楊玉潔，劉 煥，王淑惠，柳春紅，陳樹喜，周愛梅,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣東展翠食品股份有限公司，廣東 潮州 515634）

糖尿病是一種以高血糖濃度為特征的代謝性疾病，會伴隨許多并發(fā)癥，包括中風(fēng)、神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變和腎病等[1]，嚴(yán)重危害人體健康。截至2021年，我國20～79 歲糖尿病患病人數(shù)約1.4 億，位居世界第一[2]。臨床一般采用注射胰島素和口服降糖藥進行治療。為了避免藥物帶來的不良反應(yīng)，一些具有降血糖作用的天然活性物質(zhì)成為了研究熱點。其中多糖的降血糖作用得到廣泛的研究，如靈芝多糖[3-4]、麥冬多糖[5]和黃芪多糖[6]等都表現(xiàn)出良好的降血糖效果。

常用于體外評價多糖降血糖活性的方法包括酶活力抑制實驗和細(xì)胞實驗。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是控制餐后血糖濃度的重要靶點，Bu Tong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖可以有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，半抑制質(zhì)量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）為38 μmol/L，體內(nèi)實驗也證實海帶多糖可以降低糖尿病小鼠的血糖濃度；Hasan等[8]研究證明，石巖楓多糖具有α-淀粉酶抑制活性（IC50＝2.038 mg/mL），并且能有效降低大鼠血糖濃度。同時，有證據(jù)顯示血糖濃度與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活力有關(guān)，Aluko等[9]研究表明ACE抑制劑可降低大鼠血糖濃度。這是由于糖尿病是一種復(fù)雜的代謝疾病，高血壓與其之間存在共同的病理途徑。所以多糖抑制ACE活性的研究也逐漸增多，ACE活性也成為研究胰島素抵抗的指標(biāo)之一。例如，Gara等[10]在探究囊鏈藻硫酸多糖對糖尿病大鼠降血糖作用前，在體外進行了α-淀粉酶和ACE的活性抑制實驗，其IC50分別為39.16、58.35 μg/mL。

3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成熟的脂肪細(xì)胞，常用于脂肪細(xì)胞功能及糖脂代謝研究。脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達(dá)降低會產(chǎn)生胰島素抵抗[11]。而GLUT4是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）通路的重要蛋白之一。多糖可以通過PI3K/AKT通路來緩解胰島素抵抗[12]，如Ke Bin等[13]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖促進3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，增加胰島素敏感性，可能涉及PI3K/AKT信號通路。

佛手（Citrus medica‘Fingered’）為蕓香科柑橘屬果實，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和提高免疫力等多種生物活性。佛手多糖是佛手中主要活性組分之一，具有抗氧化[14-16]、免疫[17]、抗衰老[18]和抗腫瘤[19]等生物活性，但目前鮮見佛手多糖降血糖活性的研究，其作用機制也尚不明確。佛手按產(chǎn)地分為金佛手（產(chǎn)自浙江）、川佛手（產(chǎn)自四川）、建佛手（產(chǎn)自福建）和廣佛手（產(chǎn)自廣東）4種。課題組在前期研究[20]中已經(jīng)建立了廣佛手多糖分離純化方法并制得4種廣佛手多糖組分（FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1），其中以FCP-2-1純度最高，對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明FCP-2-1的重均相對分子質(zhì)量為1.503×104，半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖的物質(zhì)的量比為0.685∶0.032∶0.283，推測其化學(xué)結(jié)構(gòu)為→[5)-α-L-Araf-(1]5→[4)-α-D-GalAp-(1]7→。

基于此，本研究通過測定廣佛手多糖各分離純化組分對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和ACE的抑制效果，并利用3T3-L1脂肪細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型，測定細(xì)胞糖代謝、脂代謝、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α分泌量，初步評價和篩選出降血糖活性較高組分FCP-2-1，分析FCP-2-1對PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響，以期為廣佛手精深加工及其在健康食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣佛手由廣東展翠食品股份有限公司提供；3T3-L1前脂肪細(xì)胞由美國模式培養(yǎng)物保藏所（american type culture collection，ATCC）提供。

