車 慧，王鳳云，張佳琪，謝璟儀，唐旭東＊＊

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院脾胃病研究所 北京 100091）

胃食管反流病（Gastroesophageal reflux disease，GERD）是胃內(nèi)容物（食物、胃酸、膽汁等）反流入食管或口腔，引發(fā)不適癥狀和（或）并發(fā)癥的一類疾病。除典型癥狀反酸和燒心外，臨床表現(xiàn)極具異質(zhì)性。GERD為復(fù)雜因素致病，食管的病理改變不能完全反應(yīng)癥狀的嚴(yán)重程度。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國約82.8%有反流癥狀的患者內(nèi)鏡下未見食管黏膜損傷[1]。目前，引發(fā)反流相關(guān)癥狀的機制尚未完全闡明。除異常酸暴露外，當(dāng)食管上皮抵抗力減弱時，感覺閾值下降，正常的酸暴露也可引起癥狀的發(fā)生[2]。MCs是介導(dǎo)神經(jīng)源炎癥的重要細(xì)胞，廣泛分布于胃腸道黏膜固有層和黏膜下層，又被稱為免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的橋梁。其活化受到炎性因子和神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)，并通過自分泌、旁分泌等方式發(fā)揮正反饋效應(yīng)，加重外周的神經(jīng)源炎癥，導(dǎo)致食管黏膜下層的神經(jīng)末梢敏化，進(jìn)一步通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)，引起食管感覺異常。在藥物治療上，相對于質(zhì)子泵抑制劑（Proton pump inhibitors，PPIs）單靶點的作用機制，中醫(yī)藥在針對GERD復(fù)雜病機的治療上則更具優(yōu)勢。

GERD易反復(fù)發(fā)作，病程遷延。久病以虛實夾雜證多見，脾虛濕熱證為臨床常見證型[3]。健脾清化顆粒（黨參、黃連、蒼術(shù)等11味中藥組成）是中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院脾胃病研究所唐旭東教授長期以來治療脾虛濕熱型GERD的經(jīng)驗方，臨床實踐基礎(chǔ)較好。本實驗以SD大鼠為研究對象，探討了GERD脾虛濕熱證大鼠食管粘膜MCs的活化情況及健脾清化顆粒的干預(yù)機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供72只（8-12周齡），許可證號：SCXK（京）2016-0002。由西苑醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，動物室條件為Ⅱ級，室溫22-25℃，相對濕度45-60%，顆粒飼料喂養(yǎng)、自由飲水。該實驗通過中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（No.2019XLC008-2）。

1.2 藥物

健脾清化顆粒浸膏粉由西苑醫(yī)院制劑室制備，每克干粉相當(dāng)于6.06 g生藥，25℃以下室溫保存。奧美拉唑片（批號H20044871，每片10 mg），由山東新時代藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器設(shè)備與試劑

醫(yī)用石蠟、無水乙醇、4%多聚甲醛、二甲苯、蘇木素-伊紅染色液及中性樹膠等（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院病理科提供），甲苯胺藍(lán)染色液（上海歌凡生物科技有限公司，批號：M026），Anti-Mast Cell Tryptase（abcam，批號：ab2378），anti-PAR2抗體（abcam，批號：ab180953），Anti-TRPV1抗體（NOVUS，批號：NB100-1617），卵清蛋白（Sigma-Aldrich，A5378），氫氧化鋁凝膠（Thermo Fisher），百花牌蜂蜜（1000 g/瓶，北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司），金鑼精致豬油（1000 g/桶，新程金鑼肉制品集團有限公司），56%vol紅星二鍋頭白酒（500 mL/瓶，北京紅星股份有限公司）。

人工氣候箱：PVC材質(zhì)，大小100 cm×40 cm×40 cm。內(nèi)含風(fēng)暖加熱器2支（氣候箱兩側(cè)，對吹），加濕器1個（開口位于氣候箱中間），溫度計1支，中間由金屬網(wǎng)（直徑1.5 mm，不銹鋼）平均分成5格（每格里放5只大鼠+食盒水盒），內(nèi)設(shè)智能溫控、濕控，箱體下部裝金屬網(wǎng)將大鼠托起，底部放置糞便托盤，內(nèi)鋪墊料。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥

