李 茜，張文周*，郝海軍

橙皮苷磷脂復合物納米混懸劑的制備、表征及口服藥動學研究

李 茜1, 2, 3，張文周1, 2, 3*，郝海軍4

1. 鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450000 2. 河南省腫瘤精準用藥及綜合評價工程研究中心，河南 鄭州 450000 3. 河南省抗腫瘤藥物研究醫(yī)學重點實驗室，河南 鄭州 450000 4. 上海市中藥研究所，上海 201401

制備橙皮苷磷脂復合物（hesperidin phospholipids complex，HD-PC）納米混懸劑（HD-PC nanosuspensions，HD-PC-NPs），并考察在SD大鼠體內(nèi)口服藥動學行為。將橙皮苷制備成HD-PC，以提高橙皮苷溶解度。采用納米沉淀-高壓均質(zhì)法制備HD-PC-NPs。在單因素實驗基礎上，以穩(wěn)定劑與HD-PC用量比、高壓均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)為主要影響因素，粒徑、PDI值和ζ電位的總評歸一值（OV）作為考察指標，采用Box-Behnken設計-效應面法優(yōu)化HD-PC-NPs制備工藝，并制備成凍干粉末。采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察HD-PC-NPs形態(tài)，透析袋法考察藥物釋放情況。SD大鼠分為橙皮苷混懸液組、HD-PC組和HD-PC-NPs組，HPLC法測定大鼠血漿中的橙皮苷質(zhì)量濃度，計算主要藥動學參數(shù)及相對口服吸收生物利用度。HD-PC-NPs的最處方工藝為穩(wěn)定劑與HD-PC用量比為3.2，均質(zhì)壓力95 MPa，均質(zhì)次數(shù)為10次，制備溫度為50 ℃。5%甘露醇制得的凍干粉末外觀飽滿。HD-PC-NPs呈球形或類球形，平均粒徑為（268.62±18.14）nm，PDI為0.122±0.013，ζ電位為（?31.79±1.37）mV。HD-PC-NPs將橙皮苷的溶解度提高至77.06倍，6 h累積釋放率達到94.68%。藥動學結果顯示，HD-PC-NPs達峰時間顯著性提前，半衰期（1/2）延長至（5.69±0.82）h，達峰濃度（max）提高至（1 213.96±149.88）ng/mL，相對口服生物利用度提高至3.09倍。HD-PC-NPs可提高橙皮苷溶解度，促進藥物體外溶出及體內(nèi)吸收。

橙皮苷；磷脂復合物；納米混懸劑；Box-Behnken設計-效應面法；生物利用度；納米沉淀-高壓均質(zhì)法

橙皮苷又稱柑果苷、陳皮苷，主要存在于柑桔屬L.植物中，屬于黃酮類化合物。國內(nèi)外研究[1-4]顯示，橙皮苷有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、降血壓、降血糖、提高免疫力等藥理活性。橙皮苷在水中溶解度僅為（6.32±0.12）μg/mL，橙皮苷脂溶性也很差[5]，在pH 1.2～7.4時油水分配系數(shù)波動區(qū)間為0.071～1.280，lg值多為負值[6]。容易受到體內(nèi)各種代謝酶、腸道菌群等影響[7]，口服吸收生物利用度僅為3.51%[6]。納米技術可提高藥物溶解度并促進藥物吸收[8]，目前，已有橙皮苷脂質(zhì)體、納米乳、自微乳等報道[9-11]，但存在包封率及載藥量低、使用大量表面活性劑等問題，臨床應用受到一定限制。

磷脂復合物（phospholipids complex，PC）是難溶性藥物與磷脂通過某種作用力（如氫鍵、范德華力等）結合在一起形成的一種物質(zhì)，可同時改善水溶性及脂溶性，增加吸收[12-16]。但PC的分散性及溶出度較差，可能限制生物利用度提高幅度，且黏性較大，不便于給藥[17]。納米混懸劑（nanosuspensions，NPs）是將難溶性藥物與穩(wěn)定劑通過制劑手段制得的一種“純”藥物納米制劑[18-22]，制備工藝簡單可靠。橙皮苷在乙醇等有機溶劑中溶解度很差，故本研究先將橙皮苷制備成橙皮苷磷脂復合物（helicid phospholipids complex，HD-PC）來改善其溶解度，為后續(xù)納米制劑研究奠定基礎。采用納米沉淀結合高壓均質(zhì)法將HD-PC進一步制備成HD-PC納米混懸劑（HD-PCnanosuspensions，HD-PC-NPs），并進行體內(nèi)外評價，為橙皮苷納米制劑研究提供新思路。

