邱劍飛，張知音，趙 鵬，李 珂，吳小森，李 靜，楊 玨＊＊，李艷梅＊＊

（1.省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽(yáng) 550014；2.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貴陽(yáng) 550014；3.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽(yáng) 550025；4.貴航貴陽(yáng)醫(yī)院 貴陽(yáng) 553009；5.湖南省湘西自治州煙草公司永順縣分公司 湘西自治州 416000）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，2020年，新發(fā)女性乳腺癌病例（226萬(wàn)例）首次超過(guò)肺癌（221萬(wàn)例），成為全球第一大癌癥。中國(guó)是乳腺癌大國(guó)，2020年新發(fā)乳腺癌患者約42萬(wàn)例，導(dǎo)致近12萬(wàn)人死亡[1]。臨床上根據(jù)患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長(zhǎng)因子受 體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達(dá)情況的不同把乳腺癌分為3種類型，包括激素受體陽(yáng)性乳腺癌、表皮生長(zhǎng)因子受體-2陽(yáng)性乳腺癌和三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）[2]。激素受體陽(yáng)性乳腺癌是指患者ER或PR表達(dá)為陽(yáng)性，HER-2表達(dá)為陰性。表皮生長(zhǎng)因子受體-2陽(yáng)性乳腺癌是指患者的HER-2表達(dá)為陽(yáng)性，同時(shí)ER和PR表達(dá)均為陰性。三陰性乳腺癌是指患者ER、PR及HER-2表達(dá)均為陰性，也是乳腺癌中具有高度轉(zhuǎn)移特性的一種亞型。

手術(shù)治療是三陰性乳腺癌治療的首選方案[3]。對(duì)于全身情況較差，年老體弱不能耐受手術(shù)的乳腺癌患者，需要制定相應(yīng)的化療及放療方案進(jìn)行治療[4]。無(wú)論是化療還是放療，都存在作用靶點(diǎn)單一、治療效果有限的弊端，同時(shí)會(huì)帶來(lái)一些副作用，患者會(huì)出現(xiàn)一定程度的身體損傷，比如臨床上治療過(guò)程中因患者個(gè)人體質(zhì)不同可能會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭暈、頭痛等不良反應(yīng)。環(huán)磷酰胺是乳腺癌治療中的一種常見(jiàn)的烷化劑類化療藥物，與DNA發(fā)生烷化，形成交叉聯(lián)結(jié)，可直接破壞DNA的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但其對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生毒副作用，如骨髓抑制和免疫抑制等[5]。所以，目前在三陰性乳腺癌的治療方面可以選擇的方案有限。因此，開(kāi)發(fā)有效治療三陰性乳腺癌的創(chuàng)新藥物或新的治療策略迫在眉睫。

近年來(lái)，基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果顯示部分中藥及其活性成分與環(huán)磷酰胺聯(lián)用具有良好的增效減毒作用，并且能夠延長(zhǎng)患者生存期[6-8]，可見(jiàn)中醫(yī)藥在現(xiàn)代腫瘤防治中扮演著重要角色。一清顆粒源自張仲景《金匱要略》之三黃瀉心湯，由大黃、黃芩、黃連三味藥組成，具有清熱瀉火解毒、化瘀涼血止血之效[9]，臨床用于火毒血熱所致的身熱煩躁、目赤口瘡、咽喉牙齦腫痛和咽炎等。另有研究表明，一清顆粒中的大黃、黃芩和黃連三味藥均能表現(xiàn)出一定的抗三陰性乳腺癌的作用[10-12]，而三味藥聯(lián)合用藥是否能夠發(fā)揮協(xié)同作用、抑制三陰性乳腺癌，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。以4T1乳腺癌荷瘤小鼠為模型對(duì)三陰性乳腺癌進(jìn)行研究已有較多報(bào)道[12-13]。為此本實(shí)驗(yàn)利用小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞4T1制備BALB/c乳腺癌荷瘤小鼠模型，以研究一清顆粒單用及與環(huán)磷酰胺聯(lián)用時(shí)對(duì)三陰性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的影響，為臨床抗乳腺癌聯(lián)合藥物方案的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為復(fù)方中藥的二次開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

小鼠三陰性乳腺癌4T1細(xì)胞系，貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性BALB/c小鼠，鼠齡4-6周齡，體重18-20 g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。