采用(改良食管十二指腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)+腹腔蛋白注射）+內(nèi)外因濕熱干預(yù)法建立GERD脾虛濕熱證大鼠模型。疾病造模參照文獻(xiàn)[4]，證候造模參照文獻(xiàn)[5-6]。術(shù)后第5天注射（卵清蛋白30 mg+氫氧化鋁凝膠10 mg）/mL混勻液1 mL，假手術(shù)組注射生理鹽水1 mL。術(shù)后第8天，模型組隔日喂食，每次足量喂食，蜂蜜水（200 g/L）自由飲用，隔日以10 g/kg標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)大鼠體質(zhì)量油脂灌服，隔日再以10 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)灌服白酒，共14天，于手術(shù)后第17天將模型大鼠放在溫度為（32±2）℃，濕度為95%的人工氣候箱中，共5天。假手術(shù)組大鼠術(shù)后第8天予蒸餾水灌胃，連續(xù)14天。

模型評價后，隨機分為5組，分別為模型組（Model）、奧美拉唑組(OM)、健脾清化顆粒低劑量組(JPQH-L)、中劑量組(JPQH-M)、高劑量組((JPQH-H)，每組12只。按照健脾清化顆粒成人每日處方量計算大鼠給藥劑量。模型組建立完成后次日根據(jù)組別給藥，按照10 mL/kg灌胃。健脾清化低、中、高劑量組給藥濃 度 分別為0.193、0.385、0.770 g/100 g，1次/日。奧美拉唑組：按照成人劑量20 mg/日計算，按照大鼠10 mL/kg灌胃，奧美拉唑灌胃濃度為0.417 mg/100 g。假手術(shù)組(Sham)按照大鼠10 mL/kg計算，每日蒸餾水灌胃。

2.2 一般行為學(xué)評價

2.2.1體重測量

各組大鼠在給藥前、給藥14天稱重，比較給藥前后大鼠的體重變化差異。

2.2.2進(jìn)食量的確定

各組大鼠在給藥前、給藥14天稱重，比較給藥前后大鼠的體重變化差異。早上8-9點給予一定量飼料，隔日早上8-9點測定剩余飼料量。兩次天平稱重，比較前后差值除以大鼠數(shù)量計算出每只大鼠平均進(jìn)食量。

2.2.3肛溫測定

兩屆馬薩諸塞州州長，不僅讓杜卡基斯成為第二位希臘裔美國州長，還使他成為馬薩諸塞州任期最長的州長。大選中他僅僅獲得10個州和哥倫比亞特區(qū)的選舉人票，輸給了前副總統(tǒng)布什。敗選后杜卡基斯繼續(xù)擔(dān)任馬薩諸塞州州長直到1991年初。后成為美國鐵路公司董事會董事，同時受聘東北大學(xué)(Northeastern University)政治學(xué)教授、洛約拉馬利蒙特大學(xué)(Loyola MarymountUniversity)政治學(xué)系客座教授以及加州大學(xué)洛杉磯分校(UCLA)公共事務(wù)學(xué)院公共政策系客座教授。沃爾特·蒙代爾WalterMondale

各組大鼠給藥前、給藥14天于上午9點測量，肛溫計測量大鼠肛溫，每只大鼠測2次，取平均值。

2.2.4糞便含水量的測定

收集的24小時糞便，稱重記錄糞便濕重。后用烘干機將糞便烘干，稱重，記錄糞便干重。糞便含水量（%）=糞便（濕重-干重）/糞便濕重×100%。

2.3 取材

藥物干預(yù)第14天灌胃完成后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉后固定，上腹部正中線行2-3 cm切口，使胃部暴露，結(jié)扎幽門與十二指腸結(jié)合部，腹腔關(guān)閉。于60 min后處死大鼠，暴露腹腔，結(jié)扎賁門部后摘取全胃。剪開胃部，將胃內(nèi)容物倒入離心管中，離心15 min后，檢測上清液成分。腹主動脈取血，離心取上清液，放入液氮中后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。取食管組織（賁門上1 cm左右），用生理鹽水清洗，放入福爾馬林固定液或轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