1 儀器、試劑及動物

AL204型電子天平，梅特勒托利多儀器公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫儀器公司；LC-MS-M1系列加熱磁力攪拌器，上海力辰儀器科技有限公司；YYJZ-2型高壓均質(zhì)機，上海永延納米科技有限公司；Bettersize 3000 Plus型粒度儀，丹東百特儀器有限公司；LGJ-10型實驗型凍干機，北京松源華興生物技術有限公司；TD-SM型臺式高速離心機，艾萊寶生物技術有限公司；JC-220B型氮吹儀，聚創(chuàng)華業(yè)儀器公司；Talos F200X S/TEM型透射電子顯微鏡（TEM），北京歐波同光學技術有限公司。

對照品橙皮苷（批號110721-202019，質(zhì)量分數(shù)為95.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111213-202015，質(zhì)量分數(shù)為98.2%），國家食品藥品檢定研究院；橙皮苷原料藥，批號20201030，質(zhì)量分數(shù)為97%，北京百靈威生物醫(yī)藥有限公司；大豆磷脂，批號C1256891，上海麥克林生化科技有限公司；聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯（TPGS），批號20191108，西安海斯夫生物有限公司；甘露醇，批號202005，嘉興南箭生物材料有限責任公司。

SD大鼠，清潔級，雌雄兼用，購自河南省動物實驗中心，許可證號為SCXK（豫）2020-0001，實驗室飼養(yǎng)至體質(zhì)量為（240±20）g。所有動物實驗遵循鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 HD-PC的制備[6]

取干燥后的橙皮苷原料藥0.5 g和大豆磷脂0.75 g置于燒杯中，加入80 mL四氫呋喃。于45 ℃水浴中磁力攪拌4 h，得澄清溶液。同溫度下減壓旋轉蒸發(fā)，即得HD-PC。

2.2 HD-PC-NPs的制備

納米沉淀-高壓均質(zhì)法制備HD-PC-NPs[18-19]。溶解度實驗顯示，HD-PC將橙皮苷在無水乙醇中溶解度由（37.16±0.19）μg/mL提高至（5.69±0.36）mg/mL，為制備HD-PC-NPs奠定基礎。取50 mg的HD-PC超聲溶于6 mL無水乙醇，得有機相；取一定量的穩(wěn)定劑溶于50 mL蒸餾水，得水相。在磁力攪拌速度為1000 r/min、溫度為50 ℃條件下將有機相緩慢滴至水相，超聲5 min后減壓旋蒸20 min。循環(huán)均質(zhì)數(shù)次，補加蒸餾水至50 mL，采用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得HD-PC-NPs混懸液。

2.3 橙皮苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Angilent SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長283 nm；流動相為乙腈-0.5%醋酸水溶液（22∶78）；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min。樣品的理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計均不低于8000。

2.3.2 HD-PC及HD-PC-NPs供試品溶液的配制 取HD-PC約10 mg置于50 mL量瓶中，加30 mL有機溶劑［乙腈-DMSO（9∶1）］超聲20 s，放置至室溫后加入流動相稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得HD-PC供試品溶液。取HD-PC-NPs混懸液1 mL置于50 mL量瓶中，加30 mL乙腈超聲20 s，放置至室溫后加入流動相稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得HD-PC-NPs供試品溶液。

2.3.3 對照品溶液的配制 精密稱取橙皮苷對照品10 mg，置于250 mL量瓶中，加入4 mL DMSO超聲溶解后乙腈稀釋至刻度，即得40 μg/mL橙皮苷對照品儲備液，密封，置于冰箱中，冷藏備用。

2.3.4 線性關系考察 取橙皮苷對照品儲備液，采用乙腈依次稀釋至10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg/mL的對照品溶液，進樣測定。以橙皮苷峰面積為縱坐標（），橙皮苷質(zhì)量濃度為橫坐標（）作線性回歸，得回歸方程＝14.296 7－0.659 2，＝0.999 8，可見橙皮苷在0.05～10.00 μg/mL具有良好的線性關系。

