○汪鄂洲付昕石義付陳澤濤朱勇夫董薇薇鄭海濤，4闕延福李偉濤朱麗婭

（1.水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水利部中國科學(xué)院水工程生態(tài)研究所 湖北武漢 430079；2.南水北調(diào)中線水源有限責(zé)任公司 湖北丹江口 442700；3.湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所 湖北武漢 430071；4.湖北中水長(zhǎng)江生態(tài)保護(hù)研究院有限公司 湖北武漢 430014）

鳙（Aristichthys nobilis）屬鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cprinidae）、鰱亞科（Hypophthalmichthyinae），是我國傳統(tǒng)的“四大家魚”之一，其自然分布區(qū)主要在中國大陸長(zhǎng)江和珠江流域，其他水體中也有分布。自二十世紀(jì)五十年代我國突破四大家魚人工繁殖技術(shù)后，鳙逐漸成為我國乃至世界主要淡水魚類養(yǎng)殖種類。世界上已有20多個(gè)國家和地區(qū)引進(jìn)了鰱和鳙，或作為水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象供人們食用，或用于池塘、水庫等水體浮游生物的生物控制。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）的統(tǒng)計(jì)資料，2010年鳙為世界第七大水產(chǎn)養(yǎng)殖種類，根據(jù)我國2019年漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，鳙的產(chǎn)量達(dá)到310.16萬噸，居養(yǎng)殖產(chǎn)量第三位。由于受水利建設(shè)，過度捕撈以及水體污染等多種因素影響，我國幾大天然水體中的鳙野生資源量呈急劇下降態(tài)勢(shì)。

丹江口水庫（110°34′47″-110°47′53″E，32°14′10″-32°58′10″N）位于漢江中上游，在湖北省丹江口市和河南省南陽市之間，水域橫跨鄂、豫兩省，是南水北調(diào)中線工程的唯一水源地，也是優(yōu)化我國水資源配置的重大戰(zhàn)略工程。為進(jìn)一步改善水庫水質(zhì)，維護(hù)和恢復(fù)丹江口水庫水生生物資源，近20年來丹江口庫區(qū)多次開展包括“四大家魚”在內(nèi)的經(jīng)濟(jì)魚類增殖放流活動(dòng)。僅2019年丹江口市放流鰱、鳙、草魚、鳊等魚苗4250萬尾。雖然大規(guī)模的增殖放流一定程度上對(duì)鳙資源的恢復(fù)起到作用，但放流苗種來源不一在很大程度上會(huì)對(duì)天然水域鳙群體帶來影響，甚至?xí)?dǎo)致物種野生群體遺傳多樣性降低，造成遺傳污染。因此，應(yīng)加強(qiáng)增殖放流的遺傳管理，在放流前開展遺傳評(píng)估。馮曉婷等對(duì)2016-2018年長(zhǎng)江江蘇段主要參與增殖放流的良種場(chǎng)所采集的鳙親魚和長(zhǎng)江江蘇段各采樣點(diǎn)的回捕鳙進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示增殖放流對(duì)長(zhǎng)江江蘇段野生群體的貢獻(xiàn)率為6.11%。

遺傳多樣性不僅是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，也是魚類物種生存與進(jìn)化的基礎(chǔ)，開展魚類遺傳多樣性研究，對(duì)漁業(yè)資源管理與養(yǎng)護(hù)、人工增殖放流等工作具有重要的指導(dǎo)意義。自上世紀(jì)九十年代以來，我國科研人員利用同工酶、微衛(wèi)星、線粒體等不同的標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)江流域鳙遺傳多樣性進(jìn)行了研究，而有關(guān)丹江口庫區(qū)魚類的遺傳多樣性研究尚未見報(bào)道。丹江口庫區(qū)有關(guān)魚類的研究主要集中在庫區(qū)魚產(chǎn)力、魚類資源調(diào)查及魚類群落特征等方面。

