付傳美 楊旭娟 劉一丹 孟 珂 黃 茜 陳建勛 劉軍鋒 楊兆祥* 劉國光

1. 昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100

腦卒中是全球第二大、中國第一大致死性疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等五大特點(diǎn)， 嚴(yán)重影響了患者的身體健康和生活質(zhì)量[1-2]，給社會(huì)和家庭帶來了沉重負(fù)擔(dān)。腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，缺血性腦卒中亦稱“腦?！?，是腦血管閉塞或阻塞引起的腦供血不足而導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷，表現(xiàn)為能量代謝衰竭，細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡紊亂，進(jìn)而使興奮性氨基酸釋放，Ca2+超載，自由基、炎癥因子大量釋放，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。針對(duì)以上特點(diǎn)，目前臨床上治療腦梗的策略主要是恢復(fù)供血、改善循環(huán)以及神經(jīng)保護(hù)[3]?？紤]到其復(fù)雜的病理生理過程，針對(duì)任何單一環(huán)節(jié)的治療都難以完全有效地阻止缺血損傷，聯(lián)合用藥有可能達(dá)到協(xié)同作用[4]。注射用曲札茋苷為昆藥集團(tuán)自主研制的擬用于急性腦梗患者的神經(jīng)保護(hù)劑，可通過清除自由基、抗氧化、抗炎、抗凋亡作用等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5-8]。鹽酸法舒地爾是一種新型的異喹啉磺胺衍生物，主要通過抑制Rho激酶達(dá)到擴(kuò)張血管、改善腦循環(huán)，也具有阻斷炎癥反應(yīng)、抗氧化等作用[9-12]。 二者聯(lián)用治療缺血性腦卒中的研究鮮有報(bào)道，且有無聯(lián)用的價(jià)值還需進(jìn)一步探究。故本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平上，通過觀察全腦缺血后小鼠的存活時(shí)間，局灶性腦缺血再灌注24h時(shí)的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積，血清中SOD活力、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6等含量變化，探討二者聯(lián)用對(duì)腦梗的保護(hù)作用及其能否產(chǎn)生協(xié)同增效作用，為臨床的應(yīng)用進(jìn)行探索并提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性ICR小鼠，體重24～28 g，由昆藥集團(tuán)股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(滇)K2019-0001，發(fā)證機(jī)關(guān)：昆明市科學(xué)技術(shù)局。小鼠采用透明塑料盒群養(yǎng)，每箱≤6只；溫度20～25 ℃(日溫差≤3 ℃)；濕度40%～70%；照明12 h∶12 h明暗交替，照度150～300 lx；噪音≤60 dB。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滇)K2019-0001，發(fā)證機(jī)關(guān)：昆明市科學(xué)技術(shù)局。每日喂飼鼠用配合飼料，自由飲水，視情況更換籠具和墊料。

1.2 藥品與主要試劑 注射用曲札茋苷(20 mg/支，含量98.7%，批號(hào)：20200530)，室溫、避光、密閉保存。鹽酸法舒地爾注射液(昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：20GE03-211，規(guī)格為2 mL∶30 mg，6支/盒)；依達(dá)拉奉右莰醇注射用濃溶液(先聲藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字H20200007，批號(hào)：181-201017，規(guī)格為5 mL:依達(dá)拉奉10 mg與右莰醇2.5 mg，6支/盒)；丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司， 批號(hào): 6182103107，規(guī)格為100 mL：丁苯酞25 mg與氯化鈉0.9 g)，甘露醇注射液；(青島明月海藻集團(tuán)有限公司，批號(hào):36150506)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma，CAS：298-96-4)，水合氯醛(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào):119957，Cas 號(hào):302-17-0)。小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6試劑盒均購于武漢貝茵萊生物制劑有限公司；SOD、MDA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器 AR224型電子分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；JX5001/5000g電子天平(上海浦春儀器計(jì)量有限公司)；PowerWave XS2型連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國Bio Tek)；Biofuge Stratos型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Thermo Scientific Heraeus公司)；各種規(guī)格移液器，德國Eppendorf公司；Millipore純水處理系統(tǒng)(美國Millipore公司)；1622A3腦缺血再灌注模型線栓(線栓直徑0.16±0.01，北京西濃科技有限公司)。

