王 峰 ，楊 偉 ，錢佃倫 ，梅 松 ，王文杰 ，馮科翔 ，白向鋒

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，云南 昆明 650500;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科;3）心臟外科，云南 昆明 650032）

急性的心肌梗死是一種危害人類健康的缺血性心肌疾病，急性心肌梗死是由冠狀動(dòng)脈的缺血和缺氧造成的，可導(dǎo)致心力衰竭、猝死等其他不良癥狀[1-2]。如今臨床上多使用再灌注治療的方法，因?yàn)槠淠艽龠M(jìn)血流迅速回流到心肌缺血區(qū)[3]，雖然再灌注可以改善心肌功能，限制梗塞范圍，很大程度的降低了死亡率，但是再灌注會(huì)對(duì)心肌帶來其他的損傷，目前心肌缺血再灌注損傷的主要特征為心肌細(xì)胞死亡、微血管破壞及炎癥等[4]，此外還會(huì)導(dǎo)致心律失常和心肌梗死[5]。就目前針對(duì)心肌缺血再灌注損傷的有效干預(yù)方式很少，且治療方法效果甚微，因此急需探討心肌缺血再灌注損傷后病理過程中的分子機(jī)制，從而為臨床治療找到新的方向和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物、分組及細(xì)胞10 只SPF 級(jí)雌性C57小鼠（體重18～22 g）購買于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，所有實(shí)驗(yàn)方法和操作都得到昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（kmmu20220575）。實(shí)驗(yàn)小鼠可以自由的選擇食物和水，同時(shí)通風(fēng)良好，將10 只小鼠隨機(jī)性分為2 組，分別為假手術(shù)組和心肌缺血再灌注組，假手術(shù)組為打開胸腔不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，心肌缺血再灌注組為打開胸腔用6-0 縫合線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈制造心肌缺血再灌注模型。小鼠心肌細(xì)胞（HL-1）購買于賽百慷生物技術(shù)股份有限公司（上海）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司（Biosharp），胎牛血清（FBS）和高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/High Glucose 1X）購自以色列生物科技公司（BI），雙抗（PS）和0.25%胰蛋白酶（TP）購自賽默飛世爾科技公司（Gibco），無水乙醇、氯仿、異丙醇購自天津飛船有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bester qPCR RT Kit gDNA Remover）和qPCR 擴(kuò)增試劑盒（Bester Sybr Green qPCR Master Mix）購自上海星漢生物科技有限公司（DBI），Notch1 和β-actin 抗體購自萬類生物。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器呼吸機(jī)（小動(dòng)物使用）購自上海贊德醫(yī)療器械有限公司，高速低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀和熒光定量PCR 儀購自美國(guó)伯樂公司（Bio-Rad），雪花制冰機(jī)購自常熟雪科有限公司，超凈工作臺(tái)購自蘇州馮氏有限公司，細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技公司（Thermo）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HL-1 細(xì)胞培養(yǎng)HL-1 細(xì)胞放置于25 cm3的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在配置好的 89% DMEM 高糖、10% FBS 和 1% PS（雙抗）的完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，將HL-1 細(xì)胞懸液加入到含完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 OGD 模型構(gòu)建將原先HL-1 細(xì)胞的完全培養(yǎng)基（89% DMEM 高糖+10% FBS+1% PS）更換為DMEM 的無糖培養(yǎng)基并放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)以5% O2、95%N2的條件進(jìn)行培養(yǎng)12 h，而后把DMEM 無糖培養(yǎng)基再更換為原先使用的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后收集細(xì)胞。

1.2.3 miR-582-5p 的 Mimics 和 Inhibitor 轉(zhuǎn)染將HL-1 細(xì)胞接種至6 孔板中，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明 書（ribo FECTTMCP）將miR-582-5p 的Mimics、mimics NC、Inhibitor 和inhibitor NC 轉(zhuǎn)染至6 孔板中，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至48 h 收集細(xì)胞。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)將HL-1 細(xì)胞接種到 96 孔板上。根據(jù)分組對(duì)每孔進(jìn)行miR-582-5pmimics和Inhibitor 的轉(zhuǎn)染，保持每孔總體積一樣，轉(zhuǎn)染48 h 后使用倒置顯微鏡來觀察細(xì)胞狀態(tài)，隨后用電腦拍照保存。在顯微鏡拍照后，往每孔加入10 μL 的CCK-8 檢測(cè)試劑，置于 37 ℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD 值，導(dǎo)出數(shù)據(jù)分析細(xì)胞活力。

