何思, 孟瓊

廣東省第二人民醫(yī)院兒科(廣東廣州 510310)

盡管當(dāng)前的早產(chǎn)兒救治技術(shù)不斷提高，但早產(chǎn)兒的常見并發(fā)癥，如支氣管肺發(fā)育不良(bonchopulmonary dysplasia,BPD)、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis, NEC)、顱內(nèi)出血(intracranial hemorrhage)、敗血癥(sepsis)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)等疾病的發(fā)生率并沒有下降，反而因早產(chǎn)兒存活率的升高呈現(xiàn)出上升趨勢[1]。根據(jù)Bell等[2]的調(diào)查顯示：2013—2018年，19家美國學(xué)術(shù)醫(yī)療中心出生并接受治療的極早產(chǎn)兒中，78.3%的嬰兒存活到出院，明顯高于2008—2012年出生的嬰兒，但8.9%(890/9 956)的嬰兒有NEC，2.4%(238/9 957)有早發(fā)感染，19.9%(1 911/9 610)有晚發(fā)感染，14.3%(1 386/9 705)發(fā)生了嚴(yán)重的顱內(nèi)出血，12.8%(1 099/8 585)患有嚴(yán)重的ROP，重度BPD發(fā)生率高達(dá)8.0%(666/8 305)。中國的一項(xiàng)隊(duì)列研究亦發(fā)現(xiàn)：全國25個(gè)省的57個(gè)三級(jí)醫(yī)院新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房在2019年1月1日至12月31日期間出生的所有胎齡<32周的早產(chǎn)兒，BPD發(fā)生率高達(dá)29.2%(2 379/8 148)，嚴(yán)重腦室內(nèi)出血或腦室周圍白質(zhì)軟化發(fā)生率達(dá)到10.4%(745/7 189)，NEC發(fā)生率4.9%(403/8 171)，敗血癥發(fā)生率9.4%(764/8 171)，ROP發(fā)生率4.3%(296/6 851)[3]。多年來，盡管國內(nèi)外的學(xué)者及醫(yī)療團(tuán)隊(duì)積極探索研究早產(chǎn)兒相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防、治療方法，但至今仍無特異性的預(yù)防或治療方案可以有效減少這些并發(fā)癥的發(fā)生，探究疾病的發(fā)病機(jī)制，成為了近年來醫(yī)學(xué)研究員的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)。新近研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-8不僅可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡(apoptosis)、細(xì)胞壞死(necroptosis)的發(fā)生，還可以引發(fā)細(xì)胞焦亡(pyroptosis)，成為細(xì)胞焦亡研究中的新靶點(diǎn)[4-5]。

1 細(xì)胞焦亡概述

細(xì)胞焦亡是由Cookson和Brennan首次提出的一種不同于細(xì)胞凋亡的細(xì)胞程序性裂解死亡方式[6]。當(dāng)細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞腫脹、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放并募集更多的炎癥因子從而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體損傷。但與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞焦亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞核及線粒體的完整性沒有破壞[7]。根據(jù)發(fā)生機(jī)制和信號(hào)通路的不同，細(xì)胞焦亡可以分為經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑和非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。

1.1 經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑 經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑是機(jī)體一系列炎癥小體的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別檢測到入侵機(jī)體的病原微生物信號(hào)(PAMPs)或內(nèi)環(huán)境失調(diào)而釋放的細(xì)胞內(nèi)源性損傷相關(guān)分子(DAMPs)后活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1前體蛋白(ProCaspase-1)[8]，激活的Caspase-1促進(jìn)炎性因子生成、釋放，并能裂解GaserminD(GSDMD)從而誘導(dǎo)細(xì)胞膜孔隙開放，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)得以釋放至胞外并引發(fā)、擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[9-11]。炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)多聚蛋白復(fù)合物，由PRRs、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(associated speck-like protein containing CARD, ASC)和效應(yīng)蛋白Caspase-1組成。PRRs根據(jù)組分又可以分為NLR家族(如NLRP1、NLRP3等)和黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)等[12-15]。ASC作為銜接蛋白，具有Caspase募集激活結(jié)構(gòu)域(caspase recruitdomain, CARD)，可以與Pro-Caspase-1結(jié)合并將無活性的Pro-Caspase-1活化成具有活性的Caspase-1[16]。激活的Caspase-1不僅可以切割下游炎性細(xì)胞因子前體如白細(xì)胞介素-1β前體(ProIL-1β)、白細(xì)胞介素-18前體(ProIL-18)，將其轉(zhuǎn)化為生物活性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18[17]，還會(huì)誘導(dǎo)GSDMD的裂解使得細(xì)胞膜形成孔隙，使得炎性因子釋放至細(xì)胞外引起級(jí)聯(lián)式的炎癥風(fēng)暴[18-19]。