廣佛手多糖組分FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1由實驗室自制[20]。

α-葡萄糖苷酶（比活力50 U/mg） 美國Sigma公司；α-淀粉酶（豬胰腺，比活力10 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、N-馬脲酰組氨酰亮氨酸（N-hippuryl-histidylleucine，HHL）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H-xanthine，IBMX）上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素、0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰蛋白酶、胎牛血清、pH 7.4 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國Gibco公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）、RIPA裂解液、TBST（Tris-HCl+Tween）緩沖液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)定量試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）試劑武漢賽維爾生物科技有限公司；PI3K、AKT、磷酸化-AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、GLUT4和β-actin抗體英國Abcam公司；油紅O染色試劑盒 北京雷根生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、TNF-α測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；氯化鈉、可溶性淀粉、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZA120R4 萬分之一分析天平 上海贊維衡器有限公司；FD-1型冷凍干燥機 海門其林貝爾儀器制造有限公司；ECLIPSE Ti系列倒置顯微鏡 日本尼康株式會社；5415R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SMA4000微量紫外分光光度計 美林恒通（北京）儀器有限公司；2300多功能酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司；KZ-II型研磨儀 武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外相關(guān)酶活力抑制能力測定

1.3.1.1α-葡萄糖苷酶活力抑制能力測定

參考Deng Yejun等[21]的方法并稍作修改。取廣佛手多糖FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1和阿卡波糖（陽性對照）分別用PBS配制成不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的多糖溶液；采用PBS分別配制7.5 mmol/L PNPG溶液與0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液。采用96 孔板反應(yīng)體系，分別取50 μL多糖溶液加入孔板中，每孔加入100 μLα-葡萄糖苷酶溶液，于37 ℃下溫孵10 min后加入50 μL PNPG溶液，37 ℃反應(yīng)25 min后，測定405 nm波長處吸光度A1。以等體積PBS取代多糖溶液，測定吸光度A0；以等體積PBS取代α-葡萄糖苷酶溶液，測定吸光度A2。按式（1）計算α-葡萄糖苷酶活力抑制率，采用SPSS Statistics 21軟件擬合計算IC50。

1.3.1.2α-淀粉酶活力抑制能力測定

采用Deng Yejun等[21]的方法并略作修改。采用PBS分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%可溶性淀粉溶液與2 U/mLα-淀粉酶溶液。參考趙凱等[22]的方法配制DNS試劑。向各試管中分別加入300 μL 1.3.1.1節(jié)不同質(zhì)量濃度的多糖溶液及400 μLα-淀粉酶溶液，混合均勻后于37 ℃下溫孵10 min，隨后分別加入300 μL可溶性淀粉溶液并在37 ℃反應(yīng)15 min。最后分別加入2 mL DNS試劑顯色，并立即煮沸10 min以終止反應(yīng)；冷卻后將混合體系用PBS定容至10 mL，測定其540 nm波長處吸光度A1。以等體積PBS取代多糖溶液，測定其540 nm波長處吸光度A0；以等體積PBS取代α-淀粉酶溶液，測定其540 nm波長處吸光度A2。按式（2）計算α-淀粉酶活力抑制率，采用SPSS Statistics 21軟件擬合計算IC50。

1.3.1.3 ACE活力抑制能力測定

參考Liu Jingbo等[23]的方法并略作修改。以PBS為溶劑分別配制不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL）的廣佛手多糖溶液和卡托普利溶液（陽性對照）；采用pH 8.3、0.1 mol/L磷酸-硼砂緩沖液分別配制0.1 U/mL ACE溶液與2.5 mmol/L HHL溶液。取10 μL ACE溶液分別與40 μL不同質(zhì)量濃度的廣佛手多糖溶液、卡托普利溶液混合，并在37 ℃孵育5 min，然后加入150 μL HHL溶液啟動反應(yīng)，37 ℃孵育30 min，最后加入200 μL 1.0 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液經(jīng)0.25 μm水系針式過濾器過濾后采用LC-10ATVP plus高效液相色譜儀進行分析。高效液相色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（200 mm×4.6 mm）；流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%冰乙酸水溶液，流動相B為色譜純乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min，10%～15%流動相B；5～15 min，15%～25%流動相B；檢測波長228 nm，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。以等體積蒸餾水取代多糖溶液作為空白組，以馬尿酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法計算各組溶液中馬尿酸質(zhì)量濃度。按式（3）計算ACE活力抑制率，采用SPSS Statistics 21軟件擬合計算IC50。

式中：ρ1為空白組中馬尿酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ2為廣佛手多糖組或陽性對照組中馬尿酸質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2 體外細(xì)胞實驗