2.3.5 精密度試驗 取橙皮苷質(zhì)量濃度為10.00、1.00、0.05 μg/mL對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次。結果顯示橙皮苷峰面積的RSD依次為0.43%、0.19%、0.52%，可見儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取HD-PC和HD-PC-NPs混懸液供試品溶液，于0、3、6、9、18、24 h時間點進樣。結果顯示HD-PC和HD-PC-NPs的橙皮苷峰面積的RSD分別為0.81%、1.15%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 按照“2.3.2”項下所述方法平行制備6份HD-PC和HD-PC-NPs供試品溶液，分別進樣測試橙皮苷的峰面積，計算橙皮苷含量。結果顯示，HD-PC和HD-PC-NPs中橙皮苷含量的RSD分別為1.54%和0.79%，說明重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取9份約含5 mg橙皮苷的HD-PC，分成低、中、高3組，分別按80%、100%、120%的水平加入橙皮苷對照品，按“2.3.2”項下所述方法分別制備供試品溶液。進樣測定橙皮苷含量并計算回收率。結果顯示，HD-PC平均加樣回收率為101.42%，RSD為0.86%。

分別取9份體積為0.5 mL的HD-PC-NPs混懸液，分成低、中、高3組，分別按80%、100%、120%的水平加入橙皮苷對照品，按“2.3.2”同法操作制備供試品溶液后進樣測定橙皮苷含量并計算回收率。結果顯示，HD-PC-NPs平均加樣回收率依次為99.17%，RSD為1.14%，說明準確度較高。

2.4 HD-PC的復合率測定[6]

稱10 mg的HD-PC置于25 mL量瓶中，加入氯仿，過0.45 μm微孔濾膜，減壓旋轉蒸發(fā)除去氯仿，加入乙腈復溶，測定參加復合反應的橙皮苷量（1）。按“2.3.2”方法測定橙皮苷總量（0）。計算復合率（復合率＝1/0）。結果顯示，3批HD-PC的平均復合率為99.91%。

2.5 HD-PC的XRPD研究

取橙皮苷、磷脂、物理混合物（橙皮苷與磷脂比例同HD-PC）和HD-PC適量進行XRPD掃描，采用Cu-Ka靶，掃描速度為8°/min，掃描范圍（2）為8°～45°，結果見圖1。橙皮苷原料藥在8°、10.4°、10.5°、14.7°、14.9°、15.3°、15.8°等處存在特征晶型峰。橙皮苷與磷脂簡單混合制得的物理混合物XRPD圖中仍可見橙皮苷原料藥的晶型峰。而HD-PC的XRPD圖譜中未見橙皮苷晶型衍射峰，說明橙皮苷轉變?yōu)闊o定型物質(zhì)，這也證明HD-PC制備成功。

2.6 HD-PC-NPs粒徑、多分散系數(shù)（PDI）與ζ電位的測定

取HD-PC-NPs混懸液50 μL，加入5 mL蒸餾水混勻，平行制備3份。取適量于粒度分析儀上分別測定HD-PC-NPs粒徑、PDI及ζ電位。

2.7 單因素實驗

2.7.1 穩(wěn)定劑種類的考察 固定HD-PC用量為50 mg，穩(wěn)定劑與HD-PC用量比為3∶1，超聲功率為200 W，超聲時間為15 min，均質(zhì)壓力為70 mPa，均質(zhì)次數(shù)10次，分別考察不同穩(wěn)定劑對HD-PC-NPs的影響。結果見表1，采用泊洛沙姆188、PVP K30和聚山梨酯80制得的HD-PC-NPs粒徑和PDI值均遠大于TPGS（＜0.01）。PVP K30和TPGS制得的HD-PC-NPs的ζ電位絕對值較為接近，但兩者無顯著性差異，故選擇最終TPGS作為穩(wěn)定劑來制備HD-PC-NPs。

2.7.2 HD-PC與TPGS用量比例的考察 固定藥物用量50 mg，TPGS作為穩(wěn)定劑，超聲功率為200 W，超聲時間為15 min，均質(zhì)壓力70 MPa，均質(zhì)次數(shù)10次，分別考察TPGS與HD-PC不同用量比例對HD-PC-NPs的影響。結果見表2，隨著HD-PC用量的增加，HD-PC-NPs粒徑和PDI值呈先減小再增大趨勢。當TPGS與HD-PC用量比例為3∶1時粒徑相對較小，PDI值小于0.3，但ζ電位絕對值仍小于30 mV。因此，后續(xù)需要對TPGS與HD-PC用量比例進行優(yōu)化。

表1 穩(wěn)定劑種類的影響(, n = 3)

表2 穩(wěn)定劑與HD-PC用量比例的影響(, n = 3)