1.3 藥品與試劑

一清顆粒，規(guī)格：每袋7.5 g，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20055404，批號(hào)：20190605，購(gòu)自貴州百靈企業(yè)集團(tuán)正鑫藥業(yè)有限公司；環(huán)磷酰胺注射液，規(guī)格：每支3 mg，注冊(cè)證號(hào)：H20160467，批號(hào)：8D229A，自德國(guó)Baxter Oncology GmbH公 司。TRIzol購(gòu) 自 美 國(guó)Invitrogen公 司，貨 號(hào)：15596-018，逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu) 自 日本TaKaRa公司，貨號(hào)：RRO47Q，熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBY Green Master(ROX)購(gòu)自瑞士羅氏公司，貨號(hào)：4913850001。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.4 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo scientific）生物安全柜（Thermo scientific），倒置顯微鏡（ZEISS公司），臺(tái)式離心機(jī)（BECKMAN），電子天平（METTLER TOLEDO公司）。NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo scientific），StepOne PLUS熒光定量PCR儀（ABI）。

1.5 模型構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化處理，收集細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基重懸，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cell·mL-1，每只小鼠右側(cè)第二乳頭脂肪墊皮下注射50μL細(xì)胞懸液。

1.6 分組與給藥方案

將成功建立的乳腺癌荷瘤小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺）、實(shí)驗(yàn)組（一清顆粒）和聯(lián)合組（一清顆粒+環(huán)磷酰胺），每組8只。按照人與動(dòng)物體表面積換算給藥劑量給與小鼠藥物，陽(yáng)性對(duì)照組每日腹腔注射30 mg·kg-1環(huán)磷酰胺，實(shí)驗(yàn)組每日灌胃20 g·kg-1一清顆粒，聯(lián)合組每日腹腔注射30 mg·kg-1環(huán)磷酰胺+每日灌胃20 g·kg-1一清顆粒。陰性對(duì)照組每日灌胃等體積0.9%NaCl+每日腹腔注射等體積0.9%NaCl。

1.7 觀察腫瘤生長(zhǎng)體積

從給藥后第1天開(kāi)始，每隔1天，用游標(biāo)卡尺測(cè)量測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑（A）和短徑（B），瘤塊體積=0.5×長(zhǎng)徑（A）×短徑（B）2。

1.8 測(cè)定各組抑瘤率、胸腺指數(shù)

采血后，頸椎脫臼法處死各組小鼠，解剖并摘取小鼠的移植瘤塊組織、脾臟和胸腺，精密稱重后計(jì)算各組抑瘤率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，抑瘤率（%）=[1-陽(yáng)性對(duì)照組（實(shí)驗(yàn)組或聯(lián)合組）平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重]×100%；脾(胸腺)指數(shù)=脾(胸腺)重(mg)/體重(g)。

1.9 測(cè)定各組中性粒細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例

末次給藥結(jié)束后，眼眶采血測(cè)定血常規(guī)，測(cè)定各組中性粒細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例。

1.10 測(cè)定各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例

將各組小鼠腫瘤組織在含有1 mg·mL-1I型膠原酶的RPMI-1640培養(yǎng)基中用剪刀剪成2 mm×2 mm的小塊，置于37℃，消化1 h。將組織過(guò)2次70 μm的細(xì)胞篩，使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，PBS清洗2遍，3000 rpm離心5 min，PBS重懸后得到腫瘤組織單細(xì)胞混懸液。按照使用說(shuō)明書(shū)，使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，分離得到淋巴細(xì)胞。用CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤淋巴細(xì)胞比例，操作如下：將得到的淋巴細(xì)胞用2% BSA于4℃封閉30 min，之后取1.0×106細(xì)胞（100 μL體積）加入熒光標(biāo)記的抗小鼠CD4和CD8抗體，離心，PBS重懸后，上機(jī)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例。

1.11 RT-PCR技術(shù)測(cè)定各組瘤組織中IL-6和TNFα mRNA的表達(dá)水平

取各組小鼠的腫瘤組織適量，加入1 mL的TRIzol試劑，冰上研磨制成組織勻漿，裂解5 min，加200μL三氯甲烷，上下顛倒2 min，室溫靜置3 min；4℃12000 rpm離心15 min；將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中；加等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置40 min；4℃12000 rpm離心10 min；棄去上清，用預(yù)冷的75%乙醇1.0 mL洗滌沉淀物；4℃7500 rpm離心5min；棄上清；風(fēng)干5-10 min，用DEPC水溶解沉淀物；取適量溶解后的總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Roche熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBY Green Master(ROX)，按照該試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，最后通過(guò)StepOne PLUS熒光定量PCR儀擴(kuò)增檢測(cè)各組瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平，IL-6和TNF-α基因的引物序列設(shè)計(jì)如下：IL-6上游引物：5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，下游引物：5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’；TNF-α上游引物：5’-TATGGCTCAGGGTCCAACTC-3’，下游引物：5’-CTCCCTTTGCAGAACTCAGG-3’。

