胡 靜 許建秦 陳志永 任 慧 張曉鳳*

1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710061；2. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003

糖尿康膠囊是陜西省中醫(yī)醫(yī)院(以下簡稱“我院”)腎病科常用的院內(nèi)制劑(陜藥管制字[2001]第0022號)。糖尿康膠囊由西洋參、地黃、麥冬、天花粉、地骨皮、紅花、制何首烏、僵蠶、鹿角霜等九味藥材組成，具有滋陰益氣、活血通絡(luò)的功效。臨床上常用于消渴病，對煩渴多飲，消瘦多尿，乏力多汗及肢體麻木疼痛等癥療效確切[1]。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只有西洋參PanaxquinquefoliumL.的薄層色譜鑒別，專屬性差，無法控制糖尿康膠囊的質(zhì)量。我院作為糖尿康膠囊的使用單位，研究起草了糖尿康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，定性鑒別在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了地黃RehjnanniaglutinosaLibosch.、天花粉TrichosantheskirilowiiMaxim、地骨皮Cortex Lycii的薄層色譜鑒別，同時定量分析了2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量，并且據(jù)3批樣品的測定結(jié)果，確定其相對合理的含量限度，以期盡量全面反映和控制糖尿康膠囊的質(zhì)量，從而確保其臨床合理應(yīng)用和療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent科技有限公司)，配備四元泵、VWD檢測器、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和Agilent ChemStation for LC Systems工作站；KQ-400DE型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；BS210S萬分之一電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器〔北京〕有限公司)等。Agilent TC-C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色譜柱(美國Agilent科技有限公司)。

1.2 試藥 糖尿康膠囊(批號：20190601、20191101、20200901，陜西省中醫(yī)醫(yī)院制劑中心)；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號：MUST-16021005，購自中國食品藥品檢定研究院)。薄層層析硅膠G(批號：20200821，青島海洋化工有限公司)和羧甲基纖維素鈉(批號：20200713，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)為化學(xué)純試劑，乙腈和甲醇為色譜純試劑(美國賽默飛世爾科技公司)，水為屈臣氏蒸餾水，其他均為分析純試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)鑒別

2.1.1 地黃TLC鑒別[2-3]129取糖尿康膠囊10粒，去掉膠囊殼，將內(nèi)容物研細(xì)，加入50 mL水，加熱至微沸，冷卻，過濾，用乙酸乙酯提取濾液3次，每次30 mL，將乙酸乙酯溶液合并，水浴蒸發(fā)至干燥，加入1 mL甲醇溶解殘渣，用作供試品溶液。另取2 g地黃對照藥材，加入30 mL水，以同樣的方法制備地黃對照藥材溶液。取缺少地黃的陰性樣品，以同樣方法制成缺地黃陰性對照溶液。按照2020年版《中國藥典》四部通則0502項(xiàng)下“薄層色譜法”試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液及缺地黃陰性對照溶液各5 μL、地黃對照藥材溶液3 μL，在同一塊硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，用乙酸乙酯-甲酸-甲醇(16∶2∶0.5)作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與地黃對照藥材色譜相應(yīng)的位置處，顯藍(lán)色的熒光斑點(diǎn)一個，缺地黃的陰性對照色譜無干擾。如圖1所示。

1 2 3 4 51～3：三批樣品(批號：20190601,20191101,20200901)；4：對照藥材：5:缺地黃陰性對照圖1 地黃薄層色譜圖

2.1.2 天花粉TLC鑒別[2]57取糖尿康膠囊10粒，去掉膠囊殼，將內(nèi)容物研細(xì)，加20 mL稀乙醇，室溫下超聲處理30 min(250 W，50 Hz)，濾過，濾液水浴上濃縮至0.5 mL。取缺少天花粉的陰性對照樣品，采用同樣方法制成缺天花粉陰性對照品溶液。另取2 g天花粉對照藥材，采用同樣方法制成天花粉對照藥材溶液。再取瓜氨酸對照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為瓜氨酸對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》四部通則0502項(xiàng)下“薄層色譜法”試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液和缺天花粉陰性對照溶液各3 μL、天花粉對照藥材溶液2 μL、瓜氨酸對照品溶液1 μL，在同一塊硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，用正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水(8∶2∶2∶3)作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與天花粉對照藥材和瓜氨酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯玫紅色的主斑點(diǎn)一個，缺天花粉的陰性對照色譜無干擾。如圖2所示。

1 2 3 4 5 61～3：三批樣品(批號：20190601,20191101,20200901)；4：對照藥材；5：瓜氨酸；6：缺天花粉陰性對照圖2 天花粉薄層色譜圖

2.1.3 地骨皮TLC鑒別[2]128取糖尿康膠囊10粒，去掉膠囊殼，將內(nèi)容物研細(xì)，置于錐形瓶中，加甲醇15 mL，室溫下超聲30 min(250 W，50 Hz)，過濾，濾液水浴蒸發(fā)至干燥，加入1 mL甲醇溶解殘渣，用作供試品溶液。另取1.5 g地骨皮對照藥材，采用同樣方法制成地骨皮對照藥材溶液。取缺少地骨皮的陰性樣品，采用同樣方法制備缺地骨皮陰性對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》四部通則0502項(xiàng)下“薄層色譜法”試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液、缺地骨皮陰性對照溶液和地骨皮對照藥材溶液各6 μL，在同一塊硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，采用甲苯-甲酸-丙酮(10∶0.1∶1)做為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與地骨皮對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯1個相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，缺地骨皮陰性對照無干擾。如圖3所示。

