馬亞萍 吳鏑
【提要】 唇腭裂屬于最常見的先天性頜面畸形,在亞洲人群中的發(fā)病率較高。在胚胎發(fā)育過程中,小鼠與人類頜面部的發(fā)育過程有許多相似之處,因此唇腭裂 小鼠模型一直是研究人類唇腭裂疾病的重要工具。小鼠模型擁有數(shù)量多、壽命長(zhǎng)、生長(zhǎng)周期短、易獲得等一系列優(yōu)勢(shì),但也存在模型類型有限等問題。目前,建立唇腭裂小鼠模型的方法很多,較常用的有外科手術(shù)建立唇腭裂小鼠模型;運(yùn)用基因工程技術(shù)(Genetic engineering technology)建立唇腭裂小鼠模型,如基因敲除技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等;運(yùn)用致畸劑作用于孕鼠(如地塞米松、二噁英等),從而影響胚胎小鼠的發(fā)育,以建立唇腭裂小鼠模型等。本文就目前建立唇腭裂小鼠模型的方法進(jìn)行綜述。
唇腭裂是最常見的頜面部先天畸形,在世界范圍內(nèi)發(fā)病率大約為14.92/10 000,亞洲人群的發(fā)病率大約是1.19/1 000,高于非洲人及高加索人[1]。唇腭裂的分類方法眾多,如根據(jù)是否伴有身體其他畸形,唇腭裂可分為綜合征型唇腭裂(Syndromic cleft lip and palate,SCLP)以及非綜合征型唇腭裂(Non-syndromic cleft lip and palate,NSCLP);根據(jù)組織胚胎來源不同,唇腭裂還可分為單純腭裂、唇裂(伴或不伴有腭裂)。
唇腭裂的病因和遺傳與環(huán)境因素相關(guān)。遺傳學(xué)研究已經(jīng)定位到多個(gè)與唇腭裂發(fā)生發(fā)展有關(guān)的基因和區(qū)域,較明確的有IRF6、VAX1、8q24 等。各類動(dòng)物模型成為探究唇腭裂發(fā)生發(fā)展和手術(shù)治療的重要研究方法。常用的動(dòng)物模型有靈長(zhǎng)類動(dòng)物,以及大鼠、貓、犬和兔等。這些動(dòng)物模型各有優(yōu)勢(shì),其中靈長(zhǎng)類動(dòng)物的面部形態(tài)與人類最為接近,但是費(fèi)用高、樣本量少、性價(jià)比低;貓與人類顱頜面生長(zhǎng)機(jī)制相似;小鼠則是最廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型之一[2-3]。
小鼠胚胎唇腭部的發(fā)育過程與人類相似,影響唇腭部發(fā)育的因素復(fù)雜。小鼠上腭的生長(zhǎng)發(fā)育過程發(fā)生在胚胎的第11.5~17.5 天;第11.5 天腭突開始發(fā)育;第12.5 天時(shí)腭突開始垂直向下生長(zhǎng);第14.5 天時(shí),雙側(cè)腭突已發(fā)育至水平位置;第15.5 天時(shí),雙側(cè)腭突開始融合;第17.5 天時(shí)雙側(cè)腭突融合基本完成。在建立唇腭裂小鼠模型的過程中,我們可以通過外科手術(shù)或是影響胚胎發(fā)育的方式來完成模型的建立。
通過外科手術(shù)的方式建立唇腭裂小鼠模型,主要分為兩種:①有裂模型,通過外科手術(shù)將唇與腭板離斷形成縫隙,以模仿先天性唇腭裂所造成的顱面畸形;②無裂模型,借助外科手術(shù)模擬唇腭裂治療過程中的某一階段唇腭部的形態(tài),如模仿Langenbeck 腭裂修復(fù)術(shù)式所造成的減張切開創(chuàng)面和手術(shù)損傷后的軟腭[3-4]。