1.12 測(cè)定各組體質(zhì)量增加率

稱量給藥前和給藥結(jié)束后小鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組體質(zhì)量增加率，體質(zhì)量增加率=（實(shí)驗(yàn)結(jié)束后體質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量）/實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量×100%。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素多樣本方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠移植瘤腫瘤體積變化的影響

與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和聯(lián)合組腫瘤生長(zhǎng)速度緩慢，而實(shí)驗(yàn)組效果不明顯，并且聯(lián)合組腫瘤生長(zhǎng)速度低于陽(yáng)性對(duì)照組。給藥7天后，陽(yáng)性對(duì)照組和聯(lián)合組的移植瘤體積與陰性對(duì)照組相比均有顯著差異（P＜0.01）。且給藥11天后，聯(lián)合組的移植瘤體積與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用可以顯著增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤小鼠瘤體積生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組荷瘤小鼠瘤體體積變化情況（±s，n=8）

2.2 對(duì)各組荷瘤小鼠存活時(shí)間的影響

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合組的生存比例分別為37.5%、50%、37.5%和87.5%，并且聯(lián)合組與陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）（P=0.047）。該結(jié)果表明一清顆粒和環(huán)磷酰胺聯(lián)用可以提高荷瘤小鼠的存活率，延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間（圖2）。

圖2 各組荷瘤小鼠存活時(shí)間（n=8）

2.3 對(duì)小鼠移植瘤重量和抑瘤率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合組的抑瘤率分別為60.34%、24.77%和76.46%。與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和聯(lián)合組的腫瘤重量均顯著降低（P＜0.01），與陽(yáng)性對(duì)照組相比，聯(lián)合組的腫瘤重量顯著下降（P＜0.01）且抑瘤率增加。說(shuō)明一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用可增強(qiáng)環(huán)磷酰胺的抑瘤效果，見(jiàn)表1和圖3。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤重量及抑瘤率（±s，n=3）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤重量及抑瘤率（±s，n=3）

注：各組間腫瘤重量采用t檢驗(yàn)，與陰性對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比，#P＜0.05，##P＜0.01；抑瘤率采用卡方檢驗(yàn)，與陽(yáng)性對(duì)照組比，*P＜0.05。

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圖3 各組小鼠瘤體

2.4 對(duì)荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的胸腺指數(shù)受到明顯抑制（P＜0.05），而脾指數(shù)無(wú)明顯影響；實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)也均無(wú)明顯影響。與陽(yáng)性對(duì)照相比，聯(lián)合組小鼠胸腺指數(shù)顯著增加（P＜0.01），脾指數(shù)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明一清顆粒和環(huán)磷酰胺聯(lián)用可以改善環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用時(shí)所抑制的胸腺指數(shù)。見(jiàn)表2。

表2 各組荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)（±s，n=3）

表2 各組荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)（±s，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.5 對(duì)各組荷瘤小鼠中性粒細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比例的影響

與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠外周血淋巴細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)用組無(wú)顯著性差異。與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合組的小鼠中性粒細(xì)胞比例和單核細(xì)胞比例無(wú)明顯差異。與陽(yáng)性對(duì)照組比，聯(lián)用組可以顯著提高淋巴細(xì)胞的比例（P＜0.05），說(shuō)明一清顆?？娠@著改善環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞比例的抑制作用，見(jiàn)表3。

表3 各組荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)（±s，n=3）

表3 各組荷瘤小鼠血常規(guī)指數(shù)（±s，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比，#P＜0.05。

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2.6 對(duì)各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例的影響

與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)合組的腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），而陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著性差異。與陽(yáng)性對(duì)照組比，聯(lián)用組可以顯著提高腫瘤組織中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例（P＜0.01），見(jiàn)表4和圖4。

圖4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例

表4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例（±s，n=3）

表4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例（±s，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.7 對(duì)各組荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響