2 方法

2.1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎小鼠全腦缺血模型 雄性小鼠84只，按體重隨機(jī)分為7組：模型對(duì)照、丁苯酞(8.3 mg/kg)、曲札茋苷(3.35 mg/kg、6.7 mg/kg)、法舒地爾(7.5 mg/kg、15 mg/kg)、曲札茋苷聯(lián)合鹽酸法舒地爾(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)組，每組12只。各組動(dòng)物每日按10 mL/kg體重尾靜脈注射給藥1次(聯(lián)合給藥間隔1 h)，連續(xù)5 d；末次給藥15 min，用400 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，仰位固定，頸部正中切口，分離、結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合傷口。觀察并記錄每只小鼠自結(jié)扎至2 h內(nèi)的死亡時(shí)間為耐缺血缺氧時(shí)間，對(duì)存活時(shí)間超過2 h者計(jì)為2 h。

2.2 線栓致局灶性腦缺血小鼠再灌注模型 參照文獻(xiàn)[13-14]，取24～28 g雄性小鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，仰位固定、備皮、消毒后頸部正中切口，分離、結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈脈(common carotid artery，CCA)近心端及頸外動(dòng)脈(externalcarotid arter，ECA)；在CCA分叉處的近心端 2 ～ 3 mm 處切口， 插入線栓 8～10 mm， 使線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈( internal carotid artery，ICA)，穿過大腦中動(dòng)脈( middle cerebralartery， MCA) 起始端至大腦前動(dòng)脈近端， 阻斷 MCA的所有血流來源，固定線栓，縫合切口回籠飼養(yǎng)；假手術(shù)組僅分離CCA、ECA。將造模動(dòng)物分為6組：模型對(duì)照、陽性對(duì)照右莰醇(10 mg/kg )、曲札茋苷(3.35 mg/kg、6.7 mg/kg)、法舒地爾(7.5 mg/kg、15 mg/kg)及聯(lián)合用藥(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)組，每組12 只。造模后2 h，各組動(dòng)物分別按10 mL/kg體重靜脈注射給藥(聯(lián)合給藥間隔1 h)，同時(shí)拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌。再灌后24 h，參照改良的 Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15]對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，眼球取血用于測(cè)定SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6。處死小鼠，取腦切成厚度均為2 mm的腦片于1% TTC 溶液中，37 ℃、孵育20 min顯色后， 4%多聚甲醛中固定 24 h 后，數(shù)碼相機(jī)拍照， 以 Image J 軟件統(tǒng)計(jì)全腦片與梗死區(qū)面積(紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū))，計(jì)算腦梗死體積百分率，腦梗死體積百分率=[(非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積)×厚度(2 mm)/全腦體積]×100%。

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(改良的 Longa 評(píng)分)。0分: 無明顯神經(jīng)功能缺損；1 分: 提尾時(shí)，對(duì)側(cè)前肢不能前伸；2 分: 向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分: 不能承受對(duì)側(cè)自身重量；4 分: 無自主運(yùn)動(dòng)或意識(shí)障礙。分值越高，說明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)全腦缺血小鼠存活時(shí)間的影響 表1結(jié)果顯示，與模型組比較，曲札茋苷低劑量(3.35 mg/kg)組、法舒地爾低劑量(7.5 mg/kg)組在2 h內(nèi)死亡率與存活時(shí)間上均沒有體現(xiàn)出差異；曲札茋苷高劑量(6.7 mg/kg)組、法舒地爾高劑量(15 mg/kg)組及低劑量聯(lián)合用藥(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)組均能明顯延長(zhǎng)全腦缺血小鼠的存活時(shí)間，降低2 h內(nèi)的死亡率；其中，兩藥低劑量單用組與各自高劑量單用組比沒有差異(P>0.05)，與低劑量聯(lián)用組比，聯(lián)用能明顯延長(zhǎng)存活時(shí)間、降低2 h內(nèi)死亡率(P<0.01)；以上表明曲札茋苷聯(lián)合法舒地爾對(duì)提高全腦缺血小鼠的耐缺血缺氧能力有協(xié)同作用。