先天性唇腭裂小鼠模型的建立對(duì)于唇腭裂的病因?qū)W研究及其發(fā)生發(fā)展過程的研究更具價(jià)值。常用方法:①通過各種方式培育出唇腭裂發(fā)生率高的小鼠品系;②運(yùn)用基因工程技術(shù)培育特定基因型的唇腭裂小鼠;③運(yùn)用致畸劑誘導(dǎo)唇腭裂發(fā)生。
1.2.1 篩選出特定種系的小鼠以自然產(chǎn)出先天性唇腭裂幼崽
篩選出自發(fā)率高的特定種系小鼠以產(chǎn)出先天性唇腭裂幼崽,如傳統(tǒng)的近交系小鼠A/J、CL/Fr 品系具有自發(fā)唇腭裂傾向,自然發(fā)生率分別為8%~10%和18%~26%[4]。研究表明,用七氟烷影響A/J 小鼠的胚胎發(fā)育過程時(shí),A/J 小鼠的唇裂發(fā)生率可達(dá)50%左右,且A/J 小鼠的畸形率會(huì)隨著七氟烷濃度的升高而略有增加但并不顯著[5]。CL/Fr 小鼠的唇裂發(fā)生率只有23%,而運(yùn)用6-AN 處理后發(fā)生率高達(dá)94%,可能是6-AN 使上皮細(xì)胞表面光滑,造成細(xì)胞間連接減少,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞死亡;并且還可能導(dǎo)致外鼻突及內(nèi)鼻突縮小,影響鼻突的正常融合;此外,還可導(dǎo)致上皮細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞密度增加等細(xì)胞改變[6]。FVB 小鼠、A/WySn 小鼠也是常用的自發(fā)唇腭裂小鼠模型。
1.2.2 運(yùn)用基因工程技術(shù)建立唇腭裂小鼠模型
1.2.2.1 唇腭裂基因工程小鼠的制備方法
主要通過基因工程技術(shù)手段,如基因敲除、條件性基因敲除、轉(zhuǎn)基因、基因敲入等,對(duì)小鼠基因組進(jìn)行一定的人為干預(yù),由此產(chǎn)生各種表型的唇腭裂小鼠模型。
基因敲除技術(shù)的應(yīng)用最為廣泛,即將外源性基因插入靶基因的特定位點(diǎn),造成靶基因失活,從而形成特定的唇腭裂小鼠模型。如用一個(gè)含有l(wèi)acZ 基因以及新表達(dá)盒的目的基因插入表達(dá)載體Osr2 外顯子中,置換出部分外顯子,導(dǎo)致Osr2基因失活,然后把表達(dá)載體線性化通過電穿孔的方法注入到囊胚的ES 細(xì)胞中,從而得到F0 嵌合體小鼠,進(jìn)行不斷的交配篩選而獲得Ors2tm1Jian/tm1Jian純合小鼠[7]。
條件性基因敲除技術(shù)目前以趨于完善,可使靶基因的表達(dá)擁有時(shí)空特異性。其中較常見的便是Cre-loxP 小鼠的應(yīng)用,即讓GeneFlox/+小鼠(靶基因側(cè)翼含有成對(duì)的loxp 位點(diǎn)的雜合小鼠)與組織特異性Cre+的工具小鼠交配后,通過一系列的雜交選育獲得突變小鼠,然后通過誘導(dǎo)可在特定的組織或細(xì)胞中敲除目的基因,如在神經(jīng)嵴中特異性敲除eprhin-B1基因,從而獲得具有組織特異性的eprhin-B1-/-唇腭裂小鼠模型。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指用顯微注射針將線性化的外源DNA 片段直接注入小鼠受精卵的原核中,使外源基因隨機(jī)整合到小鼠基因組中而獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。如TTF-2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的制備,先選取TTF-2 為目的基因片段,建立表達(dá)載體pBROAD3-TTF-2,將促排卵雌鼠與雄鼠交配后得到受精卵,通過顯微注射技術(shù)將表達(dá)載體置入受精卵內(nèi),運(yùn)用PCR 技術(shù)及Southern blot 技術(shù),發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)陽(yáng)性的小鼠中一部分為唇腭裂表型。