12 345 61～3：三批樣品(批號：)；4、5：對照藥材；6：缺地骨皮陰性對照圖3 地骨皮薄層色譜圖

2.2 糖尿康膠囊中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的定量檢測

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠做為填充劑，色譜柱：Agilent 5 TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(B)-0.1%磷酸水溶液(D)梯度洗脫(0～5 min，2%B；5～10 min，2%～5%B；10～25 min，5%～15%B；25～50 min，15%～30%B；50～80 min，30%～60%B)，柱溫為30 ℃，檢測波長為320 nm，流速為1.0 mL/min。按2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計算理論塔板數(shù)不低于2000。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1188 mg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取糖尿康膠囊20粒，除去膠囊殼，混勻，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL的70%乙醇，常溫下超聲(250 W，50 kHz)提取30 min，放冷，重新稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 測定波長的選擇 取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液在200 ～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果最大吸收在320 nm處，同時結(jié)合2020年版《中國藥典》一部何首烏項(xiàng)下[2]129內(nèi)容，確定320 nm為檢測波長。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取缺制何首烏的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下制備制何首烏陰性對照品溶液，取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液1 μL和供試品溶液5 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，陰性對照無干擾，專屬性強(qiáng)。如圖4所示。

2.2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL分別置于10 mL量瓶中，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為Y=2.6834X-6.1472，相關(guān)系數(shù)r為0.9999，表明2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在1.188～594 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積值與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好。

2.2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液1 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計算2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面積的RSD。結(jié)果2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面積RSD為1.34%小于2.0%，表明儀器有良好的精密度。

1:2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；A：對照品溶液;B：供試品溶液;C：缺制何首烏陰性對照品溶液圖4 高效液相色譜圖

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批糖尿康膠囊(批號：20191119)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量為0.58 mg/g，RSD為0.55%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批糖尿康膠囊(批號：20191119)樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在室溫下放置0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h時進(jìn)樣測定，結(jié)果2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積的RSD為1.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的糖尿康膠囊(批號：20191119)樣品六份，每份0.5 g，置100 mL量瓶中，分別精密加入比例為1∶1的2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(mg/mL)對照品適量，依照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品，以“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算供試品中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均加樣回收率為98.18%，RSD值為2.41%，表明加樣回收符合要求。具體結(jié)果見表1。

2.2.5 樣品含量測定 取3批樣品分別精密稱取適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計算3批樣品中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。結(jié)果見表2。

2.3 含量限度的確定 根據(jù)表2中3批樣品含量測定的結(jié)果，考慮到藥材的來源，以及制劑生產(chǎn)、貯藏等因素，故暫定本品含2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷不得少于三批樣品含量均值的80%即0.4390 mg/g。

表1 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2 樣品中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 TCL條件篩選 糖尿康膠囊的TCL中地黃、天花粉、地骨皮是新增項(xiàng)，首先參考的是2020年版《中國藥典》一部中地黃[2]129、天花粉[2]57、地骨皮[2]128“鑒別”項(xiàng)下薄層鑒別，發(fā)現(xiàn)天花粉和地骨皮供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。但是按照藥典方法對糖尿康膠囊中地黃藥材的TCL鑒別供試品和對照藥材斑點(diǎn)不能一一對應(yīng)，后參照文獻(xiàn)[3]的樣品處理方法，并對展開劑進(jìn)行了調(diào)整，最終確定了文中地黃藥材的TCL鑒別方法。

3.2 HPLC條件篩選 指標(biāo)性成分選?。?,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷是制何首烏中二苯乙烯苷類成分，是2020年版《中國藥典》一部“制何首烏”含量測定項(xiàng)下測定成分之一[2]183。現(xiàn)代藥理研究[4]表明二苯乙烯苷類對2型糖尿病大鼠具有抑制炎癥、減輕氧化應(yīng)激，減少胰島素抵抗和糖、脂肪代謝的異常,并能顯著降低骨骼肌中甘油三酯和游離脂肪酸的作用[5-6]。且糖尿康中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量較其他已知成分高(注：10.22min和22.66 min處經(jīng)對照品比對確認(rèn)分別為沒食子酸和原兒茶酸，在此兩處轉(zhuǎn)換波長分別為273 nm[2]68和260 nm[7]含量依然很低，無法進(jìn)行質(zhì)量控制)及峰型好、與相鄰峰分離度大于1.5且陰性無干擾，故選擇其作為含量測定的指標(biāo)性成分。

流動相：在摸索2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量測定方法時參考了2020年版《中國藥典》一部“制何首烏”含量測定項(xiàng)下色譜條件及文獻(xiàn)[2]183[8]，分別考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%磷酸等不同配比作為流動相進(jìn)行等度和梯度洗脫。結(jié)果顯示，僅乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫可以對2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷與樣品中其他峰得到較好的分離，且流動相本身干擾小，基線平穩(wěn)，故選擇乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫。

提取溶劑和提取方法：考察了水、乙醇(10%、30%、50%、70%、90%、100%)、甲醇(10%、30%、50%、70%、90%、100%)等溶劑的提取效果，采用70%乙醇提取時得率最高，測定無干擾，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度均在1.5以上，故提取溶劑采用70%乙醇。同時考察了超聲處理(250 W，50 kHz)、加熱回流2種提取方法的效果，結(jié)果顯示，超聲提取和加熱回流提取對2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的影響相似，但超聲提取操作簡單易行，故采用超聲提?。灰?0%乙醇為溶劑時，考察了超聲處理(250 W，50 kHz)10 min、20 min、30 min、40 min、50 min對2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)超聲30 min時基本提取完全，故提取時間選擇30 min。

本研究在糖尿康膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有西洋參TLC定性鑒別的基礎(chǔ)上增加了地黃、天花粉、地骨皮TLC定性鑒別和2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷HPLC定量檢測，所建立的TLC方法簡便、專屬性強(qiáng)，HPLC方法穩(wěn)定性好、精密度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于糖尿康膠囊的質(zhì)量控制并提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。