劉偉，蔡英麗，馬曉龍，何培新

1.中國科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650201；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，湖北 武漢 430345；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 河南 鄭州 450001

0 引言

羊肚菌(Morchellaspp.)是一類名貴的食藥兼用真菌，百余年來，科技工作者一直致力于羊肚菌的栽培馴化研究，然而直到1982年才由美國學(xué)者R.D.Ower真正實(shí)現(xiàn)了室內(nèi)栽培，并進(jìn)行了商業(yè)化生產(chǎn)，但由于羊肚菌栽培穩(wěn)定性較差，故并未實(shí)現(xiàn)長期運(yùn)營[1-3]。我國自20世紀(jì)50年代開始進(jìn)行羊肚菌的栽培馴化研究，經(jīng)歷了仿生栽培、堆木栽培、菌根化栽培等模式，直至本世紀(jì)初，首次在川渝地區(qū)成功實(shí)現(xiàn)了以外源營養(yǎng)袋為核心技術(shù)的羊肚菌大田栽培，并于2012年走上商業(yè)化生產(chǎn)道路。2020—2021產(chǎn)季的羊肚菌栽培面積已超過15萬畝(1畝=667 m2)，九年間增長了50余倍，遍布全國各地[4-6]。然而，羊肚菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的背后是近乎70%的種植者無法穩(wěn)定盈利。除了平棚和簡易冷棚栽培管理模式無法抵御異常氣候變化等因素的影響，羊肚菌的育種和制種技術(shù)不夠統(tǒng)一和規(guī)范，菌種評(píng)價(jià)技術(shù)不夠科學(xué)和完善，也是造成栽培菌種質(zhì)量不穩(wěn)定，乃至生產(chǎn)不穩(wěn)定的重要原因[5,7-8]。

菌種是羊肚菌人工栽培的關(guān)鍵。2015年之前，全行業(yè)每年約有30%～40%的栽培面積不出菇或出菇質(zhì)量較差，一個(gè)重要的原因是推廣使用了如黑脈羊肚菌(M.angusticeps)、高羊肚菌(M.elata)、黃色羊肚菌類群(Esculenta clade)等非可栽培種類。目前，隨著對(duì)羊肚菌可栽培種類的認(rèn)知愈加明確，因種類選擇不當(dāng)而導(dǎo)致大面積不出菇的現(xiàn)象已大大減少[9-10]。最近研究[11]發(fā)現(xiàn)，羊肚菌組織分離物(潛在栽培菌株)存在較大比例的交配型基因丟失現(xiàn)象。隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間和代數(shù)的延續(xù)，羊肚菌菌株老化加劇，表現(xiàn)為菌核發(fā)生減少、色素產(chǎn)生提前、生長速率下降和細(xì)胞死亡事件發(fā)生；老化菌株用于栽培會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量急劇下降[12-13]。上述問題均直接影響了羊肚菌栽培的穩(wěn)定性。為了解決這些問題，本文總結(jié)了相關(guān)的理論研究成果和生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出了一套以身份(Identity)識(shí)別、交配型(Mating Type)基因檢測和菌株活力(Vitality)測定為主要內(nèi)容的羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評(píng)價(jià)系統(tǒng),在概述該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的理論和技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，闡述了每項(xiàng)評(píng)價(jià)技術(shù)的具體操作方法，以實(shí)際應(yīng)用效果驗(yàn)證該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的可行性，以期促進(jìn)該評(píng)價(jià)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，為提高我國羊肚菌人工栽培的穩(wěn)定性，促進(jìn)羊肚菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定和健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 羊肚菌菌株身份識(shí)別

1.1 羊肚菌潛在栽培菌株分類地位確定的必要性

羊肚菌子囊果形態(tài)多變，易受環(huán)境條件的影響，因此羊肚菌屬以下的分類一直是行業(yè)難題[14]。多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建為羊肚菌菌種的分類和鑒定確立了新的準(zhǔn)則。目前全球共確定了78個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)種，而我國至少分布著30個(gè)種[15-19]。早期馴化研究均缺乏物種分類鑒定的內(nèi)容，因此很難判定這些馴化栽培種類(如尖頂羊肚菌(M.conica)、黑脈羊肚菌、粗柄羊肚菌(M.cassipes)、羊肚菌(M.esculenta)和小羊肚菌(M.deliciosa))分類地位的準(zhǔn)確性；另外，它們也無進(jìn)一步的栽培報(bào)道或推廣應(yīng)用[4]。因此，可以判定除目前廣泛應(yīng)用的3個(gè)黑色羊肚菌類群(Elata clade)種類(梯棱羊肚菌(M.importuna)、六妹羊肚菌(M.sextelata)和七妹羊肚菌(M.eximia))以外，其他曾被報(bào)道的馴化研究種類很難借助當(dāng)前的栽培模式進(jìn)行人工栽培，或者不具有商業(yè)栽培價(jià)值[9,20]。除此之外，紅褐羊肚菌(M.rufobrunnea)也容易馴化出菇，美國和以色列的栽培研究均采用該菌種進(jìn)行[21-23]。杜習(xí)慧[24]研究指出，除梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌以外,Mel-6至Mel-10支系中的其他幾個(gè)菌種也可以栽培出菇。綜上可以初步確定，以當(dāng)前栽培模式為基礎(chǔ)的可栽培羊肚菌有7種，分別為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、頭絲羊肚菌(M.exuberans)、歐氏羊肚菌(M.owneri)、Mel-13和Mel-21，而生產(chǎn)中主要對(duì)前3種進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用。由此可以斷定，以外源營養(yǎng)袋為能量供給的羊肚菌大田栽培模式只適合于部分羊肚菌種類。因此，不要盲目將野生羊肚菌分離菌株和其他來源不明的菌株應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)。在大生產(chǎn)應(yīng)用之前，務(wù)必先確定推廣菌株的分類地位，明確其是否屬于目前適宜栽培的種類。