本研究利用線粒體CO I和Cytb序列分析了丹江口水庫鳙增殖放流親本、苗種及庫區(qū)自然群體的遺傳多樣性，研究結(jié)果不僅是科學(xué)的漁業(yè)管理、制定保護(hù)策略依據(jù)，也將為鳙種質(zhì)資源開發(fā)利用和增殖放流遺傳管理提供基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019-2020年于丹江口增殖放流站隨機(jī)采集鳙親本（Yong-QB）和子代（Yong-ZD），收集丹江口庫區(qū)自然水體鳙樣品（Yong-KQ），共計(jì)收集鳙樣品92尾，具體信息見表1。每個(gè)樣品經(jīng)過形態(tài)鑒定后，剪取適量尾鰭置于裝有無水乙醇的EP管中，帶回實(shí)驗(yàn)室凍存于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 鳙樣本信息

1.2 基因組總DNA提取及PCR擴(kuò)增

鳙基因組總DNA采用酚/氯仿法提取，溶解于200 μL TE緩沖液中，檢查DNA樣品濃度后，保存于-20℃冰箱備用。DNA工作液稀釋為 50 ng/μL，PCR 反應(yīng)體系為40 μL，其中Mix 20 μL、正反向引物各 2 μL、雙蒸水 14 μL、DNA模板2 μL。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 35 s，58℃退火 35 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物送天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。鳙線粒體PCR擴(kuò)增引物見表2。

表2 鳙CO I和Cytb序列擴(kuò)增引物信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用軟件FinchTV對(duì)測(cè)序得到的CO I和Cytb序列進(jìn)行拼接，輔以人工校對(duì)，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的鳙mtDNA序列進(jìn)行對(duì)比，確保擴(kuò)增CO I和Cytb序列的準(zhǔn)確性。使用DnaSP 5.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)目（N）、變異位點(diǎn)（V）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）、基因流（Nm），以及單倍型類型等參數(shù)。使用Arlequin 3.01軟件，根據(jù)pairwise difference模型計(jì)算種群間的分化指數(shù)值（Fst）和分子方差分析（AMOVA）。使用MEGA V6.0計(jì)算堿基含量和轉(zhuǎn)換/顛換比率，根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算單倍型間遺傳距離并進(jìn)行NJ聚類。

2 結(jié)果

2.1 堿基組成

測(cè)序后經(jīng)序列比對(duì)，共獲得3個(gè)鳙群體92條有效的線粒體CO I和92條有效的Cytb序列，長(zhǎng)度分別為653 bp和1120 bp?；贑O I基因序列分析結(jié)果表明，堿基的平均含量分別為A=25.5%，T=29.3%，C=27.3%，G=17.9%；其中A+T的平均含量為54.8%，G+C為45.2%。92條鳙線粒體CO I序列中檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)3個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè)，單一變異位點(diǎn)0個(gè)，定義了4個(gè)單倍型，其中1個(gè)單倍型為3個(gè)群體共有單倍型，2個(gè)單倍型為2個(gè)群體共有，1個(gè)單倍型僅在親本群體中檢測(cè)到（表3）。

基于Cytb基因序列分析結(jié)果表明，堿基的平均含量分別為A=29.6%，T=27.2%，C=29.0%，G=14.2%，轉(zhuǎn)換顛換比為6.4；其中A+T的平均含量為56.8%，G+C為43.2%。92條鳙線粒體Cytb序列檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)9個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)6個(gè)，單一變異位點(diǎn)3個(gè)，定義了8個(gè)單倍型，其中1個(gè)單倍型為3個(gè)群體共有單倍型，3個(gè)單倍型為2個(gè)群體共有，4個(gè)單倍型僅在單一群體中檢測(cè)到（表3）。