1.2 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑 非經(jīng)典細(xì)胞焦亡由人類的Caspase-4/5和小鼠的Caspase-11介導(dǎo)[20-23]。Caspase-4/5/11的CARD不僅可以直接識(shí)別細(xì)菌脂多糖(LPS)并誘導(dǎo)其寡聚化[24]，也可以直接切割GSDMD，從而誘導(dǎo)細(xì)胞膜孔隙的形成，釋放IL-1α，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。但Caspase-4/5/11所介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡對IL-1β和IL-18的活化生成無促進(jìn)作用[25]。

2 細(xì)胞焦亡基礎(chǔ)研究中的新進(jìn)展

研究證實(shí)細(xì)胞焦亡可以幫助機(jī)體消除病原體防止感染，但Caspase的過度活化和持續(xù)進(jìn)行的炎癥反應(yīng)又會(huì)引起機(jī)體的損傷[26-27]。過去的研究已經(jīng)證明細(xì)胞焦亡參與了早產(chǎn)兒相關(guān)的NEC[28]、ROP[29]、顱內(nèi)出血[30]及敗血癥[31-32]等疾病的發(fā)生發(fā)展，Caspase-1抑制劑的臨床實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)得到了開展[33-34]，但到目前為止，市場上依然沒有被批準(zhǔn)用于臨床治療的Caspase-1抑制劑藥物[35]。細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，而最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明：Caspase-8可介導(dǎo)一個(gè)獨(dú)立于 Caspase-1和Caspase-4/5/11的替代途徑而激活細(xì)胞焦亡[36]。這為研究細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制及信號(hào)通路提出一個(gè)新靶點(diǎn)——Caspase-8。

3 Caspase-8

3.1 Caspase家族分類 Caspase是一組結(jié)構(gòu)相似但效應(yīng)機(jī)制不同的的炎性蛋白酶[37]，以無活性的酶原形式(Procaspase)在體內(nèi)正常細(xì)胞中表達(dá)，只有在轉(zhuǎn)化成具有活性的狀態(tài)后才能發(fā)揮其效應(yīng)。根據(jù)參與的信號(hào)通路和發(fā)揮效應(yīng)機(jī)制，可以將Caspase家族分為以Caspase-3為代表的凋亡型半胱氨酸蛋白酶和以 Caspase-1/4/5為代表的焦亡型半胱氨酸蛋白酶兩大類。

過去的研究認(rèn)為只存在細(xì)胞凋亡一種程序性細(xì)胞自動(dòng)裂解死亡機(jī)制，但現(xiàn)在有越來越多的程序性細(xì)胞裂解死亡方式被人們熟知，包括細(xì)胞焦亡。近年來的研究證明，細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡緊密聯(lián)系，并非毫無交集，二者的機(jī)制通路中存在著許多的交叉點(diǎn)，Caspase-8就是最早發(fā)現(xiàn)的不同類型細(xì)胞死亡之間的橋梁之一[38]。

3.2 Caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡根據(jù)途徑不同可以分為：內(nèi)源性和外性細(xì)胞凋亡兩大途徑，但二者均需要Caspase家族成員的活化誘導(dǎo)。當(dāng)?shù)蛲鰡?dòng)蛋白催化半胱天冬酶酶原的活化級(jí)聯(lián)反應(yīng)后，凋亡效應(yīng)蛋白開始切割細(xì)胞底物從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[39]。

外源性細(xì)胞凋亡途徑的發(fā)生需要細(xì)胞表面的受體如Fas(CD95)或腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)與配體結(jié)合后形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)。復(fù)合體的結(jié)構(gòu)包括死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)和Caspase-8。適配器蛋白FADD由一個(gè)c末端死亡域(DD)和一個(gè)n末端死亡效應(yīng)域(DED)組成。通過同型DD的相互作用，F(xiàn)ADD被募集到死亡受體(DR)的胞內(nèi)死亡域[40]。與DR結(jié)合的 FADD 誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象改變，從而暴露DED結(jié)合 ProCaspase-8。ProCaspase-8的結(jié)構(gòu)包含一個(gè) n 端前結(jié)構(gòu)域(包括兩個(gè) DEDs)、一個(gè)大的含有催化位點(diǎn)的蛋白酶亞基(p20/p18)、一個(gè)短連接區(qū)和一個(gè)小亞基(p12/p10)。當(dāng)ProCaspase-8與FADD的DED相結(jié)合后，將會(huì)寡聚化及轉(zhuǎn)化成具有活性的Caspase-8，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡并切割裂解效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase-7，從而激活細(xì)胞凋亡[41]。

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)毒素或DNA損傷引起的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)而觸發(fā)。B細(xì)胞淋巴瘤-2(BCL-2)家族蛋白的寡聚化激活內(nèi)在信號(hào)通路，形成細(xì)胞膜孔隙細(xì)胞，細(xì)胞色素c得以釋放至細(xì)胞質(zhì)中，觸發(fā)凋亡小體的形成和 Caspase-3激活從而發(fā)生細(xì)胞凋亡[42]。

