鄧夢夢，許夕雅，丁晨夢，郭子儀，陳 陸

（河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450046）

皰疹病毒（Herpesvirus）是一類有囊膜結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA 病毒，分為α、β、γ 三大亞科，病毒復制周期短、感染速度快，具有能夠引起細胞裂解性感染、能在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染，導致機體感染耐受后終身帶毒的特性[1]。機體感染皰疹病毒后可誘導T細胞介導的全身性免疫應答，并協(xié)同細胞因子對抗原直接殺傷，此外特異性CD8+T 細胞被選擇性保留于受感染的神經(jīng)節(jié)組織中，建立免疫監(jiān)視以減少其再激活。而皰疹病毒在長期進化過程中也建立起相應的免疫逃逸機制，潛伏期病毒經(jīng)外界因素刺激再激活后，可誘導駐留于神經(jīng)節(jié)內(nèi)的特異性CD8+T 細胞中的抑制性受體PD-1 和LAG-3 高效表達，導致抗病毒的CD8+T 細胞功能衰竭，使之喪失效應功能、增殖潛力以及分化為免疫記憶細胞的能力，從而逃避宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)[2]。

機體在對抗病原侵入啟動免疫應答后，大部分效應T 細胞凋亡，只有少數(shù)細胞形成記憶T 細胞。基于歸巢分子的表達將記憶T 細胞分成3 個亞群：表達歸巢受體血管L-選擇素（CD62L）和趨化因子受體CCR7 的記憶T 細胞，被稱為中樞記憶T 細胞（Centralmemory T cells，TCM），主要循環(huán)于外周血和淋巴器官之間，當再次受抗原刺激時可迅速分裂增殖和分化，發(fā)揮免疫應答作用；第2 個亞群缺乏淋巴歸巢分子，低表達或不表達CD62L 和CCR7，但表達較高水平的整聯(lián)蛋白和趨化因子受體，從而實現(xiàn)在血液和非淋巴組織之間的循環(huán)，使記憶T 細胞遷移至外周炎癥組織發(fā)生速發(fā)性效應功能，這些細胞被稱為效應記憶T 細胞（Effector memory T cells，TEM）[3]；而第3 個記憶T 細胞亞群不表達CD62L 和CCR7，高表達黏附和遷移分子CD69 和CD103，該類T 細胞不通過血液或淋巴循環(huán)，而長期停留于機體受感染部位，被稱為組織駐留記憶T 細胞（Tissue-resident memory T Cell，TRM）[4]。TRM 具有在外周組織中長期存活和低遷移駐留的特性，其主要作用是“發(fā)出警報”和延遲病原體傳播，可在病毒感染部位迅速識別抗原，募集免疫細胞，建立抗病毒狀態(tài)，在皰疹病毒潛伏期再激活至復發(fā)感染中提供快速的免疫保護作用[5]。因此，TRM 有望作為復發(fā)性皰疹病毒免疫治療的潛在靶點，為清除潛伏期病毒粒子、控制復發(fā)感染提供新思路，本文就TRM 參與皰疹病毒復發(fā)性感染的研究進展做一綜述。

1 TRM 與免疫應答

當相同病原體再次侵入后，機體內(nèi)TCM 可迅速被激活增殖并分化產(chǎn)生TEM，這些細胞可以在幾小時至幾天內(nèi)經(jīng)血液循環(huán)遷移至受感染的組織內(nèi)，從而達到清除病原體的作用。但事實上研究表明，機體在初次感染痊愈后，隨時間推移存在于體內(nèi)的TCM、TEM 的作用會減弱，當再次感染時因其免疫監(jiān)視能力下降會導致病原體傳播而增加疾病復發(fā)的幾率[6]。