2.4 HE染色

大鼠食管黏膜組織石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇水化，蘇木素染色10 min，沖洗，伊紅染色5 min，脫水，透明，封片。

2.5 甲苯胺藍(lán)染色

切片，脫蠟水洗，甲苯胺藍(lán)染色30 min，沖洗，脫水，透明，封片。在光鏡200倍視野下拍照，在400倍視野下每張切片隨機選取3個食管黏膜部位進(jìn)行觀察并計數(shù)。

2.6 免疫組化檢測食管黏膜組織中MCT、PAR2、TRPV1的表達(dá)

大鼠食管黏膜組織石蠟包埋切片，水洗；抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化氫酶封閉液室溫孵育，PBS沖洗；滴加山羊血清封閉液60 min，PBS沖洗；滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗；滴加二抗孵育60 min，PBS沖洗，加入顯色液至顯色后終止，蘇木素復(fù)染，PBS沖洗，脫水，透明，封片。每張切片在200倍視野下拍照，在400倍視野下每張切片隨機選取3個食管黏膜部位進(jìn)行觀察，應(yīng)用image J對圖片上棕黃色陽性區(qū)域MOD值進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果與分析

3.1 一般行為學(xué)指標(biāo)

3.1.1各組大鼠用藥前后體重變化

給藥前與假手術(shù)組比較，模型組及各給藥組體重顯著降低（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組體重均顯著增加（P＜0.01）。對各組給藥前后值變化進(jìn)行比較，健脾清化顆粒低、中、高劑量組、奧美拉唑組體重顯著增加，均高于模型組（P＜0.01）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中、高劑量組體重顯著增加（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠體重比較（xˉ±S，g）

3.1.2各組大鼠用藥前后進(jìn)食量變化

給藥前與假手術(shù)組比較，模型組及各給藥組體重顯著減少（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組進(jìn)食量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。對各組給藥前后值變化進(jìn)行比較，健脾清化顆粒低、中、高劑量組、奧美拉唑組進(jìn)食量顯著增加，均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中、高劑量組進(jìn)食量顯著增加（P＜0.01）（表2）。

表2 各組大鼠進(jìn)食量比較（xˉ±S，g）

3.1.3各組大鼠給藥前后肛溫比較

給藥前與假手術(shù)組比較，模型組及各給藥組肛溫顯著升高（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組肛溫均低于模型組，健脾清化顆粒中、高劑量組顯著降低（P＜0.05）。對各組給藥前后肛溫變化進(jìn)行比較，與模型組比較，健脾清化顆粒中、高劑量組顯著降低（P＜0.05）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中劑量肛溫顯著降低（P＜0.05）（表3）。

表3 各組大鼠肛溫比較（xˉ±S，g）

3.1.4各組大鼠給藥前后糞便含水量比較

給藥前與假手術(shù)組比較，模型組及各給藥組顯著升高（P＜0.01）。給藥后與模型組比較，各給藥組糞便含水量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。對各組給藥前后糞便含水量變化進(jìn)行比較，與模型組比較，健脾清化顆粒低、中劑量組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與奧美拉唑組比較，健脾清化顆粒中劑量組顯著降低（P＜0.05）（表4）。

表4 各組大鼠糞便含水量比較（xˉ±S，g）

3.2 HE染色觀察各組大鼠食管黏膜組織病理學(xué)結(jié)果

光鏡下觀察各組大鼠食管黏膜：假手術(shù)組大鼠食管黏膜表面較平整，粘膜表面復(fù)層鱗狀上皮光滑，黏膜下組織致密，基底細(xì)胞形態(tài)正常。模型組大鼠食管黏膜組織水腫，上皮細(xì)胞欠平整，基底細(xì)胞增生，排列不整齊，乳頭肌延長可達(dá)黏膜上皮厚度的2/3，存在炎性細(xì)胞浸潤。健脾清化顆粒各劑量組、奧美拉唑組大鼠食管黏膜損傷的情況均有一定程度的恢復(fù)，以高劑量組恢復(fù)最為明顯（圖1）。