表3 鳙3個(gè)群體單倍型數(shù)目、類型、頻率及分布

2.2 群體遺傳多樣性

線粒體CO I序列分析結(jié)果顯示，3個(gè)鳙群體共定義了4個(gè)單倍型，其中Yong-KQ群體共22尾，定義了2個(gè)單倍型，其單倍型多樣性最低，僅為（0.312±0.106）；Yong-QB群體共30尾，定義了4個(gè)單倍型，其單倍型多樣性為（0.356±0.106）；Yong-ZD群體共40尾，定義了2個(gè)單倍型，其單倍型多樣性最高，為（0.409±0.065）。核苷酸多樣性和平均核苷酸差異分析結(jié)果顯示，Yong-ZD群體最高，分別為（0.00063±0.00011）、（0.40897）；Yong-QB 群體次之，分別為（0.00059±0.00019）、（0.38161）；Yong-KQ 群體最低，分別為（0.00048±0.00016）、（0.31169）。

線粒體Cytb序列分析結(jié)果顯示，3個(gè)鳙群體共定義了8個(gè)單倍型，其中Yong-KQ群體共22尾，定義了5個(gè)單倍型，其單倍型多樣性最高，為（0.714±0.065）；Yong-QB群體共30尾，定義了5個(gè)單倍型，其單倍型多樣性為（0.605±0.016）；Yong-ZD群體共40尾，定義了2個(gè)單倍型，其單倍型多樣性最低，僅有（0.050±0.047），此群體中有1個(gè)特有單倍型，可能是在丹江口增殖站運(yùn)行初期，引進(jìn)了部分苗種所導(dǎo)致。核苷酸多樣性和平均核苷酸差異分析結(jié)果顯示，Yong-ZD群體最低，分別為（0.00004±0.00004）、（0.05000）；Yong-QB群體次之，分別 為（0.00158± 0.00027）、（1.76782）；Yong-KQ群體最高，分別為（0.00159± 0.00022）、（1.78355）（表4）。

表4 鳙群體遺傳多樣性參數(shù)

2.3 群體遺傳差異

根據(jù)線粒體CO I和Cytb序列，采用Kimura雙參數(shù)（K2-P）模型分析鳙群體內(nèi)和群體間遺傳距離，結(jié)果顯示群體內(nèi)和群體間的遺傳距離差異不明顯（0.00048-0.00070，CO I；0.00004-0.00160，Cytb），群體內(nèi)和群體間遺傳距離?。ū?）。遺傳分化指數(shù)Fst和基因流Nm結(jié)果顯示，鳙群體間的Fst在 0.06785～0.20484，Yong-ZD和Yong-QB群體間P值小于0.05，Yong-KQ和Yong-ZD群體間P值小于 0.001，Nm在 4.29～30.26（基于CO I序列）；Cytb分析結(jié)果顯示，F(xiàn)st在 -0.00851～0.31930，Yong-ZD 和 Yong-KQ、Yong-QB群體間P值小于0.001，Nm在 0.89～186.66（表 6）。CO I分子方差分析（AMOVA）結(jié)果顯示，群體間的變異貢獻(xiàn)率占整個(gè)變異的12.60%，而群體內(nèi)的變異貢獻(xiàn)率占87.40%；Cytb分析結(jié)果顯示，群體間的變異貢獻(xiàn)率占整個(gè)變異的15.94%，而群體內(nèi)的變異貢獻(xiàn)率占84.06%（表7）。

表5 鳙群體內(nèi)和群體間的遺傳距離

表6 鳙群體間的遺傳分化系數(shù)和基因流

表7 鳙群體的分子方差分析

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

基于 Kimura（K2-P）雙參數(shù)模型構(gòu)建鳙群體CO I和Cytb單倍型序列系統(tǒng)發(fā)生NJ樹（圖1），系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度（bootstrap）均進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗(yàn)。從CO I單倍型序列NJ樹可以看出，CO I-Yong-Hap-4單倍型是Yong-KQ群體特有單倍型。4個(gè)鳙單倍型譜系分為2支，Yong-KQ群體特有CO I-Yong-Hap-4單獨(dú)為一支，其余3個(gè)單倍型聚為另一支。