TRM 在非淋巴組織中的主要作用是“發(fā)出警報”和延遲病原體傳播。外周組織中的TRM 具有檢測受感染細胞的能力，可以在其他記憶T 細胞之前更快識別抗原，產(chǎn)生IFN-γ，增強局部炎癥趨化因子的表達，還可誘導尚未受到抗原刺激的循環(huán)于外周的CD8+T 細胞快速、大量地聚集到受感染部位，其隨后產(chǎn)生次級效應T 細胞控制復發(fā)性感染，而該受感染部位在此之前并未受到循環(huán)記憶T 細胞的常規(guī)免疫監(jiān)視[7]。且研究證明TRM 識別抗原后，早期細胞因子誘導血管內(nèi)皮細胞中粘附分子VCAM1 的表達增加，可刺激自然殺傷細胞、樹突狀細胞的增殖，并向黏膜組織募集B 細胞，啟動免疫應答，清除受感染的細胞以及病毒粒子[8]。

2 TRM在外周組織中的長期駐留特性

外周組織中持續(xù)存在的TRM 不會在體內(nèi)循環(huán)，但它們保留了在環(huán)境限制下低遷移的能力。TRM 可形成一種受約束的遷移模式，以促進它們在感染部位長期持久性地存在，該特性可增強TRM 對復發(fā)性感染局部組織的免疫監(jiān)視能力[9]。

一方面，TRM 表面的CD69 可結(jié)合到1-磷酸鞘氨酸受體1（S1PR1）的跨膜區(qū)域并促進其降解，從而阻止T 細胞識別1-磷酸鞘氨醇（S1P）梯度的變化，因在人類和小鼠體內(nèi)S1P 呈梯度分布，由低到高依次為周圍組織、淋巴結(jié)和血液，使得TRM 能夠長期停留在組織中[10]；另一方面，TRM 分泌的細胞因子白細胞介素33（IL-33)、腫瘤壞死因子（TNF）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）可下調(diào)Kruppel 樣因子2（KLF2）的表達，進而導致KLF2 靶基因S1PR1的表達減少，導致TRM 持續(xù)性滯留于組織內(nèi)[11]；此外TGF-β 還可調(diào)節(jié)CD8+T 細胞中轉(zhuǎn)錄因子T-bet 的表達，且T-bet 以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)CD103 表達[12]。而整合素CD103 是TRM 關鍵的生物學標志物，通過與其配體E-鈣粘蛋白結(jié)合，使抗原特異性T 淋巴細胞駐留于上皮組織，增強免疫監(jiān)視作用[13]。趨化因子受體CCR7 是記憶T 細胞從外周組織外遷至循環(huán)體系所必需的，皮膚組織中缺乏CCR7 的T 細胞可增強其向TRM 表型轉(zhuǎn)變，并定居于組織內(nèi)[14]。與效應T 細胞相比，TRM 還可表達較高水平的B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）促進其在組織內(nèi)的長期持續(xù)存在[15]。

3 TRM 參與皰疹病毒復發(fā)性感染的免疫治療

3.1 TRM 在皰疹病毒復發(fā)性感染過程中的免疫保護特性及機制 皰疹病毒感染機體后可侵入神經(jīng)系統(tǒng)，跨突觸在神經(jīng)元間傳播，沿著神經(jīng)軸索逆行運輸?shù)缴窠?jīng)元胞體建立潛伏感染。處于潛伏期的皰疹病毒基因組不復制，也不表達病毒蛋白，僅大量轉(zhuǎn)錄病毒潛伏相關轉(zhuǎn)錄本（Latency-associated transcripts，LAT），機體不產(chǎn)生感染性病毒粒子，不表現(xiàn)出任何臨床癥狀[16]。處于潛伏狀態(tài)的病毒抑制感染細胞自噬及宿主的抗病毒作用以逃避宿主的免疫監(jiān)視。當機體免疫水平降低或處于應激狀態(tài)時，保持休眠狀態(tài)的病毒被重新激活，病毒裂解基因大量表達，從而引起復發(fā)性感染。