1.2.2.2 唇腭裂基因工程小鼠的形成機(jī)制
腭板的生長(zhǎng)可粗略分為6 個(gè)期,分別是發(fā)生期、垂直生長(zhǎng)期、上抬期、水平生長(zhǎng)期、融合期和分化成熟期。這些階段受到影響有可能形成唇腭裂小鼠。①影響腭板生長(zhǎng),如Msx1-/-小鼠。Msx1 主要介導(dǎo)上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用,在顱面骨骼及牙齒的發(fā)育中起到重要作用。純合Msx1-/-小鼠會(huì)在剛出生后24 h 內(nèi)死亡。其引起腭裂的主要機(jī)制是前腭間質(zhì)細(xì)胞的增殖受損,分子機(jī)制可能是由于缺乏Bmp4 的表達(dá),而使Msx1-/-小鼠重新表達(dá)Bmp4 可以減少M(fèi)sx1-/-小鼠的腭裂表型及新生鼠死亡[8]。除了完全繼發(fā)腭裂,Msx1-/-小鼠還會(huì)出現(xiàn)其他的顱面畸形。這也是其引起繼發(fā)腭裂的原因之一。其機(jī)制可能是影響了上頜骨的牙槽突及牙的發(fā)育,這些結(jié)構(gòu)都緊鄰腭板,在一定程度上也影響腭板的生長(zhǎng)[9]。有研究表明野生型小鼠中Ors2 基因表達(dá)于上頜中部,并在腭突生長(zhǎng)時(shí)表達(dá)強(qiáng)烈,至腭突上抬及融合時(shí)其表達(dá)下降[10]。此外常見的小鼠模型還有EphB1-/-、EphB2lacZ/lacZ;EphB3-/-小鼠等。②影響腭板抬升,細(xì)胞遷移在腭板的定向抬升中扮演重要角色,Wnt5a 在細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用。Wnt5a-/-小鼠呈現(xiàn)出完全繼發(fā)腭裂。研究表明,Ror2-/-小鼠也呈現(xiàn)出完全繼發(fā)腭裂表型[11]。其主要機(jī)制可能為Wnt5a 與Ror2 相互作用激活非經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路,在腭前后軸內(nèi)對(duì)細(xì)胞遷移產(chǎn)生趨化作用從而阻礙了腭后部細(xì)胞向前遷移,中間部細(xì)胞向兩側(cè)遷移。此外常見的小鼠模型還有VlK-/-、Adamts9-/-;bt/bt 小鼠等。③影響板融合,有研究表明Wnt9a-/-、Ror1hyp/hyp、Ror1hyp/hyp;Wnt9a-/-、Ror2-/-、Ror1-/-基因型小鼠均可產(chǎn)出繼發(fā)腭裂表型的唇腭裂小鼠。其中Ror2-/-小鼠表現(xiàn)為繼發(fā)腭裂表型可能是因?yàn)镾hh 的表達(dá)下降[12]。TGFβ/Smads 通路是影響腭板發(fā)育的重要通路[13]。其中TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3 均有促進(jìn)腭板融合的功能。此外還有研究表明TGFβ3-/-的小鼠在胚胎發(fā)育第15.5天時(shí)腭板的前、中、后三部分均未出現(xiàn)融合,而野生型小鼠在此時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了腭板融合[14-15]。還有Snai1+/-、Snai2-/-、Jeff+/-、Smad2+/-小鼠也是常見的模型。