1.3.2.1 3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及胰島素抵抗細(xì)胞模型建立

參考Shen Shengnan等[24]的方法并略作修改。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在5% CO2、37 ℃、飽和濕度環(huán)境下用高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)至單層貼壁并接觸抑制狀態(tài)（細(xì)胞融合度≥90%）。胰酶消化液消化細(xì)胞后接種至6 孔培養(yǎng)板（5×105個/孔）中，并繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞完全融合，進行誘導(dǎo)分化。待分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞用誘導(dǎo)液A（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、10 μg/mL胰島素、0.5 μmol/L IBMX、1 μmol/L羅格列酮、1 μmol/L地塞米松的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)2～3 d后，換用誘導(dǎo)液B（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、10 μg/mL胰島素的DMEM高糖培養(yǎng)基）培養(yǎng)2～3 d，最后換高糖完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至10 d，當(dāng)95%以上的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴（約9～10 d）即得到3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞?？瞻讓φ战M為正常3T3-L1前脂肪細(xì)胞。使用含100 nmol/L胰島素的高糖完全培養(yǎng)基分別刺激兩組細(xì)胞30 min，采用葡萄糖試劑盒測定兩組細(xì)胞刺激前后培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度，驗證胰島素抵抗模型是否建立成功。

1.3.2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞的顯微鏡觀察和油紅O染色鑒定

取1.3.2.1節(jié)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞和3T3-L1前脂肪細(xì)胞用PBS清洗2 次后在顯微鏡下觀察并拍照；采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞20 min后用PBS清洗2 次；按照油紅O染色試劑盒說明書配制染色液，避光靜置10 min；取1 mL油紅O染色液覆蓋培養(yǎng)板，室溫下染色10 min；棄去油紅O工作液，用PBS清洗1～2 次，如有殘余的油紅O染色液，用體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇溶液清洗，隨后立即置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞存活率的測定

將1.3.2.1節(jié)3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞接種于96 孔板（1×104個/孔），用含不同終質(zhì)量濃度（0（空白）、0.2、2、20、200、2 000 μg/mL）FCP-2-1的高糖完全培養(yǎng)基分別處理24、48 h和72 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL噻唑藍(lán)溶液，避光孵育培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。每組設(shè)6個平行。采用酶標(biāo)儀測定492 nm波長處光密度值（OD492nm），按式（4）計算細(xì)胞存活率。

1.3.2.4 細(xì)胞耗糖量、脂代謝相關(guān)指標(biāo)和TNF-α質(zhì)量濃度的測定

將接種于24 孔板上的胰島素抵抗3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞（1×105個/孔）用含不同終質(zhì)量濃度（10、50、150 μg/mL）廣佛手多糖的高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；陰性對照組加入高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，胰島素組加入含100 nmol/L胰島素的高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；二甲雙胍（陽性對照）組加入含40 μg/mL二甲雙胍的高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，900 r/min離心5 min取上清液備用。

分別按照相應(yīng)試劑盒說明書測定陰性對照組、廣佛手多糖組和胰島素組的葡萄糖質(zhì)量濃度；測定陰性對照組、廣佛手多糖組和二甲雙胍組的TG、TC、LDL-C、HDL-C、TNF-α水平。

1.3.2.5 免疫印跡分析

取1.3.2.4節(jié)陰性對照組、不同終質(zhì)量濃度（10、50、150 μg/mL）FCP-2-1組和二甲雙胍組細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液后用PBS清洗細(xì)胞，然后每孔加入100 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度。每孔裝載60 μg總蛋白，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，在4 ℃下與一抗孵育18 h。用TBST緩沖液洗凈后與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育30 min，再次用TBST緩沖液洗凈。避光條件下配制ECL工作液，使PVDF膜與其充分反應(yīng)1 min，棄去ECL工作液后加入顯影、定影試劑進行顯影和定影，然后使用曝光儀曝光顯色并拍照。采用AlphaView軟件分析目標(biāo)蛋白條帶灰度。蛋白相對表達(dá)水平以相應(yīng)蛋白灰度與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度的比值表示，以p-AKT與AKT相對表達(dá)水平的比值表示AKT磷酸化水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗設(shè)置3個平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 21軟件進行數(shù)據(jù)處理和單因素方差分析，采用Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣佛手多糖對相關(guān)酶活力的體外抑制能力

