高帆， 馮貝貝， 宋聰豪， 連曉東， 鄭先波， 張海朋， 王小貝， 譚彬， 馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

桃(Prunuspersica)屬于薔薇科李屬桃亞屬，起源于中國西北地區(qū)，種質(zhì)資源豐富。桃在亞洲，尤其是在中國，不僅是重要的果樹作物，也是一種重要的觀花樹種[1]。很多地方通過舉辦“桃花節(jié)”等也帶動了當(dāng)?shù)氐谌a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

栽培桃花型分為鈴型(non-showy，SH)和薔薇型(showy，sh)2種類型。薔薇型花朵大、花冠大，色彩鮮艷，易吸引蜜蜂和其他昆蟲，有利于傳粉。馬瑞娟等[2]對507個栽培桃資源花型進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)鈴型花資源79個，占15.6%，薔薇型花資源428個，占84.4%，說明栽培桃品種以薔薇型花為主。桃花型性狀受一對等位基因控制(SH/sh)，其中鈴型(SH)對薔薇型(sh)為顯性[3]。CHAPARRO等[4]通過9個F2分離群體對桃花型性狀的遺傳規(guī)律進(jìn)行分析，F(xiàn)2后代中鈴型花與薔薇型花的分離比為3∶1，符合孟德爾遺傳規(guī)律，為質(zhì)量性狀。FAN等[5]將該性狀作為一個形態(tài)學(xué)標(biāo)記鎖定在桃第8號連鎖群上，位于標(biāo)記CPPT006與PacC13之間。MICHELETTI等[6]對1 580份桃種質(zhì)資源進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)位于第8號連鎖群上有18個SNP標(biāo)記與花型性狀緊密相關(guān)，范圍為4.3 Mb。隨后CAO等[7]利用GWAS分析發(fā)現(xiàn)位于第8號連鎖群13 740 117 bp處存在一個與花型性狀關(guān)聯(lián)度較高的SNP位點(diǎn)。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)桃生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基于重測序數(shù)據(jù)對‘黃水蜜’(sh)和‘中油桃14號’(SH)F1雜交群體后代進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)位于8號染色體上的PpB3-1基因啟動子區(qū)域的1個SNP關(guān)聯(lián)度最高，并通過測序發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)與花型性狀共分離，且PpB3-1基因在不同花型的花瓣中差異表達(dá)，將PpB3-1基因確定為桃花型性狀候選基因[8]。

衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性(derived cleaved amplified polymorphic sequence，dCAPs)標(biāo)記是針對酶切擴(kuò)增多態(tài)性(cleaved amplified polymorphic sequence，CAPs)標(biāo)記的一種改良法[9]，CAPs標(biāo)記檢測限制于突變位點(diǎn)發(fā)生在限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)上，而實(shí)際上有很大一部分突變位點(diǎn)并非發(fā)生在酶切識別位點(diǎn)處。通過在突變位點(diǎn)附近引入錯配堿基而衍生出dCAPs標(biāo)記，該標(biāo)記具有共顯性、位點(diǎn)特異、操作簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，在品種分類和分子標(biāo)記輔助育種中得到了廣泛的應(yīng)用。如基于小麥AL型三系雜交小麥雄性不育性狀開發(fā)的dCAPs標(biāo)記，可以檢測含有不育基因的材料[10]?；谇压ぶ饷粜曰蚝蜻x區(qū)段內(nèi)SNP設(shè)計(jì)開發(fā)dCAPs-9標(biāo)記表現(xiàn)較高的特異性，雜交群體和自然群體的準(zhǔn)確度分別達(dá)到了98.4%和91.9%[11]。