表1 對(duì)全腦缺血小鼠存活時(shí)間的影響

3.2 對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組比，模型小鼠表現(xiàn)出明顯的行為學(xué)缺陷(P<0.01)和腦梗死(P<0.01)，表明造模成功(表2、圖1) 。與模型組比，曲札茋苷低劑量(3.35 mg/kg)組、法舒地爾低劑量(7.5 mg/kg)組單用在神經(jīng)行為學(xué)評(píng)及腦梗死體積上降低趨勢(shì)不明顯，均沒有體現(xiàn)出差異；曲札茋苷高劑量(6.7 mg/kg)組、法舒地爾高劑量(15 mg/kg)組及低劑量聯(lián)合用藥(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)組對(duì)小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分有降低的趨勢(shì)，對(duì)腦梗死體積有明顯的降低作用(P<0.05或P<0.01) ；其中，兩藥低劑量單用與各自高劑量單用比無差異(P>0.05)；與低劑量聯(lián)用比，聯(lián)用能明顯降低腦梗死體積(P<0.01)。陽性對(duì)照右莰醇(10 mg/kg )亦可降低小鼠的行為學(xué)評(píng)分及腦梗死體積(P< 0.05，P<0.01) 。

3.3 對(duì)局灶性腦缺血再灌注小鼠血清中SOD、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6的影響 如表3 所示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠血清中 SOD 活性明顯降低、MDA含量明顯升高(P<0.01)，表明氧化應(yīng)激失衡。與模型組比，曲札茋苷及聯(lián)合用藥組均能升高血清中SOD活性，均能減少M(fèi)DA的生成(P<0.05)，且聯(lián)合給藥較兩藥單用組有不錯(cuò)的趨勢(shì)。提示曲札茋苷聯(lián)合法舒地爾提高了缺血再灌注模型小鼠的抗氧化能力。

表2 對(duì)缺血再灌注小鼠腦梗死體積的影響統(tǒng)計(jì)表

A:假手術(shù)；B：模型對(duì)照；C：陽性對(duì)照右坎醇(10 mg/kg )；D：曲札茋苷(6.7 mg/kg)；E：鹽酸法舒地爾注射液(15 mg/kg)；F：曲札茋苷+鹽酸法舒地爾注射液(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)

表3 對(duì)小鼠血清SOD、MDA含量的影響統(tǒng)計(jì)表

如表4所示，與假手術(shù)組相比，模型組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯增加(P<0.01)，表明炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。與模型組比，曲札茋苷、鹽酸法舒地爾注射液、聯(lián)合用藥組均能減少缺血再灌注小鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 生成(P<0.05或P<0.01) ；且聯(lián)合用藥的效果較單用藥組有更好的趨勢(shì)。提示曲札茋苷聯(lián)合法舒地爾提高了腦缺血小鼠的抗炎能力。

表4 對(duì)小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響統(tǒng)計(jì)表

4 討論

腦梗又稱缺血性腦卒中，是腦卒中最常見的類型，常產(chǎn)生一系列神經(jīng)缺損癥狀，如神經(jīng)系統(tǒng)缺血和缺氧性的壞死、腦水腫、炎癥反應(yīng)等，重者意識(shí)喪失，是病人致殘和致死的主要原因[16]。腦缺血再灌注發(fā)生后腦組織中活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量產(chǎn)生，炎癥細(xì)胞聚集，產(chǎn)生大量炎癥因子，谷氨酸興奮性毒性，鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞凋亡及血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞等多種病理機(jī)制參與腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)[17-20]。氧化應(yīng)激是缺血性腦損傷的主要病理機(jī)制，也是影響腦缺血嚴(yán)重程度的重要因素之一。CIRI激活炎癥因子是導(dǎo)致腦損傷的重要機(jī)制。在正常人體內(nèi)，自由基的生成、清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但在缺血性腦卒中發(fā)生后，過量自由基生成，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞膜損傷、神經(jīng)元死亡和腦組織梗死等。MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，其可加劇細(xì)胞膜的損傷，與體內(nèi)自由基的多少有關(guān)。SOD的水平高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，其本身有助于保護(hù)腦細(xì)胞免受氧自由基的損傷。缺血后細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 和IL-6刺激趨化因子中性粒細(xì)胞趨化因子、單核細(xì)胞趨化因子-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1產(chǎn)生和釋放，促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞遷移[21]。TNF-α濃度在腦梗死癥狀出現(xiàn)后6～12 h在血清中升高，在梗死后24 h內(nèi)腦脊液中顯著升高，與梗死面積呈正相關(guān)[22]。IL-6刺激淋巴T細(xì)胞增殖滲透加重炎癥反應(yīng)，其抗炎作用主要體現(xiàn)在可以上調(diào)IL-1ra，實(shí)驗(yàn)證明IL-6缺陷鼠梗死后結(jié)局不好[23]。目前對(duì)腦卒中發(fā)病機(jī)制的研究得到不斷地深入和發(fā)展，但其中各種機(jī)制相互關(guān)聯(lián)的樞紐點(diǎn)尚不明確，有待更深入地研究；且面對(duì)復(fù)雜發(fā)病機(jī)制的缺血性腦卒中，單一的藥物治療并不足以應(yīng)對(duì)腦缺血缺氧及再灌注引發(fā)的病理生理改變。