2.1.1 廣佛手多糖對α-葡萄糖苷酶活力抑制能力

如圖1所示，各組分廣佛手多糖的α-葡萄糖苷酶活力抑制率隨質(zhì)量濃度的升高而增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。4.00 mg/mL FCP-2-1對α-葡萄糖苷酶活力抑制能力最強，抑制率為65.66%，是相同質(zhì)量濃度阿卡波糖抑制率的75.04%。FCP-2-1對α-葡萄糖苷酶活力的IC50為2.74 mg/mL。FCP-2抑制能力其次，最高抑制率為49.76%，IC50為7.25 mg/mL。FCP-1和FCP抑制能力最差，最高抑制率分別為28.71%和15.18%，IC50分別為16.71、17.01 mg/mL。通過比較IC50可知，F(xiàn)CP-2-1對α-葡萄糖苷酶活力的抑制能力達(dá)到FCP的6.23 倍，F(xiàn)CP-2對α-葡萄糖苷酶活力的抑制能力達(dá)到FCP-1的3.96 倍。α-葡萄糖苷酶在人體消化系統(tǒng)中起到重要作用，也是臨床控制血糖的重要靶點[25]。多糖對α-葡萄糖苷酶活力的抑制作用被廣泛研究，其抑制作用與多糖支鏈基團、蛋白質(zhì)含量、葡萄糖含量和三螺旋構(gòu)象有關(guān)[26-27]。本研究結(jié)果與Jia Yanan等[28]的結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)，玉米須多糖（CSP20）含有58.7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）中性糖、27.9%糖醛酸、6.36%蛋白質(zhì)，對α-葡萄糖苷酶活力的IC50為7.75 mg/mL，高于本研究廣佛手多糖FCP-2-1和FCP-2。

圖1 廣佛手多糖對α-葡萄糖苷酶活力的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on α-glucosidase activity

2.1.2 廣佛手多糖對α-淀粉酶活力抑制能力

如圖2所示，各組分廣佛手多糖的α-淀粉酶活力抑制率隨質(zhì)量濃度的升高而增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時，各組抑制率達(dá)到最高，F(xiàn)CP-1和FCP抑制率較低，分別為42.44%和37.91%，IC50分別為6.60、11.77 mg/mL；FCP-2抑制能力較強，最高抑制率為49.15%，IC50為1.37 mg/mL；FCP-2-1抑制α-淀粉酶活力的能力最強，抑制率為74.20%，IC50為0.87 mg/mL，其抑制率是陽性對照阿卡波糖的74.95%。由IC50可知，F(xiàn)CP-2-1對α-淀粉酶活力的抑制能力達(dá)到FCP的13.53 倍，F(xiàn)CP-2對α-淀粉酶活力的抑制能力達(dá)到FCP-1的4.82 倍。與α-葡萄糖苷酶類似，α-淀粉酶的活力也可影響餐后血糖濃度，因為二者都是消化吸收的關(guān)鍵酶，可水解食物中的糖類物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖。Zeng Aoqiong等[29]研究發(fā)現(xiàn)，紅海藻紫菜多糖在體外對α-淀粉酶具有較好的抑制作用，其IC50為12.72 mg/mL。該研究進一步證明，紅海藻紫菜多糖可在體內(nèi)抑制正常和糖尿病大鼠餐后血糖的升高。由此推測FCP-2-1組分具有較好的體內(nèi)降血糖效果。

圖2 廣佛手多糖對α-淀粉酶活力的抑制效果Fig. 2 Inhibitory effects of polysaccharides from finger citron from Guangdong province on α-amylase activity

2.1.3 廣佛手多糖對ACE活力抑制能力

如圖3所示，各組分廣佛手多糖的ACE抑制率也呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。4.00 mg/mL FCP-2-1、FCP-2、FCP-1、FCP溶液的ACE抑制率依次為88.02%、86.86%、66.71%、85.24%，其IC50依次為0.85、1.03、1.89、1.09 mg/mL。比較IC50可知，F(xiàn)CP-2-1對ACE的抑制能力是FCP-1的2.22 倍；FCP-2對ACE的抑制能力是FCP-1的1.83 倍。ACE活力抑制實驗常用于評價物質(zhì)的降血壓活性，同時，ACE活力也與II型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展密切相關(guān)[30]，對于ACE抑制劑類藥物的運用有助于降低心腦血管及腎臟疾病患者II型糖尿病的發(fā)病率[31]。因此，多糖抑制ACE活力也被廣泛研究，如Gara等[10]的研究表明，硫酸酯化的囊鏈藻多糖對ACE的IC50為58.35 μg/mL，并且使糖尿病大鼠的血糖濃度下降56%。