3.3 Caspase-8介導(dǎo)細(xì)胞焦亡 過去的研究一直認(rèn)為Caspase-8是一類凋亡型蛋白酶，不參與細(xì)胞焦亡的發(fā)生[43]。但最新的研究顯示，Caspase-8不僅可以誘導(dǎo)炎癥小體的聚集，激活炎癥因子介導(dǎo)細(xì)胞焦亡[44-45]，還可以抑制機(jī)體的先天免疫[4]。在正常狀態(tài)下，轉(zhuǎn)化生長因子激酶(TAK1)限制NLRP3炎癥小體和受體相互作用蛋白1(RIPK1)的磷酸化[46-47]。而另有學(xué)者實(shí)驗(yàn)證明，耶爾森菌效應(yīng)分子毒力蛋白YopJ與TAK1結(jié)合可以消除對RIPK1的抑制作用[48]，而激活的RIPK1將招募 FADD 和 ProCaspase8形成一個(gè)結(jié)構(gòu)稱為 RIPoptosome的復(fù)合物，通過自動(dòng)處理加工激活 Caspase-8，被激活的Caspase-8通過切斷GSDMD誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[49]。Caspase-8可以通過激活 Caspase-1引發(fā)炎性小體組裝，間接產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的 IL-1β[50]。Caspase-8被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡的分子開關(guān)。Schneider等[36]利用缺乏Caspase-1蛋白酶活性的基因小鼠(C284A)證明：Caspase-8在炎癥小體中的激活受到GSDMD而非Caspase-1的抑制，但在Caspase-1酶活性失活的情況下，炎癥小體可以更有效地激活 Caspase-8，觸發(fā)與GSDMD無關(guān)的繼發(fā)性細(xì)胞焦亡通路，作為釋放成熟IL-1β的替代途徑。

NLRP3作為一種識(shí)別受體，能夠感知微生物入侵和內(nèi)源性細(xì)胞損傷等危險(xiǎn)信號(hào)，激活后與ASC形成炎癥小體，導(dǎo)致Caspase-1的活化，釋放促炎癥細(xì)胞因子[51]。Stutz等[52]的實(shí)驗(yàn)卻表明Caspase-8可以通過負(fù)性調(diào)節(jié)NLRP3的激活而減輕細(xì)胞焦亡的程度。Hayley的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)使用LPS刺激缺乏細(xì)胞flick樣抑制蛋白(cflipl)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMDMs)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Caspase-8活性明顯增強(qiáng)，并指出LPS引起的細(xì)胞死亡需要Caspase-8和GSDMD參與，而不是NLRP3、Caspase-1或Caspase-11的介導(dǎo)[53]。Demarco等[54]的研究進(jìn)一步說明，GSDMD的裂解活化并不需要依賴于Caspase-1活化而通過Caspase-8介導(dǎo)，使機(jī)體對TNF-α的誘導(dǎo)作出應(yīng)答，而且Caspase-8激活的GSDMD能夠幫助宿主防御耶爾森菌的感染，最后還指出，GSDMD的裂解和細(xì)胞焦亡需要Caspase-8的二聚化和自動(dòng)加工，無催化活性的Caspase-8無法引起GSDMD的裂解和細(xì)胞膜破裂。

4 Caspase-8在細(xì)胞焦亡研究中的展望

適度的細(xì)胞焦亡可以幫助機(jī)體及時(shí)清除感染細(xì)胞，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[55]，但過度的細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[26]，引起細(xì)胞死亡和嚴(yán)重的組織和器官衰竭[56]。雖然已有研究證實(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞暴露于 TAK1抑制劑后，Caspase-8 通過腫瘤壞死因子復(fù)合物IIb(TNF Complex, IIb)可直接切斷GSDMD引發(fā)細(xì)胞焦亡，為宿主抵御耶爾森菌感染提供保護(hù)，減少細(xì)胞焦亡的程度，從而減輕肺部的炎癥反應(yīng)[54, 57]。但是，不同疾病狀態(tài)下，不同的信號(hào)因子是如何激活Caspase-8，活化的Caspase-8又是如何介導(dǎo)疾病的發(fā)生、發(fā)展，這些具體的信號(hào)通路及其相關(guān)的調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白均有待我們進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，靶向研究Caspase-8及其信號(hào)傳遞機(jī)制、通路效應(yīng)蛋白將有助于我們進(jìn)一步研究細(xì)胞焦亡的信號(hào)通路和致病機(jī)制。

利益相關(guān)聲明：本文作者和單位未曾接受第三方資金或服務(wù)支持，無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：本文由何思作者進(jìn)行文獻(xiàn)檢索及撰寫成文，孟瓊進(jìn)行修改審核。