TRM 在皰疹病毒由潛伏感染再激活至復發(fā)感染中提供快速的免疫保護作用。三叉神經(jīng)節(jié)作為免疫細胞儲存、活化場所，神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏狀態(tài)的單純皰疹病毒1 型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）再激活受到特異性CD8+T細胞的影響，在HSV-1潛伏期CD8+T細胞可滲入至神經(jīng)節(jié)發(fā)育分化成TRM 群體，具有免疫保護作用，抑制病毒粒子的復制、脫落、再激活與復發(fā)性感染[17]。此外TRM 可識別HSV-1 蛋白ICP6和VP16，其介導的顆粒酶B 可降解HSV-1 早期蛋白ICP4，從而抑制HSV-1 的再激活所致的復發(fā)感染[18]。

單純皰疹病毒2型（Herpes simplex virus 2，HSV-2）感染機體痊愈后，機體生殖器組織內(nèi)TRM 分布不均勻，當相同抗原再次刺激時，組織內(nèi)高水平的TRM保留著識別抗原的能力，并以接觸依賴的方式清除鄰近被感染的細胞，還可分泌細胞因子IFN-γ 和顆粒酶B，細胞因子一方面發(fā)揮免疫應答效應，另一方面可激活組織內(nèi)低水平的TRM 并分泌增加進而發(fā)揮抗病毒作用[19]。此外CD301b 樹突狀細胞表面主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）I 類分子的表達有助于激活機體生殖道內(nèi)CD8+TRM，CD1c+樹突狀細胞通過TGF-β 信號啟動表達CD8+CD103+CD69+TRM，從而降低HSV-2 對機體的復發(fā)性感染[20]。

巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）原發(fā)感染后可在某些特定的CD14+單核細胞、CD34+造血干細胞亞群及其發(fā)育分化的髓系細胞中建立潛伏感染而終身存在[21]。CMV 特異性效應T 細胞可隨時間積累駐留于組織內(nèi)，這些特異性T 細胞具有細胞毒性，在抗原刺激下可快速產(chǎn)生IFN-γ 和TNF-α，發(fā)揮免疫應答效應[22]。此外，小鼠巨細胞病毒（Mouse cytomegalovirus，MCMV）在急性感染至潛伏狀態(tài)的過程中，駐留在感染小鼠唾液腺和肺組織內(nèi)的CD8+T 細胞介導著強大的適應性免疫反應[23]。而人巨細胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）急性感染小鼠后，將特異性T 細胞過繼轉(zhuǎn)移至受感染小鼠體內(nèi)，可降低HCMV 對小鼠腦組織的損傷，并持續(xù)存在于大腦內(nèi)形成TRM，控制HCMV 再激活所致的復發(fā)感染[24]。

3.2 TRM 對復發(fā)性皰疹病毒的免疫治療特性 機體經(jīng)皰疹病毒潛伏感染后，可限制外周循環(huán)記憶T細胞和先天性免疫應答細胞進入潛伏感染部位，而主要依賴于駐留在病毒侵入部位的TRM 對再次感染做出快速反應[25]。此外，TRM 可以在無局部抗原遞呈的情況下增殖與存活，被稱為是抵抗復發(fā)性感染的第一道防線。因此，可利用TRM 的該特性作為治療復發(fā)性皰疹的策略之一，為清除潛伏感染病毒粒子提供新思路。

3.2.1 通過局部免疫途徑誘導TRM 的免疫治療作用已有報道證實局部免疫可優(yōu)先誘導T 細胞介導的全身性免疫應答，例如在使用HSV-1TK 減毒活疫苗進行局部免疫后可誘導激活靠近初始接種部位的TRM快速反應，增強對后續(xù)HSV-1 皮膚感染的保護作用[11]。而HSV-2TK 減毒活疫苗經(jīng)鼻腔免疫后可誘導趨化因子CCL5 表達的顯著增強，該趨化因子是鼻腔免疫后的抗原特異性效應細胞遷移至陰道并滯留所必需的，以提供抵抗HSV-2 感染的免疫保護[26]。同樣Srivastava 等利用HSV-2 UL40 基因編碼的核糖核苷酸還原酶2（RR2）病毒蛋白制備HSV-2 亞單位疫苗，并對HSV-2 急性感染的豚鼠進行治療性粘膜接種后，可在生殖道黏膜組織愈合部位檢測到較高水平的CD4+TRM 和CD8+TRM，使得發(fā)病率顯著降低；隨后用該疫苗接種潛伏感染HSV-2 的豚鼠，在其生殖道黏膜組織檢測到高水平的IFN-γ 和低水平的PD-1、TIM-3，其中PD-1、TIM-3 介導TRM 功能的衰竭，其表達量降低可減少功能衰竭TRM 的數(shù)量，IFN-γ可誘導TRM 增殖，進而增強其對潛伏感染病毒粒子的清除作用[27]。