2.7.3 超聲功率的考察 固定藥物用量50 mg，TPGS與HD-PC用量比例為3∶1，超聲時間為15 min，均質(zhì)壓力70 MPa，均質(zhì)次數(shù)10次，分別考察不同超聲功率對HD-PC-NPs的影響。結果見表3，隨著超聲功率逐漸增加，粒徑和PDI值先減小后增大，提示超聲功率可影響粒徑大小及均一性。超聲功率過大時體系溫度較高，可能影響HD-PC穩(wěn)定性，且粒徑和PDI也開始變大，ζ電位絕對值變小。綜合HD-PC-NPs的粒徑、PDI和ζ電位絕對值，最終選擇超聲功率為250 W。

表3 超聲功率的影響(, n = 3)

2.7.4 超聲時間的考察 固定藥物用量50 mg，TPGS與HD-PC用量比例為3∶1，超聲功率為250 W，均質(zhì)壓力70 mPa，均質(zhì)次數(shù)10次，分別考察不同超聲時間對HD-PC-NPs的影響。結果見表4，隨著超聲時間的增加HD-PC-NPs粒徑逐漸變小，但過長的超聲時間反而導致粒徑變大。由于超聲時間15、20 min時HD-PC-NPs的粒徑、PDI和ζ電位絕對值無顯著性差異（＞0.05），為節(jié)約能源，故選擇超聲時間為15 min。

2.7.5 均質(zhì)壓力的篩選 固定藥物用量50 mg，TPGS與HD-PC用量比例為3∶1，超聲功率為250 W，時間為15 min，均質(zhì)次數(shù)10次，分別考察不同均質(zhì)壓力對HD-PC-NPs的影響。結果見表5，隨著均質(zhì)壓力的逐漸增加HD-PC-NPs粒徑呈先減小后增大，可能是過高的均質(zhì)壓力促使HD-PC-NPs發(fā)生融合，從而使粒徑增大。當均質(zhì)壓力達到100 mPa時PDI值仍小于0.2，說明一定的均質(zhì)壓力可使粒徑均一化程度提高，但達到140 mPa時PDI值開始增大，且ζ電位絕對值下降。可見，均質(zhì)壓力對粒徑、PDI和ζ電位影響較大，故選為主要影響因素。

表4 超聲時間的影響(, n = 3)

2.7.6 均質(zhì)次數(shù)的篩選 固定藥物用量50 mg，TPGS與HD-PC用量比例為3∶1，超聲功率為250 W，時間為15 min，均質(zhì)壓力為100 mPa，分別考察不同均質(zhì)次數(shù)對HD-PC-NPs的影響。結果見表6，增加均質(zhì)次數(shù)可使HD-PC-NPs粒徑及PDI值下降，但均質(zhì)次數(shù)過多時粒徑及PDI值有增大趨勢，且ζ電位絕對值也出現(xiàn)變小情況?？梢娋|(zhì)次數(shù)對粒徑、PDI和ζ電位影響較大，故選為主要影響因素。

2.8 Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備工藝

2.8.1 Box-Behnken試驗設計 參考“2.6”項下結果，可見TPGS與HD-PC用量比（1）、高壓均質(zhì)壓力（2）及均質(zhì)次數(shù)（3）對HD-PC-NPs各個指標影響較大，故作為主要影響因素。以HD-PC-NPs的粒徑、PDI值和ζ電位作為響應值，并將該3個指標轉換成總評歸一值（overall desirability value，OD），計算過程為①粒徑（1）、PDI值（2）和ζ電位（3）計算公式為(max－M)/(max－min)；②計算OD值，OD＝(12…d)1/k，為指標數(shù)。Box-Behnken響應面法試驗設計見表7，分別制備不同處方工藝下的HD-PC-NPs，平行3次，結果見表7。

表5 均質(zhì)壓力的影響(, n = 3)

表6 均質(zhì)次數(shù)的影響(, n = 3)

2.8.2 2次多元回歸模型的建立及顯著性分析 采用Design Expert 8.0.6軟件擬合得出OD的二次多元回歸方程為OD＝0.96＋0.111＋0.0372－0.153－2.5×10?412－0.05113－0.04623－0.4212－0.3622－0.2732。方差分析結果見表8，2＝0.984 3，模型＜0.000 1，失擬項＝0.076 0＞0.05。所以建立的模型具有極顯著性水平，擬合度良好，未知因素干擾很小，可用于HD-PC-NPs處方工藝進行優(yōu)化。另外，1、3、12、22、32是顯著或極顯著項。