本研究依托河南農(nóng)業(yè)大學(xué)桃生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期成果，對已獲得的控制桃花型性狀PpB-1基因的差異SNP位點(diǎn)開發(fā)相應(yīng)的dCAPs標(biāo)記，在桃雜交群體和自然群體中進(jìn)行鑒定，分析了桃花型性狀dCAPs標(biāo)記與桃花型的相關(guān)性，為針對花型性狀的分子標(biāo)記早期輔助選擇及提高選擇效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用112份桃自然群體試驗(yàn)材料來源于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所。構(gòu)建雜交群體所使用的母本‘黃水蜜’(sh)、父本‘中油桃14號’(SH)和73株F1雜種單株均保存于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)三區(qū)桃種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用一步法植物基因組DNA提取試劑盒(購于北京諾貝萊生物科技有限公司)提取桃葉片基因組DNA，具體步驟如下：取80～100 mg桃葉片在液氮中充分研磨，倒入裝有600 μL Buffer ATS 的離心管中混勻，加入10 μL RNase A(25 mg·mL-1)震蕩混勻，靜置10 min，其間顛倒混勻3次，12 000 r·min-1離心3 min；取500 μL上清液，并加入250 μL異丙醇，充分混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱(spin columns AC)中，12 000 r·min-1離心1 min，棄廢液；向吸附柱AC中加入600 μL Buffer WB進(jìn)行洗脫，12 000 r·min-1離心1 min，倒掉廢液，重復(fù)洗脫1次；將吸附柱AC放回空收集管，12 000 r·min-1離心2 min，將吸附柱AC放入新離心管，向吸附膜中央懸空滴加60 μL Buffer EB，室溫放置5 min，12 000 r·min-1離心1 min，收集DNA溶液。-20 ℃保存DNA。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA樣品的完整性進(jìn)行檢測，使用NanoDrop 2000C spectrophotometer(Thermo Scientific)檢測DNA的質(zhì)量濃度，將DNA樣品稀釋到50～100 mg·L-1待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)‘中油桃14號’基因組序列(http://www.stylebio.cn/)，下載PpB3-1(Pp08G015510)基因上游包含SNP位點(diǎn)的啟動子序列(500 bp)，設(shè)計(jì)SNP位點(diǎn)的正向引物為SNP-SH-F：5’-TTCTTTATCATCTCTCGGAATCAGT-3’，反向引物為SNP-SH-R：5’-CGTTTGTCGGGAGGGGG-3’。根據(jù)SNP位點(diǎn)處的基因序列，利用在線軟件dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dCAPs/dCAPs.html)設(shè)計(jì)上游引物，Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)下游引物，送至鄭州尚亞國際貿(mào)易有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 PCR 反應(yīng)采用50 μL的擴(kuò)增反應(yīng)體系：25 μL 2×Taq Master Mix(購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，2.5 μL正向引物，2.5 μL反向引物(正、反向引物濃度為10 μmol·L-1)，2.5 μL DNA模板，17.5 μL ddH2O。具體反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。使用微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒(購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

1.2.4 酶切體系及酶切產(chǎn)物檢測 采用25 μL的酶切反應(yīng)體系：2.5 μL CutSmart，0.5 μLSalI-HF限制性內(nèi)切酶，1 μg PCR純化產(chǎn)物，補(bǔ)足ddH2O至25 μL(SalI-HF限制性內(nèi)切酶購于NEB公司)。采用水浴的方式進(jìn)行酶切，37 ℃酶切5 h。對酶切產(chǎn)物稀釋1倍后使用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方式進(jìn)行檢測[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃花型性狀PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記的開發(fā)及驗(yàn)證

桃PpB3-1基因的SNP位點(diǎn)處A/C等位基因的變異導(dǎo)致桃花型的改變，基因型A/C和C/C為鈴型花(圖1-A)，基因型A/A為薔薇型花(圖1-B)。由于PpB3-1基因SNP位點(diǎn)沒有位于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，根據(jù)SNP位點(diǎn)處堿基的差異，在特異性擴(kuò)增引物F端引入可以使用SalI-HF限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切的錯配堿基G，得到用于dCAPs標(biāo)記PpB3-1標(biāo)記開發(fā)的正向引物為B3-1-F：5’-ATATACGTGTACAATAGATAGTCGA-3’，反向引物為B3-1-R：5’-ATACTTTCCTATGATCGTAGTTTCT-3’(圖1-C)。