圖3 廣佛手多糖對ACE活力的抑制效果Fig. 3 Inhibitory effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on ACE activity

2.2 3T3-L1胰島素抵抗模型建立

3T3-L1脂肪細(xì)胞屬于小鼠胚胎原纖維細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)可分化為成熟脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞是發(fā)生胰島素抵抗的主要場所[32-33]，所以此細(xì)胞廣泛用于肥胖、代謝異常等生理活性研究。正常形態(tài)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈梭狀（圖4A），經(jīng)過誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積變大，邊緣圓潤，呈典型的戒環(huán)狀，油紅O染色觀察結(jié)果中脂滴呈橙紅色（圖4B）。經(jīng)100 nmol/L胰島素刺激后，成熟脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度極顯著高于空白對照正常3T3-L1前脂肪細(xì)胞（P＜0.01），和胰島素刺激前的正常3T3-L1前脂肪細(xì)胞沒有顯著差異（P＞0.05）（圖4C），說明細(xì)胞對胰島素刺激產(chǎn)生抵抗，不能及時將葡萄糖轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)。由此可知，胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型建立成功。

圖4 油紅O染色結(jié)果及胰島素抵抗建模結(jié)果Fig. 4 Results of oil red O staining and insulin resistance modeling

2.3 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞存活率的影響

如圖5所示，與空白組相比，在作用時間24 h、廣佛手多糖作用質(zhì)量濃度為0.2～2 000 μg/mL時，3T3-L1脂肪細(xì)胞的存活率最大增加了10.92%。FCP-1、FCP-2和FCP-2-1在高質(zhì)量濃度時對細(xì)胞的生長表現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)作用時間24 h、質(zhì)量濃度2 000 μg/mL時，F(xiàn)CP-1、FCP-2和FCP-2-1組細(xì)胞存活率分別為68.25%、92.60%、71.57%。并且這種抑制作用隨著作用時間的延長而加強，當(dāng)作用時間72 h、質(zhì)量濃度2 000 μg/mL時，F(xiàn)CP-2和FCP-2-1組的細(xì)胞存活率分別僅為46.91%和50.91%。因此，4種廣佛手多糖的作用時間應(yīng)不超過48 h、質(zhì)量濃度為0.2～200 μg/mL。

圖5 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞存活率的影響Fig. 5 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on the proliferative viability of 3T3-L1 adipocytes

2.4 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞糖代謝的影響

如圖6所示，胰島素抵抗細(xì)胞經(jīng)胰島素刺激后，細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度極顯著下降（P＜0.01）。經(jīng)不同質(zhì)量濃度廣佛多糖組分處理后，與陰性對照組相比，各組葡萄糖質(zhì)量濃度均極顯著降低（P＜0.01），最高下降了45.06%。其中，不同質(zhì)量濃度的FCP-2-1干預(yù)后，細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度較胰島素組均極顯著下降（P＜0.01），最高下降了31.90%，同時與其他相同質(zhì)量濃度的廣佛手多糖組分相比也具有顯著差異（P＜0.05），說明FCP-2-1促進細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的效率最高。

圖6 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞糖代謝的影響Fig. 6 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on glucose metabolism in 3T3-L1 adipocytes

2.5 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞TNF-α分泌量的影響

如圖7所示，各質(zhì)量濃度的FCP-2-1和二甲雙胍均可以顯著降低胰島素抵抗細(xì)胞上清的TNF-α質(zhì)量濃度（P＜0.01）。其中，F(xiàn)CP-2-1能有效抑制TNF-α分泌，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。150 μg/mL FCP-2-1處理后TNF-α質(zhì)量濃度相比陰性對照組下降了67.09%，相比二甲雙胍組下降了50.06%。50、150 μg/mL的FCP-2和150 μg/mL的FCP-1也能顯著抑制TNF-α的分泌（P＜0.05），與陰性對照組相比分別下降了38.53%、48.53%和40.88%。糖尿病的發(fā)生常伴隨著氧化應(yīng)激、細(xì)胞炎癥等不良反應(yīng)，Litvinova等[34]通過分析臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TNF-α等炎癥因子的水平和患者體質(zhì)量、血糖和膽固醇的增加有關(guān)。因此，廣佛手多糖抑制TNF-α分泌可能有助于緩解或減慢糖尿病病情的進程。

圖7 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌TNF-α的影響Fig. 7 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on TNF-α secretion from 3T3-L1 adipocytes