1.2.3 運(yùn)用藥物誘導(dǎo)建立小鼠的唇腭裂模型
在母體孕期(通常為胚胎發(fā)育第12~15 天,此時(shí)為小鼠胚胎唇腭部發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期)給予各類致畸藥物,以獲得先天性的唇腭裂小鼠模型。藥物的種類、劑量,以及給藥時(shí)間和方式均會(huì)影響唇腭裂的表現(xiàn)型。
研究表明,地塞米松可單獨(dú)致畸小鼠,且小鼠的畸形率受劑量影響。地塞米松達(dá)6.0 mg·kg-1時(shí),C57BL/6J 胎鼠的腭裂畸形率可達(dá)38%[16]。此外,二噁英和糖皮質(zhì)激素合用可以提高胎鼠的致畸率[17],二噁英和糖皮質(zhì)激素合用的情況下,高劑量一次性給藥相較于低劑量連續(xù)給藥在操作上給孕鼠帶來的影響更小,胎鼠死胎率顯著降低,孕鼠流產(chǎn)率也較低,腭裂小鼠模型更穩(wěn)定[18]。維甲酸也是小鼠腭裂模型常用的誘導(dǎo)劑,昆明胎鼠發(fā)育第10 天對(duì)維甲酸的敏感度最高,當(dāng)維甲酸劑量為50 mg·kg-1,孕鼠全部存活,死胎率為10.34%,活胎小鼠的腭裂發(fā)生率為95.34%,以此濃度建立的腭裂小鼠模型效益較高[19-20]。維甲酸誘導(dǎo)BALB/c 近交系小鼠建立腭裂模型時(shí),在胚胎發(fā)育第10 天,一次性管飼維甲酸50 mg·kg-1,小鼠腭裂形成效率較高[21]。不同品系小鼠給予可的松后的致畸率不同,A/J 與SWV 品系小鼠腭裂致畸率可達(dá)100%,而其他小鼠(如C57BL/6J、A.B6F1、B6.AF1)的致畸率往往較低,表明小鼠自身基因也是影響腭裂發(fā)生率的獨(dú)立因素。A/J 小鼠的高腭裂產(chǎn)生率可能與腭板融合延遲有關(guān)[22]。
小鼠現(xiàn)作為國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最多的動(dòng)物模型之一,其優(yōu)勢(shì)在于:①小鼠壽命1~3 年,生長(zhǎng)周期和孕育周期短;生產(chǎn)數(shù)量多,個(gè)體差異小;容易獲得,易于飼養(yǎng)。②小鼠的早期顱面發(fā)育與人類相似,可用于研究人類胚胎唇腭的發(fā)育的相關(guān)研究。其劣勢(shì)在于:①小鼠模型并不能準(zhǔn)確建立人類唇腭裂中各類綜合征型及非綜合征型的唇裂或腭裂模型。②部分基因功能繁多,基因敲除后可影響顱面其他部位的發(fā)育,從而無法判斷其作用究竟是影響了腭板的發(fā)育還是因?yàn)殡衽越M織的畸形而繼發(fā)腭畸形[23]。③部分小鼠模型胚胎過早,導(dǎo)致無法觀察腭板及唇部發(fā)育過程,如BMP2 基因敲除小鼠可在胚胎發(fā)育第7.5~10.5 天死亡,此時(shí)腭板還未發(fā)育[24]。
目前已經(jīng)探索了多種小鼠唇腭裂模型,從綜合征型至非綜合征型唇腭裂模型均有長(zhǎng)足的發(fā)展,對(duì)唇腭裂的病因及治療研究起到了重要作用。值得注意的是,各類方法建立小鼠唇腭裂模型時(shí)胎鼠及新生小鼠死亡率較高,不利于后續(xù)進(jìn)一步的研究。此外,即使小鼠腭裂模型成功建立,但在研究唇腭裂治療方法、患者智力發(fā)展、發(fā)音構(gòu)音功能、心理影響等方面,小鼠模型的作用極為有限,建模的經(jīng)濟(jì)效益較低。