癌患者病理組織標本Snail 高表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預后有關，并認為Snail可以預測肝內(nèi)膽管癌患者預后，同時也有望成為生物治療的作用靶點；X Y Huang 等[13]對140 例肝內(nèi)膽管細胞癌病理組織標本進行相關EMT 指標的研究中，也得到了類似結(jié)果。在本次對31 例膽管癌病理組織樣本研究中，發(fā)現(xiàn)膽管癌患者病理組織中Snail 呈現(xiàn)異常表達，并且其表達與臨床病理參數(shù)相關。結(jié)果表明，Snail 的高表達與侵襲轉(zhuǎn)移性指標有關。對膽管癌患者術(shù)后生存的隨訪分析顯示，Snail 高表達的膽管癌患者的術(shù)后生存率相對較低。對多種變量進行膽管癌患者總生存期預后因素單因素和多因素分析的結(jié)果表明，Snail 和侵襲性指標可作為預測膽管癌患者預后的指標。結(jié)合以往的研究，猜測膽管癌中Snail 高表達可能會誘導腫瘤細胞EMT 過程的進展，進而提高侵襲和轉(zhuǎn)移能力。因此，筆者預測，對于Snail 高表達的膽管癌患者，可以對Snail 進行靶向沉默，從而減緩患者腫瘤遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)，這為膽管癌靶向藥物的研究和開發(fā)提供了一個潛在位點。同時，對于膽管癌患者，術(shù)后對其病理組織常規(guī)行免疫組織化學染色，了解Snail 表達情況，可對膽管癌患預后進行一定評估并為早期干預提供有力數(shù)據(jù)，對延長術(shù)后總體生存時間具有重要意義。

Snail 在EMT 過程中主要抑制E-鈣黏蛋白的合成，其可通過Snail 和Gfi（SNAG）結(jié)構(gòu)域招募mSin3A 協(xié)同加壓復合物和組蛋白去乙?；福℉DAC），以抑制E-鈣粘蛋白的表達[31]，在這一過程中H Peinado 等[32]發(fā)現(xiàn)LOXL2 可以與SNAG結(jié)構(gòu)域相互作用與Snail 協(xié)同抑制E-鈣黏蛋白，同時Snail 介導的EMT 依賴于Snail 蛋白結(jié)構(gòu)中完整K98 和K137 兩個賴氨酸殘基，LOXL2 與K98和K137 殘基相互作用對維持Snail 穩(wěn)定性有著至關重要的作用。此外Snail 的穩(wěn)定性還受到GSK3β 依賴性磷酸化和泛素化的精細控制，GSK3β 以兩種不同的基序磷酸化Snail，誘導其核輸出并與β-Trcp 結(jié)合，從而導致Snail 降解，而LOXL2 可以抵消這一過程，從而使Snail 趨于穩(wěn)定[33]。在喉癌和乳腺癌中，觀察到LOXL2 的過度表達促進其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與熱休克蛋白5（HSPA5）相互作用，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的IRE1-XBP1 信號通路。LOXL2依賴的IRE1-XBP1 信號通路進而可以激活誘導幾種EMT 轉(zhuǎn)錄因子如Snail 和ZEB 的表達上調(diào)，進而有利于這些腫瘤的高侵襲性和轉(zhuǎn)移[34]。在肝癌中發(fā)現(xiàn)LOXL2 能夠促進腫瘤通過Snail-FBP1軸上調(diào)HIF-1α/VEGF 信號通路，促進肝癌的微血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移[35]。可以看出LOXL2 通過細胞內(nèi)和細胞外多種通路調(diào)節(jié)Snail 蛋白的表達，然而在膽管癌中關于LOXL2 與Snail 表達相關性尚不明確，因此收集云南省第一人民醫(yī)院膽管癌患者病理組織標本并對病理組織中LOXL2 及Snail 2 種蛋白表達進行免疫組化檢測。在31 例膽管癌病理組織標本中，研究結(jié)果表明，在膽管癌病理組織樣本中LOXL2 與Snail 存在共表達情況，并且LOXL2 的表達與Snail 的表達存在一定的正相關關系，同時2 種蛋白表達對患者術(shù)后總生存期的影響具有一定的相似性，因此推測二者在膽管癌中具有一定的協(xié)同性，此結(jié)果與以往在惡性腫瘤中的研究具有一定的相似性。但對于膽管癌中LOXL2 與Snail 表達調(diào)節(jié)涉及的具體方式及信號通路有待通過進一步的實驗進行探討和研究。

綜上所述，LOXL2 和Snail 在膽管癌中呈現(xiàn)過表達，Snail 過表達與膽管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，同時淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響膽管癌患者預后的獨立因素。在膽管癌中LOXL2 和Snail 表達存在一定的正相關關系。LOXL2 和Snail 過表達的膽管癌患者術(shù)后生存率相對較低，提示LOXL2 和Snail 可能是膽管癌患者預后的影響因素，有望成為生物治療的新靶點。