龐 婕，胥小榮，孔慶巖，劉 杰

（承德市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北承德 067000）

承德處在燕山山脈，盛產(chǎn)杏仁，承德杏仁顆粒飽滿，肉厚而細(xì)，以此杏仁為原料，加入水、白糖等以特有工藝制作承德杏仁露，不僅香味獨(dú)特，功效也較多。杏仁里含有黃酮及多酚類物質(zhì)，該物質(zhì)能夠降低人體內(nèi)膽固醇的含量[1]，因此杏仁露深受中老年人的喜愛(ài)。杏仁露中蛋白質(zhì)、多種維生素及微量元素等含量比較高，具有一定的保健功能[2]。隨著人們生活水平的提高，杏仁露也受到越來(lái)越多人的喜愛(ài)和關(guān)注，然而部分不法商販為了牟取暴利在食品中摻雜摻假，因此建立準(zhǔn)確、有效的杏仁源性成分的定量檢測(cè)方法意義重大。

目前，PCR 定量方法是根據(jù)樣品最終擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，通常用凝膠電泳法進(jìn)行分離，并用熒光染色來(lái)檢測(cè)。但在PCR 反應(yīng)中，由于反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等因素會(huì)影響PCR 反應(yīng)效率，甚至出現(xiàn)一些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，用終點(diǎn)法來(lái)衡量源性成分含量不夠精確。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累對(duì)整個(gè)PCR 進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，在PCR 反應(yīng)過(guò)程中，隨著循環(huán)數(shù)的增加，PCR 產(chǎn)物量增加[3]。相應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度也跟著增強(qiáng)，同時(shí)不斷地收集熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)可以得到一條以循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold，Ct）為橫坐標(biāo)和熒光強(qiáng)度（△Rn）變化為縱坐標(biāo)的“S”形熒光擴(kuò)增曲線[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

純杏仁，購(gòu)自承德市寬廣超市；10 個(gè)不同品牌的杏仁露，分別購(gòu)自承德市八縣三區(qū)，每個(gè)品牌購(gòu)買一個(gè)批次。

1.1.2 試劑

植物基因組DNA 提取試劑盒，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；杏仁原性成分核酸檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎ?，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀-CFX96，美國(guó)伯樂(lè)；離心機(jī)- FC5714，德國(guó)OHAUS；渦旋混勻儀-HY-2，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；榮冠（HH）數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；Eppendorf（D30）核酸蛋白測(cè)定儀，艾本德。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將杏仁置于干燥箱中80 ℃，4 h 烘干后，用液氮或研磨儀勻漿后制成細(xì)小的粉末狀。加水制成杏仁溶液。進(jìn)行稀釋，得到10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1、60 mg·L-1、70 mg·L-1、80 mg·L-1、90 mg·L-1及100 mg·L-1的溶液。此樣品用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品；杏仁露進(jìn)行均質(zhì)后分裝于玻璃容器內(nèi)。

1.3.2 DNA 提取

①轉(zhuǎn)移100 μL 樣品至2.0 mL 離心管中，加入1 200 μL Buffer ATL 和5 μL RNase A，渦旋使樣品充分分散。65 ℃處理10 min，期間渦旋混勻1 次。②加入420 μL Buffer PS 至樣品中，渦旋20 s 混勻。冰上放置10 min。10 000 r·min-1離心5 min。③小心轉(zhuǎn)移600 μL 上清液至新的離心管中，加入900 μL Buffer PBD（已加乙醇）至樣品中，渦旋混勻20 s。④把DNA 結(jié)合柱裝于2 mL 收集管中。轉(zhuǎn)移混合液至柱子中，10 000 r·min-1離心30～60 s。⑤倒棄濾液把柱子裝回收集管，將剩余液體轉(zhuǎn)移至柱子中，10 000 r·min-1離心30～60 s。⑥倒棄濾液把柱子裝回收集管。加入600 μL Buffer GW2（已用乙醇稀釋）至柱子中，10 000 r·min-1離心60 s。⑦倒棄濾液把柱子裝回收集管。10 000 r·min-1離心2 min 去除柱子中殘留的乙醇。⑧將柱子轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中。加入30～50 μL 預(yù)熱到65 ℃的Buffer AE 至柱子的膜中央，65 ℃靜置2 min。10 000 r·min-1離心2 min。⑨重復(fù)步驟8 的洗脫操作。丟棄DNA 結(jié)合柱，DNA 保存于-20 ℃或-80 ℃[5]。

1.3.3 特異性引物和探針

參照國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布的“食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法”，杏仁源和真核生物18sRNA 內(nèi)參照檢測(cè)用引物和探針如表1所示[6]。

表1 引物和探針序列

1.3.4 反應(yīng)程序

將購(gòu)買的商品化試劑盒放置在室溫待解凍后，1 000 r·min-1離心30 s 后揭開(kāi)封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入4 μL 模板，順序?yàn)榭瞻?、陰性?duì)照、待測(cè)樣品模板、陽(yáng)性對(duì)照。蓋好配套的PCR 管蓋后，渦旋混勻30 s，離心1 min，立即進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為①去污染：37 ℃，10 min，一個(gè)循環(huán)。②預(yù)變性：95 ℃，5 min，一個(gè)循環(huán)。③擴(kuò)增：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s。40個(gè)循環(huán)。在60 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇NONE。擴(kuò)增曲線如圖1所示。