藍(lán)色字母C,A表示SNP位點(diǎn)；紅色字母G表示錯配堿基。

對10份已知花表型的桃種質(zhì)資源PpB3-1基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行測序，PpB3-1基因SNP位點(diǎn)出現(xiàn)3種變異類型(表1，圖2-A)。使用PpB3-1基因開發(fā)的dCAPs標(biāo)記對這10份桃種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到308 bp的PCR產(chǎn)物(圖2-B)。理論上，薔薇型花(基因型，A/A)DNA擴(kuò)增出來的條帶無酶切位點(diǎn)，不能被切開，條帶長度為 308 bp；鈴型花(基因型，A/C，C/C)DNA擴(kuò)增出來的條帶有酶切位點(diǎn)，可被SalI-HF限制性內(nèi)切酶切成26 和282 bp。對dCAPs標(biāo)記驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖2-C)，共產(chǎn)生3種類型條帶：308、282+308和282 bp，而26 bp的條帶較小在膠上不可見。上述結(jié)果與這10份桃種質(zhì)資源花型的田間調(diào)查和SNP測序結(jié)果一致(表1)，表明基于PpB3-1基因開發(fā)的dCAPs標(biāo)記可準(zhǔn)確地鑒定出10份桃種質(zhì)資源的花型。

M：DNA Marker；1：春美；2：秋蜜紅；3：松森；4：中油蟠2；5：大久保；6：黃水蜜；7：瑞光28；8：春蕾；9：乳玉；10:佩加蘇。

表1 dCAPs標(biāo)記在10個桃種質(zhì)資源中的驗(yàn)證Table 1 Validation of dCAPs markers in 10 peach germplasms

2.2 桃花型性狀PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記在桃薔薇型/鈴型雜交群體中的應(yīng)用

對以‘黃水蜜’(薔薇型花，sh/sh)為母本，‘中油桃14號’(鈴型花，SH/sh)為父本雜交獲得的73株雜種后代，利用dCAPs標(biāo)記對桃鈴型/薔薇型雜交群體進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，所有雜種后代單株出現(xiàn)兩種特異片段類型，分別為308 bp純合片段和308 與282 bp雜合片段(圖3)，與在田間調(diào)查得到的表型和基于SNP基因分型結(jié)果一致，符合率為100%(表2)，表明桃花型性狀PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記適用于桃花型鈴型/薔薇型性狀的早期選擇。

M：DNA Marker；P1：母本；P2：父本；1，3，4～86：雜種后代。

表2 后代表型鑒定與標(biāo)記檢測結(jié)果Table 2 IdentificationofflowerphenotypeandmarkertestinF1 hybrids

2.3 桃花型性狀PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記在桃自然群體中的應(yīng)用

將開發(fā)的PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記用于102份自然群體的桃種質(zhì)資源，包含68份薔薇型材料，34份鈴型材料(表3)。PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記檢測結(jié)果如圖4所示，鈴型花DNA擴(kuò)增出來的條帶可以被酶切，產(chǎn)生2種類型特異片段：308和282 bp 2條特異片段(雜合顯性，A/C)和282 bp 1條特異片段(純合顯性，C/C)，而薔薇型花DNA擴(kuò)增出來的條帶不能被酶切，產(chǎn)生1條308 bp特異片段(純合隱性，A/A)。PpB3-1基因dCAPs標(biāo)記在102個自然群體中的檢測結(jié)果和表型結(jié)果完全一致，符合度為100%。

表3 dCAPs標(biāo)記在自然群體中的驗(yàn)證Table 3 Validation of dCAPs markers in natural populations