2.8.3 響應面分析、優(yōu)化與預測 固定TPGS與HD-PC用量比（1）、均質(zhì)壓力（2）及均質(zhì)次數(shù)（3）3個因素之一，繪制另外2個因素對OD的三維曲面圖，結果見圖2。HD-PC-NPs的最佳處方為TPGS與HD-PC用量比為3.24∶1，均質(zhì)壓力95.29 MPa、均質(zhì)次數(shù)為10.29次，預測最佳處方的粒徑、PDI值和ζ電位絕對值分別為261.84 nm、0.117和?32.87 mV。

表7 Box-Behnken試驗設計結果(n = 3)

表8 方差分析結果

圖2 自變量與響應值的三維圖

2.9 HD-PC-NPs處方驗證

考慮到實際可操作性，調(diào)整TPGS與HD-PC用量比為3.2，均質(zhì)壓力95 mPa，均質(zhì)次數(shù)為10次。平行制備3份HD-PC-NPs，分別測定粒徑、PDI值和ζ電位，并計算偏差［偏差＝(模型預測值－實際值)/模型預測值］。結果見表9，HD-PC-NPs粒徑、PDI值和ζ電位的相對偏差均小于±5%，說明該數(shù)學模型具有良好的預測性和重現(xiàn)性。HD-PC-NPs的粒徑及ζ電位圖分別見圖3。

2.10 HD-PC-NPs的TEM分析

取0.1 mL的HD-PC-NPs混懸液樣品，用蒸餾水按照1∶40比例稀釋，混勻后滴在銅網(wǎng)上，1.5%磷鎢酸鈉染色，自然晾干后置于TEM下觀察HD-PC-NPs外貌（×15 000），結果見圖4，所得HD-PC-NPs大體呈類球形或球形，粒子之間無粘連。

表9 實際值與預測值的比較(, n = 3)

圖3 HD-PC-NPs的粒徑分布(A)和ζ電位(B)圖

2.11 HD-PC-NPs凍干粉研究

2.11.1 凍干保護劑種類及用量篩選 為增加HD-PC-NPs混懸液穩(wěn)定性、便于儲存及給藥，故將其制備成凍干粉。取HD-PC-NPs混懸液，加入凍干保護劑，震蕩混勻，于?65 ℃超低溫冰箱中預凍24 h，迅速置于?25 ℃冷凍干燥機中凍干。以凍干粉外觀、粒徑及其PDI值進行評價，結果見表10，采用5%或7%甘露醇作為凍干保護劑時，凍干粉外觀飽滿，色澤均一，且粒徑及PDI值變化相對較小。由于采用5%甘露醇時輔料用量相對較少，故選之作為HD-PC-NPs的凍干保護劑（外觀見圖5）。另測得HD-PC-NPs凍干粉中含橙皮苷的質(zhì)量分數(shù)為（0.77±0.01）%。

圖4 HD-PC-NPs的TEM圖

表10 凍干保護劑種類及用量的考察(, n = 3)

2.11.2 凍干粉穩(wěn)定性考察 取HD-PC-NPs凍干粉置于溫度為40 ℃，濕度為65%恒溫恒濕箱中，第6個月取適量凍干粉蒸餾水復溶后測得粒徑為（284.53±24.09）nm，PDI值為0.243±0.029。HD-PC-NPs混懸液在相同條件下放置1個月即出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，所以制備成凍干粉后可增加HD-PC-NPs的穩(wěn)定性。

圖5 HD-PC-NPs外觀

2.12 HD-PC-NPs凍干粉的XRPD研究

取橙皮苷原料藥、空白輔料（除不加橙皮苷外，其他輔料比例同HD-PC-NPs凍干粉）、物理混合物（橙皮苷與輔料比例同HD-PC-NPs凍干粉）和HD-PC-NPs凍干粉適量，按“2.5”項下條件分別進行XRPD掃描，結果見圖6。物理混合物的XRPD圖譜中仍可觀察到橙皮苷原料藥在8.0°、10.4°、10.5°、14.7°、14.9°、15.3°、15.8°等處的特征晶型峰。但在HD-PC-NPs凍干粉XRPD圖譜中橙皮苷的特征晶型峰完全消失，僅可觀察到輔料的XRPD圖譜，證明橙皮苷存在狀態(tài)發(fā)生了改變，轉變?yōu)闊o定型物質(zhì)。

圖6 HD-PC-NPs的XRPD圖譜

2.13 溶解度考察

取過量的橙皮苷原料藥、HD-PC、HD-PC-NPs凍干粉及其物理混合物（藥物與輔料比例同HD-PC-NPs凍干粉）置于蒸餾水中，于25 ℃下震蕩3 d（轉速為100 r/min）。取上層混懸液，過0.45 μm微孔濾膜后測定，結果見表11。橙皮苷原料藥溶解度僅為（6.32±0.12）μg/mL，HD-PC將其溶解度提高至2.48倍，而HD-PC-NPs將其溶解度提高至77.06倍。從物理混合物溶解度數(shù)據(jù)可以看出，輔料的增溶作用有限，提高幅度遠低于HD-PC-NPs。