圖1 擴(kuò)增曲線圖

1.4 Ct 值與DNA 濃度的關(guān)系

利用已知質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct 值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的DNA 濃度。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，選擇10 個(gè)稀釋度為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增，制作Ct 值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 杏仁質(zhì)量濃度與DNA 濃度的關(guān)系

對(duì)10 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行DNA 提取，之后用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)所提取的DNA 進(jìn)行測(cè)定，記錄每個(gè)稀釋度測(cè)定的DNA 濃度。每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.6 樣品檢驗(yàn)

待測(cè)樣品進(jìn)行DNA 提取后，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到擴(kuò)增的Ct值，通過(guò)Ct值與DNA濃度的線性關(guān)系，求出樣品的DNA 濃度，再根據(jù)樣品的DNA 濃度求出樣品質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ct 值與DNA 濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Ct 與DNA 濃度呈線性關(guān)系，DNA 濃度越高，只需要比較少的循環(huán)數(shù)就可以使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值，這樣Ct 值就比較小。相反，DNA 濃度越小，就需要較多的循環(huán)數(shù)才能使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值，這樣Ct 值就較大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的10 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值和DNA 濃度關(guān)系如圖2所示。

圖2 Ct 與DNA 濃度呈線性關(guān)系

2.2 杏仁質(zhì)量濃度與DNA 濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)樣品制備中10 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)模板按照1.3.2的方法進(jìn)行DNA 提取，之后用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)所提取的DNA 進(jìn)行測(cè)定，記錄每個(gè)樣品的DNA 濃度。每個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性擬合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果生成相關(guān)系數(shù)曲線，見(jiàn)圖3，杏仁的相關(guān)性系數(shù)R2為0.997。

圖3 杏仁質(zhì)量濃度與DNA 濃度關(guān)系

2.3 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取3 個(gè)已知質(zhì)量濃度的樣品，提取DNA 后，取4 μL 進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶入本研究建立的計(jì)算公式中進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，測(cè)得值與標(biāo)準(zhǔn)值的相對(duì)誤差較小，在方法學(xué)范圍內(nèi)，最大相對(duì)誤差為9.12，見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)已知DNA 濃度樣品的檢測(cè)，說(shuō)明該方法可以用于杏仁制品的檢測(cè)。

表2 已知樣品檢測(cè)結(jié)果

2.4 方法與實(shí)際應(yīng)用

利用所建立的方法對(duì)所采購(gòu)的10 個(gè)不同品牌的杏仁露進(jìn)行檢測(cè)分析，樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。測(cè)得10 個(gè)樣品中有2 個(gè)樣品杏仁質(zhì)量濃度低于5%，1 個(gè)樣品杏仁質(zhì)量濃度為0，其余均為20%以上。結(jié)果說(shuō)明目前市面上銷售的杏仁露確實(shí)存在摻假售假的情況。

2.5 注意事項(xiàng)

由于實(shí)時(shí)熒光檢驗(yàn)過(guò)程中靈敏度較高，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程要求很高，且實(shí)驗(yàn)花費(fèi)也高，為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，嚴(yán)格按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行，注重實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。①熒光定量PCR 檢測(cè)靈敏度高，為了防止交叉污染，實(shí)驗(yàn)操作場(chǎng)地要進(jìn)行合理分區(qū)，一般分為第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)；第二區(qū)：樣本制備區(qū)；第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)，并按要求設(shè)置正負(fù)壓。②在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不同的實(shí)驗(yàn)分區(qū)要穿戴好專用的無(wú)菌服和一次性乳膠手套，不同的分區(qū)要使用專用的移液器等實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備。③實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，試劑要放置于冰盒上，避免強(qiáng)光照射，防止熒光淬滅。④所有試劑要加到反應(yīng)管底部，盡量不要沾到管壁上，反應(yīng)體系配制完畢后要低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡。⑤在操作過(guò)程中，盡量不要在PCR 反應(yīng)管上做任何標(biāo)記，不要用手碰到PCR 反應(yīng)管上部的采光部分，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。⑥結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)中用到的相應(yīng)設(shè)備，只要不怕水和腐蝕的，都用有效氯消毒液進(jìn)行浸泡或擦拭，最后用清水洗凈或擦凈的方法來(lái)清潔，操作臺(tái)要進(jìn)行紫外線照射。

3 結(jié)論

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法探索杏仁露中杏仁的定量方法，通過(guò)建立DNA 濃度和Ct 值、杏仁質(zhì)量濃度和DNA 濃度之間的線性關(guān)系，就可以根據(jù)未知樣品的Ct 值計(jì)算出未知樣品中杏仁的質(zhì)量濃度，建立杏仁源性成分的定量方法。該方法能檢測(cè)杏仁露中的微量帶入或故意摻假問(wèn)題，為常規(guī)化源性成分檢測(cè)提供新的思路。同時(shí)，其他源性成分的檢測(cè)也可以參照此方法，為其他植物蛋白飲料的日常檢驗(yàn)提供了有利的科學(xué)依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。其相對(duì)于傳統(tǒng)PCR 來(lái)說(shuō)更無(wú)需進(jìn)行后續(xù)的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。但熒光定量PCR 也存在很多不足之處。①用來(lái)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要自己制備，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用的標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)別較大，缺少可比較性。②由于實(shí)驗(yàn)操作的要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地要求很高，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要消耗大量一次性耗材，這就導(dǎo)致了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)成本的提高。