圖1 各組大鼠食管黏膜組織病理學(xué)結(jié)果（HE×200）

3.3 甲苯胺藍(lán)染色觀察各組大鼠食管黏膜MCs

光鏡下觀察食管黏膜固有層、黏膜下層可見散在的MCs，呈橢圓形或梭形，胞質(zhì)內(nèi)含有藍(lán)紫色顆粒。MCs脫顆粒后可見胞膜邊界模糊，性狀不規(guī)則，胞質(zhì)呈空泡狀或染色變淺。對各組大鼠食管黏膜MCs進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果見表5，與假手術(shù)組比較，模型組顯著增多（P＜0.01），健脾清化顆粒各劑量組及奧美拉唑組與模型組比較顯著減少（P＜0.01），各給藥組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表5、圖2）。

圖2 各組大鼠食管黏膜MCs染色結(jié)果（×200）

表5 各組大鼠食管黏膜MCs計數(shù)（xˉ±S，n）

3.4 各組干預(yù)后大鼠食管黏膜MCT、PAR2、TRPV1表達(dá)情況

MCT、PAR2、TRPV1在各組大鼠食管黏膜組織中均有廣泛黃染，黃染部分即陽性表達(dá)。結(jié)果見表6，與假手術(shù)組比較，模型組MCT、PAR2、TRPV1MOD值升高（P＜0.01），與模型組比較，各給藥組大鼠均降低（P＜0.05或P＜0.01），各給藥組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表6、圖3、圖4、圖5）。

圖3 各組大鼠食管黏膜MCT表達(dá)（×200）

圖4 各組大鼠食管黏膜PAR2表達(dá)（×200）

圖5 各組大鼠食管黏膜TRPV1表達(dá)（×200）

表6 各組大鼠食管黏膜MCT、PAR2、TRPV1表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠食管黏膜MCT、PAR2、TRPV1表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1)P＜0.01；與模型組比較，2)P＜0.05，3)P＜0.01。

?

4 討論

GERD病機具有復(fù)雜性，約30%接受PPIs治療的GERD患者仍然存在臨床癥狀[7]。其中，以非糜爛性反流?。∟on-erosive reflux disease，NERD）所占比例最高[8]。內(nèi)臟敏感性增高是臨床治療的難點之一，其發(fā)病機制仍不明確，目前尚缺乏有針對性的特效藥物。既往研究報道了內(nèi)鏡陰性的GERD仍存在食管黏膜微觀結(jié)構(gòu)的改變，如食管黏膜阻抗降低，炎性細(xì)胞活化等[9-10]。因此，內(nèi)臟敏感性增高可能與炎性因子、神經(jīng)肽釋放增加引起神經(jīng)末梢的敏化和內(nèi)臟感覺閾值降低有關(guān)。當(dāng)傷害性信號由外周向中樞的傳導(dǎo)增強，進(jìn)而投射到大腦皮層引發(fā)癥狀[11]。TRPV1在消化道的表達(dá)上調(diào)能夠增加黏膜對刺激的感受性，此外，MCs是功能性胃腸病內(nèi)臟高敏感機制的重要效應(yīng)細(xì)胞[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，GERD患者食管遠(yuǎn)端黏膜出現(xiàn)MCs增殖活化現(xiàn)象，使得胞內(nèi)的特異性酶——MCT釋放增加，與本研究的結(jié)果一致。MCT的釋放將進(jìn)一步激活食管上皮的PAR2，促進(jìn)傷害性感受器TRPV1的表達(dá)，增強食管黏膜對刺激的感受性，引起不適癥狀[13-14]。