研究采用雙側(cè)頸總結(jié)扎的全腦缺血模型與局灶性腦缺血再灌注模型，主要從存活時(shí)間、神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積、抗氧化應(yīng)激指標(biāo)(SOD、MDA)、抗炎(TNF-α、IL-6、IL-1β)等方面對(duì)比曲札茋苷、鹽酸法舒地爾注射液?jiǎn)为?dú)給藥及聯(lián)合用藥對(duì)腦梗的保護(hù)作用。全腦缺血模型選擇丁苯酞作為陽性對(duì)照，考慮到其可改善腦缺血區(qū)的微循環(huán)和能量代謝，增加缺血部位腦血流量，能有效延長(zhǎng)模型小鼠的存活時(shí)間；局灶性腦缺血再灌注模型選擇依達(dá)拉奉右坎醇濃溶液作為陽性對(duì)照，其科學(xué)配伍了依達(dá)拉奉和右莰醇兩種活性成分，應(yīng)用兩種成分清除自由基、抗炎等作用機(jī)制，可顯著降低急性缺血性腦卒中引發(fā)的腦神經(jīng)損傷。一項(xiàng)納入1200名急性缺血性腦卒中患者的隨機(jī)、雙盲、頭對(duì)頭比較的III期研究[24]表明，對(duì)比單方依達(dá)拉奉注射液，依達(dá)拉奉右莰醇顯示出明確的療效優(yōu)勢(shì)、臨床安全性相似，對(duì)國內(nèi)卒中治療來說意義重大。

法舒地爾作為一種腦血管及周圍血管擴(kuò)張藥物，主要藥理作用是擴(kuò)張血管，抵抗血管痙攣，改善腦組織的微循環(huán)；減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)[25-26]。曲札茋苷屬二苯乙烯類化合物，結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，文獻(xiàn)報(bào)道該類化合物具有多種藥理活性，對(duì)心腦血管具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制包括抗氧化活性[27]、抗炎[28]、抗細(xì)胞凋亡[29]等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，曲札茋苷低劑量(3.35 mg/kg)組、法舒地爾低劑量(7.5 mg/kg)組對(duì)雙側(cè)頸總結(jié)扎小鼠的存活時(shí)間，缺血再灌注小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積無改善作用(P>0.05)。曲札茋苷高劑量(6.7 mg/kg)組、法舒地爾高劑量(15 mg/kg)組均能改善小鼠存活時(shí)間及腦梗體積(P<0.05或P<0.01)，也說明改善循環(huán)或是神經(jīng)保護(hù)都發(fā)揮了腦保護(hù)作用。兩藥低劑量聯(lián)用(3.35 mg/kg +7.5 mg/kg)能顯著延長(zhǎng)存活時(shí)間、降低腦梗死體積與神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，降低TNF-α、IL-1β、IL-6與MDA含量，升高SOD活力(P<0.05或P<0.01)。與兩藥低劑量單用組比較，高劑量單用組對(duì)存活時(shí)間、腦梗死體積的保護(hù)作用沒有顯示出差異(P>0.05)，而低劑量聯(lián)用組表現(xiàn)出差異(P<0.05或P<0.01)。表明通過改善循環(huán)或神經(jīng)保護(hù)對(duì)腦梗的保護(hù)作用有限，聯(lián)合用藥可使曲札茋苷與法舒地爾在改善循環(huán)及神經(jīng)保護(hù)方面發(fā)揮協(xié)同作用，從而進(jìn)一步改善腦梗，這一結(jié)果也為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。