2.6 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂代謝的影響

如圖8所示，不同質(zhì)量濃度廣佛手多糖各組分均能極顯著降低3T3-L1脂肪細(xì)胞TG、LDL-C濃度（P＜0.01），極顯著提高HDL-C濃度（P＜0.01）。相比陰性對照組，F(xiàn)CP-2-1降低了細(xì)胞TC、TG和LDL-C分泌量，分別最高可降低35.68%、65.37%和46.42%，HDL-C分泌量最高可提高444%。與二甲雙胍組相比，不同質(zhì)量濃度FCP-2-1抑制TG分泌的效果更好，在作用質(zhì)量濃度為150 μg/mL時，F(xiàn)CP-2-1組TG濃度為陰性對照組的32.68%。其中FCP和FCP-2-1處理組隨質(zhì)量濃度的增加，TC濃度呈下降趨勢?，F(xiàn)有研究表明，脂代謝異常會加速脂質(zhì)沉積異常和胰島素抵抗的發(fā)展，國內(nèi)外臨床數(shù)據(jù)已證明脂代謝相關(guān)指標(biāo)與胰島素抵抗具有相關(guān)性[35-36]。在多糖領(lǐng)域，Li Jiping等[37]和Qu Jian等[38]的研究表明，板藍(lán)根多糖和鐵皮石斛多糖可改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗，并且兩種多糖降低了糖尿病小鼠和大鼠的血糖濃度，可能與其改善脂質(zhì)代謝有關(guān)。

圖8 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂代謝的影響Fig. 8 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on lipid metabolism in 3T3-L1 adipocytes

2.7 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞PI3K/AKT相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

PI3K/AKT通路在組織和細(xì)胞中起到轉(zhuǎn)運葡萄糖的重要作用。其中PI3K、AKT、GLUT4蛋白的表達(dá)會影響細(xì)胞或組織對葡萄糖的利用率。有研究報道，此通路被抑制與II型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，例如Jia等[39]研究發(fā)現(xiàn)，患有II型糖尿病的大鼠其PI3K/AKT通路異常，損害了胰島素信號傳導(dǎo)。

綜合體外酶活力和細(xì)胞實驗結(jié)果，選擇FCP-2-1探究其對3T3-L1脂肪細(xì)胞PI3K/AKT相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖9所示。相比于陰性對照組，二甲雙胍和不同質(zhì)量濃度FCP-2-1均能使3T3-L1脂肪細(xì)胞中PI3K、GLUT4、AKT和p-AKT蛋白相對表達(dá)水平極顯著增高（P＜0.01），其中FCP-2-1質(zhì)量濃度與AKT磷酸化水平呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。50 μg/mL FCP-2-1促進PI3K蛋白表達(dá)的效果極顯著優(yōu)于二甲雙胍（P＜0.01），相比提高了157.14%。50 μg/mL FCP-2-1促進GLUT4和p-AKT表達(dá)的效果也顯著優(yōu)于二甲雙胍（P＜0.05），促進率分別提高了38.46%和26.67%。類似的結(jié)果在Xu Hui等[40]的研究中也有體現(xiàn)，其發(fā)現(xiàn)海參中的褐藻多糖可增強3T3-L1脂肪細(xì)胞中PI3K的磷酸化，促進GLUT4易位，在體內(nèi)實驗中褐藻多糖可降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，提高口服葡萄糖耐受能力。

圖9 廣佛手多糖對3T3-L1脂肪細(xì)胞PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響Fig. 9 Effects of polysaccharides of finger citron from Guangdong province on protein expression in the PI3K/AKT signaling pathway in 3T3-L1 adipocytes

3 結(jié) 論

廣佛手多糖通過分離純化得到FCP、FCP-1、FCP-2和FCP-2-1 4個不同純化程度的組分，通過體外酶活力模型篩選出降血糖活性最優(yōu)的組分為FCP-2-1，其次為FCP-2，兩者可有效抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和ACE的活力。通過體外建立胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FCP-2-1可改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的糖、脂代謝和TNF-α分泌量，緩解細(xì)胞胰島素抵抗，同時可提高細(xì)胞PI3K/AKT通路中PI3K、GLUT4、AKT和p-AKT蛋白的表達(dá)。綜上所述，F(xiàn)CP-2-1可通過抑制相關(guān)酶活力和改善糖、脂代謝發(fā)揮其降血糖活性，其機制可能是FCP-2-1激活了葡萄糖轉(zhuǎn)運重要通路PI3K/AKT中相關(guān)蛋白的表達(dá)。