表11 溶解度測試結果(, n = 3)

2.14 HD-PC-NPs體外釋藥考察

橙皮苷溶解度受pH值影響較小[5]。測得橙皮苷在1.0% SDS水溶液中溶解度為（114.67±3.18）μg/mL，為達漏槽條件，故選擇體積為900 mL，濃度為1.0% SDS水溶液作為釋藥介質(zhì)[6]。取橙皮苷原料藥、HD-PC、物理混合物（橙皮苷與輔料比例同HD-PC-NPs凍干粉）和HD-PC-NPs凍干粉樣品（相當于橙皮苷含量20 mg），加入空白釋藥介質(zhì)4 mL，并置于透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為8000～ 12 000），扎緊。設置溫度為（37.0±0.5）℃，轉速為75 r/min，于0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、18.0、24.0、36.0 h取樣4 mL，并補加空白介質(zhì)4 mL。樣品經(jīng)8000 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）5 min后測定，結果見圖7。橙皮苷原料藥在36 h內(nèi)累積釋放率僅為8.12%，可能與橙皮苷原料藥疏水性較強、顆粒較大有關。橙皮苷在物理混合物中的累積釋放度略有提高（9.68%），可能與制劑中輔料增溶作用有關。HD-PC各點累積釋放率得到明顯改善，但36 h時仍未完全釋藥。而HD-PC-NPs凍干粉在4 h累積釋放率達90%以上，顯著提高了橙皮苷釋藥速率及釋放度。

圖7 體外藥物釋放曲線(, n = 3)

2.15 體內(nèi)藥動學研究

2.15.1 給藥方案及樣品采集 取禁食12 h的SD大鼠18只，隨機分成橙皮苷原料藥、HD-PC和HD-PC-NPs凍干粉3組，每組6只。采用0.5% CMC-Na水溶液配制灌胃液，劑量均為30 mg/kg（以橙皮苷含量計）。于0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00 h于眼眶后靜脈取血約0.3 mL，至肝素化離心管中（肝素鈉質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL），并于3500 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）3 min。移取上層血漿至空白離心管中，冷凍保存。

2.15.2 血漿樣品處理[6,23]血漿樣品解凍后精密移取100 μL，加入50 μL內(nèi)標溶液和1 mL乙腈，渦旋3 min，于離心機中5000 r/min離心（離心半徑為8.6 cm）5 min。取上層液至空白離心管中，40 ℃水浴下的氮氣吹干。加入100 μL乙腈復溶，5000 r/min離心3 min，即得。

2.15.3 血漿對照品線性考察 精密取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，乙腈稀釋至質(zhì)量濃度為1200 ng/mL，作為內(nèi)標溶液。乙腈稀釋配制質(zhì)量濃度為2000、1000、500、100、50、25 ng/mL的橙皮苷對照品溶液，各質(zhì)量濃度取100 μL，分別加入內(nèi)標溶液50 μL，混勻后于40 ℃水浴中氮氣緩慢吹干。于殘渣中分別加入空白血漿100 μL，后續(xù)按“2.14.2”項下處理，得血漿對照品溶液，進樣測定，計算橙皮苷與內(nèi)標峰面積比值。以橙皮苷質(zhì)量濃度（）對峰面積比值（）進行線性回歸，得橙皮苷回歸方程＝0.221 9＋0.101 7，＝0.994 2，所以線性范圍為25～2000 ng/mL。

2.15.4 方法學考察 按“2.14.2”項下方法分別處理空白血漿和血漿樣品，測定結果見圖8，血漿內(nèi)源性物質(zhì)未干擾內(nèi)標和橙皮苷色譜峰，專屬性較高。取血漿樣品于0、2、4、6、8、12 h進樣，計算得橙皮苷和內(nèi)標峰面積比值的RSD為9.18%，說明穩(wěn)定性良好。取2000 ng/mL（高）、500 ng/mL（中）和25 ng/mL（低）血漿對照品溶液，連續(xù)測定6次，計算得橙皮苷和內(nèi)標峰面積比值的RSD依次為6.97%、7.84%、9.37%，說明日內(nèi)精密度良好。連續(xù)測定6 d，每天1次，計算得峰面積比值的RSD依次為4.49%、8.07%、6.14%，說明日間精密度良好。分別配制2000 ng/mL（高）、500 ng/mL（中）和25 ng/mL（低）的橙皮苷對照品溶液，按“2.14.2”項下方法處理后進樣測定，并與配制質(zhì)量濃度比較，計算回收率。結果顯示，平均回收率為94.71%，RSD為5.90%，說明準確度較高。