3.2.2 利用疫苗載體增強TRM 的免疫治療作用 局部免疫雖然能夠迅速產(chǎn)生T 細胞免疫應答反應，但該接種途徑可能會在局部神經(jīng)節(jié)建立潛伏感染而存在潛在的安全問題，后期研究則在此免疫策略基礎上使用疫苗載體以增強特異性組織駐留CD8+T 細胞增殖及其對局部抗原的免疫應答反應來提高疫苗免疫效力。

Cuburu 等以人乳頭瘤病毒（HPV）為載體插入HSV-2 糖蛋白gB 和gD 制備的疫苗通過陰道黏膜接種小鼠，可誘導其陰道內(nèi)HSV-2 特異性CD8+TRM 的激活與增殖，并分泌IFN-γ 和TNF-α，建立對HSV-2的免疫保護機制[28]。MCMV 慢性感染可增強機體CD8+記憶T 細胞增殖，并在粘膜組織中積累病毒特異性CD4+和CD8+T 細胞，因此巨細胞病毒可作為一種理想的疫苗載體，誘導機體產(chǎn)生相應的效應T 細胞預防疾病發(fā)生[29]。Morabito 等以MCMV 為載體插入呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）基質(zhì)蛋白M，制備疫苗MCMV-M 并經(jīng)鼻腔免疫后，機體肺組織內(nèi)可產(chǎn)生持久的組織駐留CD8+記憶T 細胞亞群，當RSV 侵入機體時可迅速介導抗病毒免疫保護作用，降低感染率[30]。而外源性IL-33 可促進MCMV 特異性CD8+記憶T 細胞增殖和CD69+TRM 的積累，將其作為以復制缺陷型MCMV 為載體制備弱毒疫苗的佐劑，進一步提高疫苗的免疫效力[31]。

3.2.3 通過趨化因子誘導TRM 的免疫治療作用 已有研究證明，趨化因子一方面可誘導機體產(chǎn)生效應T細胞，另一方面可將外周循環(huán)的效應T 細胞遷移至受感染部分起到免疫應答作用[32]。HSV-2 感染機體后，CD4+T 細胞分泌的IFN-γ 誘導CXCL9 和CXCL10表達，并通過CXCR3 介導效應CD8+T 細胞向感染組織聚集[33]。同樣，趨化因子CXCL10、CXCL9、CXCR3 和CCL5 可誘導HSV-1 潛伏感染部位產(chǎn)生高水平的CD8+TRM，降低其復發(fā)性感染[34]。

基于趨化因子的上述特性，Shin 等設計了一種能夠建立TRM 細胞群體的疫苗策略，在不引起局部炎癥或感染的情況下將趨化因子CXCL9 和CXCL10注射至免疫小鼠的生殖道，誘導HSV-2 特異性T 細胞定殖在陰道粘膜進而形成TRM 細胞群。隨后用致死劑量的HSV-2 攻擊小鼠，采用這種疫苗免疫策略的小鼠的存活率達到100%[35]。在HSV-1 治療性疫苗中也有類似的免疫策略，該策略利用HSV-1 CD8+T細胞表位的UL9196-204、UL25572-580和UL44400-408制備的疫苗對潛伏感染的小鼠進行特異性免疫，免疫兩周后將小鼠暴露于紫外線下以激活潛伏感染，兩天后局部注射趨化因子CXCL10 對其進行治療，這種免疫治療方式顯著增加了潛伏感染HSV-1 的小鼠三叉神經(jīng)節(jié)功能性抗病毒CD8+TRM 的數(shù)量，并增強了其對紫外線誘導的HSV-1 再激活所致復發(fā)性皰疹疾病的抵抗作用[18]。