1.2.5 MIR 小鼠模型構(gòu)建在手術(shù)開始前對(duì)手術(shù)室進(jìn)行紫外線殺菌30 min 以上，整個(gè)手術(shù)過程保持在無菌環(huán)境下。10 只SPF 級(jí)小鼠在術(shù)前均禁食24 h，給予正常的飲水，在手術(shù)前對(duì)隨機(jī)分組的小鼠進(jìn)行稱重、編號(hào)和標(biāo)記。模型制作參考董鑫法[6]，使用0.5%戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉（濃度為50 mg/kg），將呼吸機(jī)和心電圖機(jī)與小鼠連接上，使用推子將小鼠胸部位毛發(fā)剔除，碘伏消毒。從胸部左邊依次打開皮膚、各層肌肉組織，鈍性分離3 和4 肋間的肌肉組織，將心臟充分暴露出來同時(shí)打開心包，從左心耳下方位置使用縫合線從冠狀動(dòng)脈左前降支（left anterior decending branch，LAD）下方穿出，然后收縮手術(shù)結(jié)，將會(huì)看到心臟缺血部位開始發(fā)白，此外心電圖上ST段顯著抬高，表明MRI 小鼠模型構(gòu)建成功。45 min后解除結(jié)扎線恢復(fù)血供2 h，待心前區(qū)重新變?yōu)榧t色表明再灌注成功。

1.2.6 qPCR 實(shí)驗(yàn)取小鼠的心臟缺血部位和對(duì)照組同樣部位心臟組織，用qPCR 方法驗(yàn)證了miR-582-5p 和Notch1 的表達(dá)。從Pubmed 中獲取miR-582-5p、Notch1 及內(nèi)參U6、GAPDH 的核酸序列，利用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)并合成，具體序列，見表1。對(duì)收集的小鼠心臟組織利用Trizol 進(jìn)行裂解，按照試劑盒說明書Rnaiso plus提取小鼠心臟組織的總RNA。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行總RNA 濃度和純度的測(cè)量，根據(jù)試劑說明書Bester qPCR RT Kit gDNA Remover 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，并根據(jù)試劑說明書Bester Sybr Green qPCR Master Mix（95 ℃/10 s，58 ℃/30 s，72 ℃/30 s，共40 次循環(huán)）進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，最后根據(jù)公式2-△△CT來計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 實(shí)驗(yàn)加入RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑雞尾酒片混合后，勻漿、超聲提取樣品總蛋白。BCA 法定量蛋白后，加入上樣緩沖液，煮沸變性。取60 μg 總蛋白上樣，PAGE 膠分離后15 V，30 min 將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜。將PVDF 于5%脫脂牛奶中封閉2 h。棄去牛奶，加入TBST 稀釋好的一抗（Notch1：1∶1 000；βactin：1∶5 000）4 ℃過夜。TBST 漂洗后孵育二抗（goat-anti-rabbit，1∶2 000）室溫輕搖2 h。TBST漂洗后HRP-ECL 法發(fā)光，使用Geldoc 凝膠成像分析儀，BIO-RAD 采集圖片，Image J 測(cè)量灰度，β-actin 為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用IBM SPSS Statistics 21 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，2 組之間分析比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3 組及以上分析比較使用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIR 后心肌組織中和OGD 后心肌細(xì)胞中miR-582-5p 上調(diào)和Notch1 下調(diào)

使用qPCR 對(duì)miR-582-5p 和Notch1 在心肌缺血再灌注小鼠和HL-1 細(xì)胞OGD 模型中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p在小鼠缺血心臟組織和OGD 細(xì)胞中都明顯異常升高，見圖1A、圖1B；而Notch1 卻明顯表達(dá)下降，見圖1C、圖1D。

圖1 miR-582-5p 和Notch1 在心肌缺血再灌注小鼠心臟組織和HL-1 細(xì)胞OGD 模型中的表達(dá)Fig. 1 Expression of miR-582-5p and Notch 1 in cardiac tissue and HL-1 cell OGD model of myocardial ischemia-reperfusion mice

2.2 miR-582-5p 可調(diào)控Notch1 的表達(dá)

