◎ 韋倩妮

（北海職業(yè)學(xué)院，廣西 北海 536000）

我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖量居世界前列，銷(xiāo)售和加工量大。在加工過(guò)程中，產(chǎn)生魚(yú)骨、魚(yú)片、魚(yú)鱗等大量下腳料，約占魚(yú)體的54%，其中魚(yú)頭、魚(yú)骨約占43%，占比最多[1]。我國(guó)水產(chǎn)品加工和副產(chǎn)物綜合利用的水平較低，若這些下腳料沒(méi)有得到有效利用，會(huì)造成資源浪費(fèi)，甚至污染環(huán)境。隨著漁業(yè)的發(fā)展，魚(yú)類(lèi)下腳料的高值化利用逐漸引起人們的重視，不少學(xué)者開(kāi)展了研究。魚(yú)皮、魚(yú)頭、魚(yú)骨等部位常用于制備活化鈣，提取明膠、蛋白多肽和硫酸軟骨素等活性物質(zhì)，也可制成即食魚(yú)排等各類(lèi)休閑食品[2]。

制備蛋白肽常用酶解法和發(fā)酵法，通過(guò)微生物發(fā)酵法提取多肽，可充分發(fā)揮微生物胞外酶對(duì)蛋白質(zhì)水解的作用，還可以利用其發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的各種酶來(lái)分解脂肪和腥味物質(zhì)[3]?？莶菅挎邨U菌是一種傳統(tǒng)食品用菌，具有良好的產(chǎn)酶能力。本文以羅非魚(yú)骨、魚(yú)頭制備魚(yú)骨漿原料，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵，制備膠原蛋白肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)，市售?？莶菅挎邨U菌，北海職業(yè)學(xué)院食品檢驗(yàn)檢測(cè)團(tuán)隊(duì)選育；牛肉膏、蛋白胨，北京奧星生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白、福林酚酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉、無(wú)水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉和磷酸氫二鉀，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心；三氯乙酸，福晨天津化學(xué)試劑有限公司。培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，調(diào)節(jié)pH 值至7.4～7.5，用于種子液制備。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-12 恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；250B 振蕩培養(yǎng)箱，金壇市宏華儀器廠；UV1000紫外分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司；TD-4Z 離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；YXQ-LS-50S Ⅱ高壓滅菌鍋、SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液的制備

將枯草芽孢桿菌活化，接種于種子液培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 魚(yú)骨膠原蛋白肽水解液的制備

羅非魚(yú)去鱗、去皮、去肉，清除內(nèi)臟，將魚(yú)體清洗干凈，魚(yú)頭、魚(yú)骨下腳料絞碎，得到魚(yú)骨漿。分別稱(chēng)取一定質(zhì)量的魚(yú)骨漿和水于三角瓶中，用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。冷卻后，將枯草芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于一定溫度的培養(yǎng)箱，振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間。將發(fā)酵液8 500 r·min-1離心10 min，收集上清，于98 ℃水浴5 min，滅酶，得到水解液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別考察種子液接種量（3%、5%、7%、9%和11%）、發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、魚(yú)骨漿添加量（8%、10%、12%、14%和16%）、發(fā)酵時(shí)間（18 h、24 h、30 h、36 h 和42 h）等4 個(gè)因素對(duì)水解度的影響。按照1.3.2 方法制備水解液，取上清，測(cè)定水解度。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵溫度、魚(yú)骨漿添加量3 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.3.5 測(cè)定方法

魚(yú)骨漿總蛋白的測(cè)定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2016）。蛋白肽含量的測(cè)定采用福林-酚法測(cè)定，水解度采用TCA 法[4]。

幼兒園一日活動(dòng)始于晨間鍛煉，幼兒園的孩子非常活潑好動(dòng)，對(duì)各種體育活動(dòng)都有著濃厚的興趣，若是晨間鍛煉的體育活動(dòng)沒(méi)有充分調(diào)動(dòng)幼兒的積極性，使其參與到晨間鍛煉當(dāng)中，就會(huì)影響一日活動(dòng)的整體效果。

式中：N0為魚(yú)骨漿總蛋白的含量，g/100 g；N1為水解前可溶性多肽的含量，g/100 g；N2為水解后可溶性多肽的含量，g/100 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)水解度的影響

由圖1可知，接種量為7%時(shí)，水解度最大。當(dāng)接種量較小時(shí)，菌量不足，發(fā)酵水平不高；隨著接種量增大，胞外酶分泌量增多，發(fā)酵周期短[3]，但接種量過(guò)多，代謝廢物亦隨之增多，不利于發(fā)酵，導(dǎo)致水解度低[5]。