2.15.5 藥動學結果 橙皮苷原料藥、HD-PC和HD-PC-NPs組的血藥濃度-時間曲線，結果見圖9。DAS2.0軟件包擬合數(shù)據(jù)，結果見表12。橙皮苷制備成HD-PC后1/2延長至（4.71±0.66）h，max增加至（511.70±105.04）ng/mL，生物利用度提高至1.48倍。HD-PC-NPs組藥動學行為發(fā)生了更大變化，主要藥動學參數(shù)與橙皮苷原料藥或物理混合物相比均具有極顯著性差異（＜0.01），其中max提前至（1.04±0.33）h，1/2延長至（5.69±0.82）h，max增加至（1 213.96±149.88）ng/mL，相對生物利用度提高至3.09倍，其提高幅度大于HD-PC，說明HD-PC-NPs促吸收作用更為顯著。

圖8 空白血漿(A)、血漿樣品(B) 和橙皮苷＋空白血漿(C)的HPLC圖

圖9 藥-時曲線(, n = 6)

3 討論

在制備PC時一般采用非質(zhì)子溶劑作為反應介質(zhì)，所以質(zhì)子溶劑如甲醇、乙醇可能會干擾PC的形成，影響復合率[6]。四氫呋喃屬于非質(zhì)子溶劑，沸點較低，易于除去，且橙皮苷在四氫呋喃中溶解度相對較高，因而選為反應溶劑。PC中藥物與磷脂摩爾比一般按照1∶1結合在一起[13-14]，為使藥物與磷脂完全形成PC，故在制備HD-PC時橙皮苷與磷脂的物質(zhì)的量比控制為1∶1.2，此時的復合率基本達100%。

橙皮苷原料藥難溶于水及各種有機溶劑。龍家英等[24]采用高速剪切聯(lián)合高壓均質(zhì)法制備了橙皮苷納米混懸劑，ζ電位為（?23.16±1.12）mV，絕對值不足30 mV，穩(wěn)定性不高，可能與穩(wěn)定劑種類過于單一有關[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)，采用介質(zhì)研磨法[25]直接將橙皮苷制備成NPs時，平均粒徑達到（653.04±49.96）nm，粒徑大小對藥物體內(nèi)吸收存在較大影響[21]。另外，橙皮苷熱穩(wěn)定性較差[26]，采用介質(zhì)研磨法制備HD-NPs時研磨介質(zhì)之間的機械能轉化成大量的熱能，可能影響橙皮苷的穩(wěn)定性。本研究將橙皮苷制備成HD-PC來提高其溶解度，為后續(xù)HD-PC-NPs的制備奠定基礎。

本研究以HD-PC形式制得HD-PC-NPs粒徑為（268.62±18.14）nm，為難溶性藥物NPs處方工藝研究提供了新的思路。HD-PC-NPs處方中的磷脂發(fā)揮2方面的作用：①形成HD-PC后增加藥物的溶解度，為制備HD-PC-NPs奠定基礎；②磷脂是一種兩親性表面活性劑，可吸附于NPs表面提供負電荷，并與TPGS一同起到穩(wěn)定作用[27]。

表12 主要藥動學參數(shù)(, n = 6)

與橙皮苷比較：*＜0.05**＜0.01；與HD-PC比較：##＜0.01

*< 0.05,**< 0.01hesperidin;##< 0.01HD-PC

HD-PC提高了橙皮苷溶解度及溶出度，但改善程度有限[6]。根據(jù)Ostwald-Freundlich方程，藥物粒徑對溶解度有很大影響，當粒徑減小時，比表面積急劇增大，藥物的溶解度會顯著增大。同時也對藥物溶出速率及累積溶出率產(chǎn)生積極影響。因而HD-PC-NPs與HD-PC相比，具有更高的溶解度、更快的溶出速率及更大的累積溶出度。

HD-PC將其生物利用度提高至1.48倍，但HD-PC-NPs的提高幅度更大（3.09倍）。HD-PC-NPs的max顯著性提前，可能是由于HD-PC-NPs加快了橙皮苷的釋藥速率，縮短了經(jīng)胃腸道黏膜吸收時間所致。HD-PC-NPs的max顯著性增大可能是由于在HD-PC-NPs中引入PC技術后增加了藥物的透膜能力所致，也與HD-PC-NPs極大提高了藥物的累積溶出度有關。