圖1 基于CO I（A）和Cytb（B）序列單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

Cytb單倍型序列NJ樹結(jié)果顯示，3個(gè)鳙群體同樣存在2個(gè)明顯的單倍型譜系分支，單倍型Cytb-Yong-Hap-2、Cytb-Yong-Hap-4、Cytb-Yong-Hap-5、Cytb-Yong-Hap-7和Cytb-Yong-Hap-8五個(gè)單倍型聚為一個(gè)分支，其余單倍型聚為另外一個(gè)分支，單倍型聚類關(guān)系中各群體單倍型散亂分布，3個(gè)鳙群體間并未形成明顯的地理譜系。

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)和重要組成部分，遺傳多樣性每丟失10%，就會(huì)對(duì)生物繁育能力、存活率、生長(zhǎng)等重要性狀產(chǎn)生很大的負(fù)面影響。單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）和平均核苷酸差異數(shù)（K）是衡量種群遺傳變異的重要參數(shù)。本研究利用線粒體Cytb和CO I基因序列對(duì)丹江口增殖放流站鳙親本群體、子代群體和丹江口庫區(qū)自然群體進(jìn)行了遺傳多樣性比較分析?；诰€粒體Cytb基因序列研究結(jié)果顯示3個(gè)鳙群體的平均單倍型多樣性分別為0.452±0.060，平均核苷酸多樣性分別為0.00102±0.00016，平均核苷酸差異分別為1.14525，低于其他流域鳙群體遺傳多樣性。吳偉軍等利用Cytb基因序列研究紅水河鳙3個(gè)野生群體發(fā)現(xiàn)單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸變異差異分別介于0.667-0.8929、0.0014-0.0027和1.5556-2.9286?；诰€粒體CO I基因序列研究結(jié)果顯示3個(gè)鳙群體的平均單倍型多樣性分別為0.385±0.059，平均核苷酸多樣性分別為0.00063±0.00011，平均核苷酸差異分別為0.41304，低于其他增殖放流站鳙群體遺傳多樣性。劉慧芬等分析了河南省11個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)鳙群體的線粒體CO I基因序列，165個(gè)樣品共檢測(cè)出14個(gè)單倍型，平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為 0.86237、0.00223；Li等等通過線粒體D-Loop區(qū)和16S rRNA對(duì)比分析了長(zhǎng)江（樣品采集于漢江和長(zhǎng)江石首段）、珠江和黑龍江鳙群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江鳙群體（Hd=0.787，Pi=0.0020）低于珠江群體和黑龍江群體；不同流域和增殖放流站鳙群體顯示出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性。沙航等利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了長(zhǎng)江中游石首、監(jiān)利和長(zhǎng)沙3個(gè)鳙群體遺傳多樣性，結(jié)果顯示3個(gè)鳙群體具有較高的遺傳多樣性（PIC＞0.5，He＞0.6）；馮曉婷等基于微衛(wèi)星標(biāo)記分析長(zhǎng)江下游7個(gè)原良種場(chǎng)鳙親本和后備親本遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)鳙親本具有較高遺傳多樣性水平（PIC＞0.789，He=0.889）。魚類養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性低于野生群體，在鰱、鯉、草魚等養(yǎng)殖魚類中均有報(bào)道，在鳙養(yǎng)殖群體也有遺傳多樣性下降的報(bào)道。丹江口水庫3個(gè)鳙群體的線粒體DNA數(shù)據(jù)顯示了相對(duì)偏低單倍型多樣性和核苷酸多樣性，可能是以下因素有關(guān)。首先，養(yǎng)殖場(chǎng)親本在封閉的養(yǎng)殖條件下經(jīng)過人工選擇和淘汰，這可能導(dǎo)致親本遺傳多樣性降低。其次，在采樣過程中，特別是鳙子代樣品，可能來自少數(shù)幾個(gè)親本的后代，表現(xiàn)出偏低的遺傳多樣性水平。再次，丹江口水庫建成之后，近20多年進(jìn)行了多次人工放流，放流的苗種來源多樣，質(zhì)量不一；如：有些繁殖場(chǎng)存在近親繁殖苗種的不科學(xué)操作，或往往幾條雌魚的產(chǎn)量就足以滿足當(dāng)年魚苗的需求量，或在進(jìn)行人工繁殖時(shí)所用的親本組合數(shù)較少，這就導(dǎo)致了后代群體的遺傳多樣性降低甚至出現(xiàn)生長(zhǎng)性狀退化、抗逆性降低等不利于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的現(xiàn)象。