圖1 不同接種量對(duì)水解度的影響圖

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)水解度的影響

由圖2結(jié)果可知，溫度在35 ℃左右時(shí)，水解度最大。發(fā)酵溫度過(guò)高時(shí)，加劇了膠原蛋白肽鏈的斷裂，從而產(chǎn)生大量肽鏈片段[5]。

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)水解度的影響圖

2.3 魚(yú)骨漿添加量對(duì)水解度的影響

由圖3結(jié)果可知，當(dāng)魚(yú)骨漿添加量為12%時(shí)，水解度最大。當(dāng)魚(yú)骨漿添加量少時(shí)，培養(yǎng)基所含水分較多，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的胞外酶被稀釋?zhuān)绊懨傅淖饔眯Ч档退庑Ч鸞3]。

圖3 魚(yú)骨漿添加量對(duì)水解度的影響圖

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖4結(jié)果可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，水解度增大，當(dāng)發(fā)酵30 h 以后，水解度變化不大；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵液會(huì)有異味。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解度的影響圖

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件

2.5.1 回歸模型建立與方差分析

在確定單個(gè)因素適宜的范圍后，選取接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和魚(yú)骨漿添加量（C）為試驗(yàn)因素，水解度（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用Design-Expert 11 進(jìn)行Box-Benhken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見(jiàn)表2，顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)回歸分析，得到回歸方程Y=27.77+1.07A+1.04B+1.09C-0.367 5AB-0.482 5AC+1.32BC+1.32A2-1.60B2-0.948 5C。

表2 羅非魚(yú)骨發(fā)酵制備膠原蛋白肽藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，此模型的P＜0.01，說(shuō)明此模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.380 9，大于0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型的擬合程度比較好，與實(shí)際情況較吻合。同時(shí)模型的復(fù)決定系數(shù)R2=0.973 1，變異系數(shù)CV=1.87%，說(shuō)明該模型的預(yù)測(cè)結(jié)果有較高的精密度及可靠性。由P值可知，除二次項(xiàng)C2、相互項(xiàng)AB、AC對(duì)水解度無(wú)顯著影響外，其他項(xiàng)A、B、C、A2、B2、BC對(duì)水解度有顯著影響。根據(jù)F值大小，水解度受各因素影響的順序?yàn)镃（魚(yú)骨漿添加量）>A（接種量）>B（發(fā)酵溫度）。

2.5.2 響應(yīng)面圖形分析與最佳工藝確定

各個(gè)因素的交互作用響應(yīng)曲面圖如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)接種量、發(fā)酵溫度、魚(yú)骨漿添加量取值較小時(shí)，效應(yīng)曲面較陡，對(duì)水解度影響比較顯著。各交互作用中，接種量（A）與發(fā)酵溫度（B），接種量（A）與魚(yú)骨漿添加量（C）的等高線接近圓形，交互作用不顯著，發(fā)酵溫度（B）與魚(yú)骨漿添加量（C）的等高線為橢圓，交互作用顯著。通過(guò)軟件分析，得到水解的最佳工藝條件為接種量7.80%、發(fā)酵溫度36.59 ℃、魚(yú)骨漿添加量13.28%，在此條件下水解度的預(yù)測(cè)值為28.57%。為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需要，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為接種量7.8%、發(fā)酵溫度36.6 ℃、魚(yú)骨漿添加量13.3%，發(fā)酵時(shí)間30 h。按優(yōu)化的條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，水解度的平均值為28.52%，與模型的預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明本試驗(yàn)優(yōu)化的方法可行。

圖5 接種量、發(fā)酵溫度、魚(yú)骨漿添加量交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

羅非魚(yú)加工中產(chǎn)生的魚(yú)骨、魚(yú)頭等下腳料占比較大，如果僅作用于生產(chǎn)傳統(tǒng)飼料，利用價(jià)值較低。本研究以魚(yú)骨漿為原料、水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選，用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化水解的工藝條件，結(jié)果為接種量7.8%、發(fā)酵溫度36.6 ℃、魚(yú)骨漿添加量13.3%，發(fā)酵時(shí)間30 h。在此條件下，水解度可達(dá)28.52%。本試驗(yàn)為水產(chǎn)品加工下腳料的高值化利用提供了參考，具有應(yīng)用價(jià)值。