HD-PC-NPs相對口服吸收生物利用度極顯著性提高至3.09倍，可能是由于納米藥物比表面積急劇增大，有效增加了與胃腸道接觸面；橙皮苷在HD-PC-NPs中以無定型形式存在，而無定型藥物往往具有更高的生物利用度[28]；納米藥物與胃腸道黏附性較強，有益于橙皮苷透膜吸收[29]；橙皮苷在體內(nèi)胃腸道穩(wěn)定性較差，附著于HD-PC-NPs表面的穩(wěn)定劑可能增加了藥物的穩(wěn)定性[19]；HD-PC-NPs處方中的輔料如磷脂和TPGS等本身具有促進藥物吸收的作用[12,30]。后續(xù)還需進一步完善HD-PC-NPs質(zhì)量標準，評價HD-PC-NPs凍干粉的穩(wěn)定性，繼續(xù)對藥效學和毒理學等進行研究，為橙皮苷納米制劑研究開發(fā)提供更為全面、可靠的研究資料。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation, characterization andoral pharmacokinetics of hesperidin phospholipids complex nanosuspensions

LI Xi1, 2, 3, ZHANG Wen-zhou1, 2, 3, HAO Hai-jun4

1. Department of Pharmacy, Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University and Henan Cancer Hospital, Zhengzhou 450000, China 2. Henan Engineering Research Center for Tumor Precision Medicine and Comprehensive Evaluation, Zhengzhou 450000, China 3. Henan Provincial Key Laboratory of Anticancer Drug Research, Zhengzhou 450000, China 4. Shanghai Institute of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201401, China

To prepare hesperidin phospholipids complex (HD-PC) nanosuspensions (HD-PC-NPs) and study its pharmacokinetics behavior in SD rats.Hesperidin was prepared into HD-PC to enhance its solubility. HD-PC-NPs were prepared by nano-precipitation and high pressure homogenization method. Based on single factor experiments, amounts ratio of stabilizer to HD-PC, homogenization pressure and frequency were used as influencing factors, overall values (OV) of average particles size, polydispersion index (PDI) and ζ potential were employed as evaluation indexes, the formulation of HD-PC-NPs was optimized by Box-Behnken design-response surface method. Lyophilized powder of HD-PC-NPs was prepared. Morphology of HD-PC-NPs was observed by transmission electron microscope (TEM). Dialysis bag method was employed to investigate the drug release. SD rats were divided into hesperidin suspension group, HD-PC group and HD-PC-NPs group. Hesperidin concentration in plasma was analyzed by HPLC, main pharmacokinetic parameters and relative oral bioavailability were also calculated.Optimal preparation of HD-PC-NPs was as follows: amounts ratio of stabilizer to HD-PC was 3.2, homogenization pressure was 95 MPa, homogenization frequencies was 10 times and temperature was 50 ℃. Lyophilized powder has a full appearance prepared by 5% mannitol. The morphology of HD-PC-NPs was spherical or quasi-spherical. Average particle size, PDI and ζ potential of HD-PC-NPs were (268.62 ± 18.14) nm, 0.122 ± 0.013 and (?31.79 ± 1.37) mV, respectively. Solubility of hesperidin was enhanced to 77.06 times and cumulative dissolution in 6 h was increased to 94.68% by HD-PC-NPs. Themaxof HD-PC-NPs was advanced significantly,1/2was prolonged to (5.69 ± 0.82) h,maxwas increased to (1 213.96 ± 149.88) ng/mL and the oral bioavailability was enhanced to 3.09 times.HD-PC-NPs could enhance solubility of hesperidin, and promote dissolutionand absorption.

hesperidin; phospholipids complex; nanosuspensions; Box-Behnken design-response surface method; bioavailability; nano-precipitation and high pressure homogenization method

R283.6

A

0253 - 2670(2022)24 - 7740 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.012

2022-07-24

河南省二〇二一年科技發(fā)展計劃（2002310325）；上海市科委項目（21S21903400）

李 茜（1989—），女，碩士，主管藥師，主要從事藥動學、醫(yī)院藥學研究。Tel: (0371)65588378 E-mail: hnzlyylixi@126.com

張文周（1969—），男，學士，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學研究。Tel: (0371)65588378 E-mail: hnzzzwz@sina.com

[責任編輯 鄭禮勝]