3.2.4 利用特異性CD8+T 細胞及其抑制性受體誘導TRM 的免疫治療作用 機體在抵抗病毒侵入過程中，皰疹病毒在長期進化中也建立起相應的免疫逃逸機制，潛伏期病毒經(jīng)外界因素刺激再激活后，可誘導駐留于神經(jīng)節(jié)內(nèi)的特異性CD8+T 細胞抑制性受體PD-1 和LAG-3 高效表達，導致抗病毒CD8+T 細胞功能衰竭，使之喪失效應功能、增殖潛力以及分化為免疫記憶細胞的能力，從而逃避宿主免疫監(jiān)視系統(tǒng)[36]。因此，增加特異性CD8+T 細胞數(shù)量、增強其細胞功能成為制備皰疹病毒治療性疫苗又一創(chuàng)新性策略。

Brizi? 等利用單克隆Ly5.1+（CD45.1+）TCR 轉(zhuǎn)基因CD8+T 細胞，即對MCMV 免疫顯性表位M38316-323具有特異性的CD8+T 細胞（又稱為Maxi CD8+T 細胞），在新生小鼠感染MCMV 6 d 后，將其過繼轉(zhuǎn)移至受感染小鼠體內(nèi)，可在小鼠大腦和脾臟中檢測到Maxi CD8+T 細胞，并有效控制MCMV 感染，減少MCMV 對小鼠大腦的損傷程度，并可持續(xù)分化成TRM 細胞群，防止復發(fā)性感染[24]。Roy 等將小鼠腹腔注射LAG-3 單克隆抗體，阻斷LAG-3 與其配體結(jié)合，對潛伏感染小鼠進行治療性免疫，可顯著增加駐留于組織內(nèi)的HSV 特異性CD8+T 細胞的數(shù)量，逆轉(zhuǎn)小鼠角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中T 細胞的功能耗竭，并分泌細胞因子IFN-γ，提高其細胞毒性潛力，從而降低角膜皰疹病毒復發(fā)性感染的概率[37]。而聯(lián)合阻斷PD-1 和LAG-3 在增加HSV 功能性抗病毒TRM 數(shù)量上起協(xié)同作用[38]。

已有研究證明阻斷T 細胞抑制性受體CTLA-4 和PD-1 在治療慢性艾滋病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染及其他慢性病方面具有重要意義[39-41]，皰疹病毒作為潛伏感染的慢性病毒也可將T 細胞抑制性受體PD-1 和LAG-3 作為治療復發(fā)性皰疹病毒的潛在靶點。

4 小結(jié)與展望

TRM 長期定居于病原體的侵入部位，當相同抗原再次刺激時，可快速提供強大的免疫保護作用。在皰疹病毒復發(fā)性感染過程中，TRM 會優(yōu)先被激活增殖并將效應T 細胞募集到受感染的組織起到抗病毒作用。針對TRM 在皰疹病毒潛伏感染過程中的免疫學特性，越來越多的研究者將TRM 作為皰疹病毒治療性疫苗的潛在靶點，旨在建立TRM 群體、提高對病原保護效力的疫苗策略。

疫苗接種后TRM 是否可提高對某些病原體的保護效力，其檢測指標不僅包括中和抗體水平，更重要的是TRM 水平及其免疫原性的評價。因TRM 駐留于組織內(nèi)，不在外周血中循環(huán)，在利用ELISPOT 和流式細胞術(shù)等方法分析其抗原特異性之前，需從組織內(nèi)分離、體外培養(yǎng)足夠數(shù)量的TRM，但TRM 亞群分離效率低，且分離后的細胞很快會失去活性，不易存活，此外針對疫苗接種方案、免疫刺激信號如何優(yōu)先建立TRM 系統(tǒng)等方面還需進一步探索，為后繼研究帶來巨大挑戰(zhàn)，因此針對TRM 仍有很大研究空間。