中醫(yī)認(rèn)為該病病機多虛實夾雜，初病在胃，久病及脾。脾虛為“本”，氣滯、郁熱、濕熱為“標(biāo)”。脾虛為關(guān)鍵，從“脾”論治在臨床中收到了良好的效果[15-18]。脾虛一方面表現(xiàn)為運化不利，影響胃之順降，則水反為濕，谷反為滯，壅滯中焦，日久化熱，形成濕熱實邪反傷脾胃；另一方面脾虛肝木乘之，中焦氣機升降失常，郁而化火，與濕搏結(jié)，易形成濕熱、痰火。以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)視角來看，脾胃濕熱體現(xiàn)在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸動力、微生態(tài)等多方面功能的異常，突出表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)動態(tài)失衡，機體炎癥反應(yīng)增加等[19-20]。

健脾清化顆粒是唐旭東教授在董建華“通降理論”指導(dǎo)下的臨床經(jīng)驗方，具有健脾清熱、化濕和胃降逆之功效。全方由黨參、蒼術(shù)、黃連等11味藥物組成，其中，黨參味甘、性平，歸脾、肺經(jīng)，擅于益氣健脾。《本草正義》云：黨參能“健脾運而不燥，滋胃陰而不濕……鼓舞清陽，振動中氣，而無剛燥之弊?！鄙n術(shù)味辛、苦，性溫，歸脾、胃經(jīng)，擅于燥濕運脾?！墩渲槟摇吩疲荷n術(shù)能“健胃安脾，諸濕腫，非此不能除?！秉S連味苦，性寒，歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，擅于清熱燥濕?！墩渲槟摇吩疲狐S連能“祛中焦?jié)駸?。”課題組前期開展多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的RCT研究證實健脾清化顆?？梢愿纳艷ERD癥狀，減少PPIs的劑量且能夠提高患者的生活質(zhì)量[21]。

本實驗采用改良食管十二指腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)+內(nèi)外因濕熱干預(yù)建立GERD病證結(jié)合大鼠模型，在造模過程中控制了食管十二指腸吻合口的大小，既保留了反流的病理機制，又能夠減少食管黏膜糜爛程度。通過觀察遠(yuǎn)端食管黏膜MCs數(shù)量和活化情況，以及PAR2、TRPV1表達(dá)水平來進(jìn)一步評價健脾清化顆粒對于食管高敏感的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞的干預(yù)機制。實驗結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，GERD脾虛濕熱證大鼠體重、進(jìn)食量減少，肛溫、糞便含水量增加，食管黏膜形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大鼠食管黏膜可見明顯基底層細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤、乳頭肌延長，細(xì)胞間隙疏松等形態(tài)學(xué)改變，符合了GERD脾虛濕熱證的特征。甲苯胺藍(lán)MCs染色發(fā)現(xiàn)大鼠食管黏膜MCs顯著增多,健脾清化顆粒能夠增加模型大鼠體重和進(jìn)食量，降低肛溫和糞便含水量，改善食管黏膜的炎癥狀態(tài)。同時，能夠減少食管黏膜MCs數(shù)量，減輕其活化脫顆粒及MCT的釋放，下調(diào)PAR2、TRPV1的蛋白表達(dá)水平，從而進(jìn)一步抑制神經(jīng)元的興奮，降低食管高敏感。

綜上所述，在GERD脾虛濕熱證模型大鼠的食管黏膜中可見MCs活化脫顆?，F(xiàn)象明顯，MCT釋放增多、同時PAR2、TRPV1蛋白表達(dá)增加。健脾清化顆粒通過減少MCs脫顆粒，下調(diào)MCT、PAR2、TRPV1的表達(dá)，從而發(fā)揮降低食管高敏感的作用。上述結(jié)果可能為中醫(yī)藥治療GERD食管高敏感的新靶點提供一定的證據(jù)，然而MCs活化所引起的食管高敏感機制尚未完全清楚，尚有待于進(jìn)一步研究。