3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳距離、遺傳分化指數(shù)（Fst）和基因流（Nm）是研究遺傳結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)。本研究中根據(jù)線粒體序列數(shù)據(jù)計(jì)算出的鳙種群內(nèi)和種群間遺傳距離均＜0.005，群體內(nèi)和群體間遺傳距離差異不顯著，表明群體之間親緣關(guān)系很近。AMOVA分析顯示，有12.60%（CO I）、15.94%（Cytb）的變異來自于群體間，群體內(nèi)的變異依然是主要來源；綜合線粒體序列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)群體間差異顯著（Fst=0.12604，F(xiàn)st=0.15942，P＜0.001）。一般認(rèn)為，F(xiàn)st值小于0.05時(shí)，表示群體間遺傳分化極小；當(dāng)Fst值在0.05-0.15之間時(shí)，說明群體間有遺傳分化；當(dāng)Fst值在0.15-0.25之間時(shí)，說明群體間遺傳分化較大；當(dāng)Fst值大于0.25時(shí)，表明群體間有極大的遺傳分化。通過群體間的逐對(duì)比較進(jìn)一步檢測(cè)鳙群體間可能的遺傳分化，Yong-ZD與Yong-KQ、Yong-QB之間Fst分別為 0.20484（P＜0.001）、0.09214（P＜0.05）（CO I）和 0.31930、0.22203（P＜0.001）（Cytb），表明Yong-ZD與Yong-KQ群體之間有極大遺傳分化，與Yong-QB群體之間有顯著的遺傳分化；而Yong-KQ和Yong-QB群體之間遺傳分化不顯著。根據(jù)對(duì)鳙群體間基因流（Nm）的檢測(cè)結(jié)果，Yong-ZD與Yong-KQ群體之間有一定基因交流，而與Yong-QB群體之間有頻繁的基因交流（Nm＞30），這也反應(yīng)出親本與子代之間密切關(guān)系。從鳙群體間單倍型聚類關(guān)系分析可知，3個(gè)群體間均有共享單倍型，沒有聚集成不同群體，另外其他2個(gè)群體相比，Yong-ZD群體只有1個(gè)特有的單倍型，這也反應(yīng)了Yong-ZD群體與其他群體間的遺傳分化。

3.3 鳙資源保護(hù)和利用

增殖放流是目前恢復(fù)漁業(yè)資源的主要手段之一，而放流后會(huì)不會(huì)導(dǎo)致魚類遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化也是人們重點(diǎn)關(guān)注問題。本研究的結(jié)果表明，丹江口水庫3個(gè)鳙群體遺傳多樣性處于較低水平，子代群體與丹江口水庫自然群體有顯著的遺傳分化；親本群體與丹江口水庫自然群體之間有頻繁的基因交流，遺傳分化不顯著。漢江是長(zhǎng)江主要支流，在丹江口水庫建成之前，分布于長(zhǎng)江、漢江兩個(gè)水系的鳙能夠進(jìn)行交流，丹江口水庫建成之后，阻斷與長(zhǎng)江鳙交流通道。丹江口水庫大壩加高蓄水后，回水區(qū)上延、水流變緩，對(duì)分布于水庫上游至安康大壩江段的鳙及其他產(chǎn)漂流性卵的魚類有較大影響。近年來，為庫區(qū)魚類資源的保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展，采取了包括禁漁期、增殖放流、打擊偷捕濫捕等措施。增殖放流活動(dòng)在增加鳙資源量的同時(shí)，也可能改變了丹江口水庫鳙群體遺傳多樣性水平，因此，為了改善丹江口水庫天然種群的遺傳結(jié)構(gòu)，建議加強(qiáng)增殖放流遺傳管理，選取來源于較高遺傳多樣性水平的長(zhǎng)江鳙進(jìn)行放流。

參考文獻(xiàn)略。