與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和聯(lián)合組的腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。并且與陽(yáng)性對(duì)照組比，聯(lián)用組的腫瘤組織中IL-6表達(dá)水平較低（P＜0.05），而TNF-α沒(méi)有顯著性差異，見(jiàn)表5。

表5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平（±s，n=3）

表5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平（±s，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比，#P＜0.05。

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2.8 對(duì)各組荷瘤小鼠體質(zhì)量增加率的影響

與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)用組的體質(zhì)量增加率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組和聯(lián)用組的體質(zhì)量增加率明顯提高（P＜0.05），說(shuō)明一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用可以降低環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體重的影響，見(jiàn)表6。

表6 各組荷瘤小鼠體質(zhì)量增加百分率的比較（±s，n=3）

表6 各組荷瘤小鼠體質(zhì)量增加百分率的比較（±s，n=3）

注：與陰性對(duì)照組比，*P＜0.05，**P＜0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組比，#P＜0.05

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3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)約15%的患者為三陰性乳腺癌，由于缺失3種關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)：雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2），導(dǎo)致內(nèi)分泌治療或抗HER-2靶向治療的方案對(duì)之療效甚微[14-15]。目前，化療是三陰性乳腺癌的主要治療方式，但是5年內(nèi)患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)20%[16]。另一方面，長(zhǎng)期使用化療藥物會(huì)產(chǎn)生副作用和藥物抗性，也成為三陰性乳腺癌治療的難點(diǎn)[17]。

與大多數(shù)其他惡性腫瘤不同，乳腺癌最初被認(rèn)為是免疫原性較低的癌癥類型。然而，多項(xiàng)研究表明，具有高水平淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的早期和晚期三陰性或HER-2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后較好，表明三陰性乳腺癌患者也可以從免疫檢查點(diǎn)抑制劑中獲益[18-20]。雖然腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制療法（如PD-1和PD-L1抗體）已被批準(zhǔn)用于局部晚期或轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌的臨床治療，但是由于腫瘤異質(zhì)性、免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，免疫檢查點(diǎn)抑制療法仍然存在一定的障礙和挑戰(zhàn)。數(shù)據(jù)顯示只有10-20%的三陰性乳腺癌患者對(duì)免疫治療有好的響應(yīng)[21]。因此，開(kāi)發(fā)有效治療三陰性乳腺癌的創(chuàng)新藥物迫在眉睫，但是如何發(fā)現(xiàn)這類新型藥物是亟需探究和解決的科學(xué)問(wèn)題。

多年的臨床實(shí)踐表明，清熱類中藥的藥理作用廣泛，具有解熱、抗炎、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫能力等功能，且療效確切。目前，傳統(tǒng)清熱類中藥在三陰性乳腺癌的治療上也取得許多新進(jìn)展。例如，在中藥提取物方面，蒲公英的提取物能夠通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞增殖[22]。在中藥復(fù)方制劑方面，復(fù)方半邊蓮口服液能夠顯著提高CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例，降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，提高了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫能力[23]。由此可見(jiàn)，清熱類中藥可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗三陰性乳腺癌的作用，這為治療三陰性乳腺癌的新型藥物開(kāi)發(fā)提供了潛在的活性物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前化療常作為三陰乳腺癌根治性手術(shù)后的一線治療手段，臨床上常見(jiàn)副作用較多，對(duì)患者的生理功能損害較大，而使用一些清熱類藥物輔助化療治療在臨床上具有一定增效減毒的作用。如施曉麗等[24]采用清熱解毒法與新輔助化療相結(jié)合的方法治療乳腺癌，發(fā)現(xiàn)能明顯改善患者免疫功能，使白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率得以減少。戴玉娜等[25]復(fù)方苦參注射液聯(lián)合乳腺癌新輔助化療的療效觀察結(jié)果顯示，聯(lián)合組能提高治療效果，減輕血小板減少、肝功能異常和胃腸道反應(yīng)等毒副作用?？梢?jiàn)清熱類中藥不僅自身具有抗三陰性乳腺癌的潛能，也可以作為輔助化療治療三陰性乳腺癌，可起到增加療效、減輕毒副反應(yīng)和改善患者生存質(zhì)量的作用。因此發(fā)現(xiàn)與化療藥物聯(lián)用具有增效減毒的清熱類藥物，對(duì)于解決化療藥物的毒副作用及耐藥現(xiàn)象具有一定的臨床意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺癌屬于氣血失調(diào)和痰凝毒滯等所致的雜癥，機(jī)體正氣受損，而化療又進(jìn)一步耗損氣血和熱毒損傷，因此治宜清熱解毒以及養(yǎng)陰益氣。一清顆粒是由黃連、大黃、黃芩三味藥組成的清熱劑，方中黃連和黃芩分別重于清心胃之火和肺胃之火，并可涼血止血。大黃清熱解毒，攻積泄熱，三味藥聯(lián)合具有清熱瀉火解毒、化瘀涼血止血之效。為了考察一清顆粒是否具有抗三陰性乳腺癌的作用，本研究利用小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞株4T1建立乳腺癌荷瘤小鼠模型，分為陰性對(duì)照組、一清顆粒、陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺和一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用組，以在體內(nèi)評(píng)價(jià)一清顆粒單用和聯(lián)用時(shí)對(duì)三陰性乳腺癌的作用。結(jié)果顯示一清顆粒單用時(shí)對(duì)三陰性乳腺癌荷瘤小鼠的效果不佳，但是與環(huán)磷酰胺聯(lián)用可增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)荷瘤小鼠體積生長(zhǎng)的抑制作用，提高環(huán)磷酰胺的抑瘤率，并且能夠延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活時(shí)間，能夠發(fā)揮協(xié)同增效的作用，為一清顆粒這種清熱解毒藥物能夠用于三陰性乳腺癌的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于化療藥物長(zhǎng)期使用可能使腫瘤細(xì)胞對(duì)其的敏感性降低，一清顆粒作為復(fù)方中藥具有多成分，多靶點(diǎn)的作用特征，是否可能通過(guò)改善腫瘤微環(huán)境而發(fā)揮增效作用，仍需要進(jìn)一步探究。