通過TargetScan 網(wǎng)站（https://www.targetscan.org/vert_72/）對(duì)miR-582-5p 與Notch1 的靶向結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miR-582-5p 與Notch1 可以靶向結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)共有7 對(duì)堿基，見圖2A。在HL-1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-582-5p 的Inhibitor 和Mimics，與NC 組相比，結(jié)果表示Inhibitor 能夠顯著降低miR-582-5p 在HL-1 細(xì)胞中的表達(dá)水平，Mimics 能明顯提高miR-582-5p 在HL-1 細(xì)胞中的表達(dá)，見圖2B。于是同時(shí)用PCR 和WB檢測(cè)了Notch1 的表達(dá)水平，與NC 組相比，miR-582-5p 的Inhibitor 轉(zhuǎn)染后，Notch1 的表達(dá)明顯上調(diào)，Mimics 轉(zhuǎn)染后，Notch1 的表達(dá)卻明顯降低，見圖2C、圖2D 和圖2E，發(fā)現(xiàn)無論是在mRNA水平還是蛋白水平，Notch1 都受到了影響。

圖2 miR-582-5p 可靶向Notch1 并調(diào)控其表達(dá)Fig. 2 miR-582-5p targets Notch 1 and regulates its expression

2.3 上調(diào)Notch1 可保護(hù)心肌細(xì)胞

使用CCK-8 檢測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-582-5p 的Inhibitor 和Mimics 后的HL-1 細(xì)胞活力，結(jié)果顯示與NC 組相比，轉(zhuǎn)染Inhibitor 后細(xì)胞活力明顯升高，此外轉(zhuǎn)染Mimics 后細(xì)胞活力有大幅的下降，見圖3A；同樣在HL-1 細(xì)胞OGD 模型后復(fù)氧轉(zhuǎn)染Inhibitor 和Mimics 檢測(cè)細(xì)胞活力，得到了與其一致的結(jié)果，見圖3B。這表明miR-582-5p 被抑制后，Notch1 表達(dá)上調(diào)后對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生了保護(hù)作用。

圖3 HL-1 細(xì)胞活力的檢測(cè)Fig. 3 Detection of HL-1 cell viability

3 討論

心肌缺血再灌注損傷具有非常復(fù)雜的病理生理機(jī)制，在心臟病上帶來的負(fù)擔(dān)由來已久，同樣影響深遠(yuǎn)[7]。目前，有許多研究發(fā)現(xiàn)在病理損傷、組織損傷或者生理刺激下都存在miRNA 的異常表達(dá)[8-9]，越來越多的報(bào)道證實(shí)miRNA 參與了這些疾病的發(fā)生發(fā)展[10]，當(dāng)然在心肌缺血再灌注損傷損傷中miRNA 也發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]。此外，諸多研究表明miR-582-5p 在腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]、新生兒缺血缺氧性腦病[14]和缺血性腦卒中[15]擔(dān)任著重要角色，但是miR-582-5p 在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究卻很少，這就需要去探究其在心肌缺血再灌注中發(fā)揮的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-582-5p 在小鼠心肌缺血再灌注損傷后，表達(dá)升高，并且在小鼠HL-1 細(xì)胞OGD 模型復(fù)氧后表達(dá)也異常升高。此外，在降低其在HL-1 細(xì)胞中的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，無論是正常HL-1 細(xì)胞還是HR 后的HL-1 細(xì)胞，細(xì)胞活力都明顯提高，這表明其對(duì)心肌缺血再灌注損傷有潛在的危害。

Notch1 是異二聚體跨膜受體Notch 家族中的一員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡和發(fā)育的功能[16-18]。目前，許多研究表明激活Notch1 可以減輕MIR 帶來的氧化應(yīng)激和自噬等[19-20]，從而改善心肌缺血再灌注損傷并且保護(hù)心肌細(xì)胞[20]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-582-5p 可以調(diào)控Notch1 的表達(dá)，在miR-582-5p 被抑制后，Notch1 的表達(dá)顯著升高，有趣的是HL-1 細(xì)胞的活力因此明顯提高，這表明Notch1 可以有效的保護(hù)心肌細(xì)胞從而來對(duì)抗缺血缺氧造成的損傷。

本研究初步證實(shí)了miR-582-5p 介導(dǎo)Notch1在心肌缺血再灌注損傷中對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明miR-582-5p 表達(dá)的抑制可以有效的提高心肌細(xì)胞的活力，這是通過調(diào)控Notch1 來實(shí)現(xiàn)的。本研究從microRNA 水平揭示了心肌缺血再灌注損傷的分子機(jī)制，找到了其可能調(diào)控的下游分子，提示了miR-582-5p 和Notch1 在治療心肌缺血再灌注損傷中的潛在價(jià)值。