續(xù)表 Continuing table

續(xù)表 Continuing table

M：DNA Marker；1～102：不同桃種質(zhì)資源。

3 討論與結(jié)論

在果樹遺傳育種中，由于童期導(dǎo)致后代表型鑒定存在周期長、占用土地資源與人力成本高等問題。重要性狀標(biāo)記開發(fā)和基因挖掘等工作相對滯后，不能滿足雜交后代早期選擇的需求。近幾年來，桃主要性狀定位研究取得突破性進(jìn)展，特別是桃基因組測序及高質(zhì)量基因組的組裝，加速了目標(biāo)性狀基因的定位[8,13-16]，進(jìn)而為分子標(biāo)記開發(fā)，實(shí)現(xiàn)早期、準(zhǔn)確的基因型鑒定和表型預(yù)測提供了重要的理論依據(jù)和基礎(chǔ)[17]。

桃樹型相關(guān)矮化[18-19]、分枝角度[20]，與果實(shí)相關(guān)的果實(shí)形狀[13]、茸毛有無[21]、核黏離性[22]、果肉質(zhì)地[22]、果實(shí)顏色[23]及果實(shí)酸與非酸等性狀關(guān)鍵基因均被定位，基于定位基因開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)對表型的分子鑒定。馮建燦等[24]利用控制茸毛性狀PpeMYB25基因變異信息開發(fā)的IndelG標(biāo)記對107份桃種質(zhì)資源茸毛性狀基因型進(jìn)行了鑒定,符合度為100%；魯振華等[25]對控制桃果肉顏色(白/黃)性狀基因CCD4(carotenoid cleavage dioxygenases 4)的3種等位基因進(jìn)行相應(yīng)的Indel、SSR和SNP標(biāo)記開發(fā)，對122份桃種質(zhì)資源進(jìn)行了基因分型，為種質(zhì)材料基因型鑒定和黃肉桃品種選育奠定了基礎(chǔ)。

LIAN等[8]前期定位到控制桃花型(鈴型/薔薇型)性狀關(guān)鍵基因PpB3-1，位于PpB3-1基因啟動子區(qū)域的SNP位點(diǎn)與花型性狀緊密連鎖，為后續(xù)開發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記提供了理論基礎(chǔ)[8]。SNP標(biāo)記具有穩(wěn)定性、廣泛性和代表性，已經(jīng)成為目前研究最多的分子標(biāo)記，但由于其檢測成本較高限制了其應(yīng)用。而基于SNP位點(diǎn)開發(fā)的CAPs或dCAPs標(biāo)記，具有共顯性、低成本等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于分子標(biāo)記輔助育種中。CAPs或dCAPs標(biāo)記不需要大型特殊的儀器設(shè)備[26]，僅需少量樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖電泳檢測，且對樣品DNA的質(zhì)量濃度要求不嚴(yán)格[27]。與CAPs標(biāo)記不同，dCAPs標(biāo)記設(shè)計(jì)引物時在突變位點(diǎn)附近引入錯配堿基，引物在擴(kuò)增期間將錯配堿基帶入靶序列并與鑒定的突變位點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)[28]，可用于檢測突變位點(diǎn)處不含限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的情況[29]。利用番茄粉色和紅色果實(shí)高度相關(guān)的SNP位點(diǎn)開發(fā)的dCAPs標(biāo)記，在后代群體中驗(yàn)證番茄果實(shí)顏色符合率達(dá)到95%以上[30]；利用水稻耐冷基因COLD1中的SNP位點(diǎn)開發(fā)的分子標(biāo)記，能準(zhǔn)確鑒定粳稻、秈稻及雜合基因型[31]。本研究中，基于定位到的花型性狀關(guān)鍵基因緊密連鎖SNP位點(diǎn)開發(fā)的dCAPs標(biāo)記，不僅在雜交群體中準(zhǔn)確率100%，在自然群體的鑒定中準(zhǔn)確率也達(dá)到100%。本研究利用開發(fā)的花型性狀dCAPs標(biāo)記B3-1對102份桃種質(zhì)資源和73個雜種后代花型性狀基因型進(jìn)行鑒定，標(biāo)記檢測準(zhǔn)確率為100%，花型性狀dCAPs標(biāo)記B3-1的開發(fā)為基于花型性狀的雜交組合親本選擇選配、后代花型性狀早期鑒定、提高選擇效率和縮短育種周期奠定基礎(chǔ)。