環(huán)磷酰胺有顯著的抗腫瘤效應(yīng)，但是同時(shí)也具有免疫抑制的作用，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致一些副作用，比如胃腸道反應(yīng)、對(duì)血液系統(tǒng)有一定的損傷和骨髓抑制等。本研究中結(jié)果顯示陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠外周血淋巴細(xì)胞比例、胸腺指數(shù)以及體質(zhì)量增加率都顯著低于陰性對(duì)照組。淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答的主力，而胸腺是T細(xì)胞發(fā)育、分化的主要場(chǎng)所，是身體免疫系統(tǒng)重要的器官，其器官指數(shù)可反映免疫功能[26-28]。免疫功能對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要的調(diào)控作用，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrates lymphocytes,TILs)是最早被發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞，其中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞具有一定的抗腫瘤免疫作用[29-30]。一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用組可以明顯拮抗環(huán)磷酰胺單獨(dú)使用時(shí)對(duì)胸腺指數(shù)和淋巴細(xì)胞比例的抑制作用。同時(shí)一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用組腫瘤組織中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞比例也顯著增加，提高了機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤微環(huán)境的炎癥因子如IL-6、IL8和TNF-α等在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中扮演著重要的角色，最近有研究表明乳腺癌腫瘤微環(huán)境中IL-6過(guò)度表達(dá)，并且能激活下游信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥等[31-32]。有研究人員發(fā)現(xiàn)下調(diào)血清中TNF-α的表達(dá)可以促進(jìn)長(zhǎng)期抗腫瘤免疫[33]。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)一清顆粒、環(huán)磷酰胺及兩者聯(lián)用均能下調(diào)乳腺癌瘤組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)，表明一清顆粒與環(huán)磷酰胺對(duì)腫瘤炎癥因子有一定的影響。體質(zhì)量增加率可一定程度上反應(yīng)小鼠生存質(zhì)量[34-35]。陽(yáng)性對(duì)照組的結(jié)果提示環(huán)磷酰胺可造成小鼠免疫抑制并且體重下降。一清顆粒與環(huán)磷酰胺聯(lián)用組可以降低環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠體重的影響，改善小鼠的生存質(zhì)量，因此一清顆粒能夠減輕因環(huán)磷酰胺引起的毒性反應(yīng)，發(fā)揮減毒作用。

綜上所述，一清顆粒聯(lián)合環(huán)磷酰胺不僅可以有效抑制三陰性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)可以在一定程度上改善環(huán)磷酰胺所造成的骨髓、免疫器官等損害，從而起到增效減毒的作用。該研究不僅為一清顆粒這種清熱藥物在臨床腫瘤化療中的輔助應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)一清顆粒的二次開(kāi)發(fā)提供新的思路，但是其具體的分子機(jī)制及化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)仍需進(jìn)一步深入研究。

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