1.2 羊肚菌菌株身份識(shí)別方法

雖然構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹是羊肚菌物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)[15-19]，但采用單一的核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)序列分析即可準(zhǔn)確鑒定大多數(shù)羊肚菌種類，滿足栽培菌株身份識(shí)別的需要。但在羊肚菌分類鑒定的科研工作中，新種的鑒定必須整合形態(tài)特征、生理生化特征、多個(gè)保守基因序列分析等性狀進(jìn)行。目前，ITS序列擴(kuò)增和測序分析技術(shù)均已較成熟，本文將結(jié)合羊肚菌的特點(diǎn)闡述菌株身份識(shí)別方法：

1)菌絲體純培養(yǎng)。將活化培養(yǎng)的菌株菌絲塊接種于CYM(葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，蛋白胨 2 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.46 g，蒸餾水1000 mL，pH自然)或PD(土豆200 g煮汁，葡萄糖20 g，自來水1000 mL，pH自然)液體培養(yǎng)基中，于20～23 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，撈取菌絲體，用無菌水清洗2～3次，再用潔凈吸水紙吸干水分，-80 ℃保存?zhèn)溆没蛑苯邮褂谩?/p>

2)基因組DNA提取。加入液氮后，將菌絲體研磨成粉末；取約50～100 μL粉末，加入700 μL裂解液(CTAB 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，PVP 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，Tris-HCl 100 mmol/L，EDTA 20 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L)，于60～65 ℃條件下裂解20 min后，于12 000 r/min條件下離心10 min；上清液加入等體積的PCA(V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1)，顛倒混勻后于12 000 r/min條件下離心10 min；上清液加入等體積CA(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，顛倒混勻后于12 000 r/min條件下離心10 min；上清液加入1/10體積的乙酸鈉溶液(3 mol/L)，再加入2倍體積的無水乙醇，置于-20 ℃、30 min條件下沉淀基因組DNA；于12 000 r/min條件下離心5 min獲得基因組DNA，用1 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液清洗鹽離子后，再用含1%(體積分?jǐn)?shù))RNase A的TE緩沖液(Tris-HCl 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L)溶解基因組DNA，于37 ℃條件下水浴1 h以消解RNA，最終獲得高質(zhì)量基因組DNA母液。采用紫外分光光度計(jì)測定該母液質(zhì)量濃度，再稀釋為DNA質(zhì)量濃度為50 ng/μL的工作液，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

3)PCR擴(kuò)增。選擇ITS通用引物ITS1/ITS4(5′→3′，下同)：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)體系為：PCR Buffer 1×，MgCl21.50 mmol/L，dNTPs Mix 0.25 mmol/L，引物各0.25 μmol/L，rTaqDNA聚合酶 1.5 U，模板DNA 50 ng；或 PCR MIX 1×(包含dNTP、Mg2+、核酸染料)，引物各0.25 μmol/L，模板DNA 50 ng。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

4)測序分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后(黑色羊肚菌類群菌株條帶約800 bp，黃色羊肚菌類群菌株條帶約1200 bp)，直接送至測序公司進(jìn)行雙向測序。

5)數(shù)據(jù)庫比對(duì)。獲得測序結(jié)果后，檢測測序質(zhì)量，剔除兩端的低質(zhì)量堿基，拼接獲得完整的ITS序列；提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行blastn比對(duì)，初步確定樣品的分類地位。

(6)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。下載公開發(fā)表的參考ITS序列，使用MEGA、PAUP、MrBayes等軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定目標(biāo)菌株的分類地位。

2 羊肚菌菌株交配型基因測定

2.1 羊肚菌潛在栽培菌株交配型基因測定的必要性

同宗結(jié)合或異宗結(jié)合是羊肚菌的關(guān)鍵生活史類型[25]。交配型基因控制著真菌的性發(fā)育。子囊菌通常含有2種交配型位點(diǎn)(Mat1-1和Mat1-2)，根據(jù)這2種位點(diǎn)是否位于同一個(gè)細(xì)胞核，可以判定該物種的生活史類型;另外，在異宗結(jié)合真菌中,這2種位點(diǎn)也被用于代表不同的核相[26]。基礎(chǔ)研究[26-32]表明，梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等可栽培羊肚菌種類均屬于異宗結(jié)合生活史類型。異宗結(jié)合真菌在其生活史中需要不同交配型的初級(jí)菌絲融合形成具有2種交配型位點(diǎn)的次級(jí)菌絲方可出菇。雖然早期研究[3]及近年栽培實(shí)踐[26]均有羊肚菌單孢菌株出菇的案例，但檢測單孢菌株栽培出菇獲得的子囊果的交配型基因發(fā)現(xiàn)，單孢出菇實(shí)為“假性出菇”，其實(shí)質(zhì)是在種植過程中引入了互補(bǔ)交配型的核相[26]。劉萍等[33]研究指出，在一些梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌的子囊果標(biāo)本中可檢測到較小比例的異核體單孢子，同時(shí)含有2種交配型基因，即存在假同宗結(jié)合現(xiàn)象，可直接栽培出菇。然而，異核體單孢子群體所占比例較低，羊肚菌子囊果的單孢分離菌株群體大多仍只含1種交配型位點(diǎn)，即Mat1-1或Mat1-2[30]。

筆者檢測了來源于不同地區(qū)的3個(gè)梯棱羊肚菌、5個(gè)七妹羊肚菌和11個(gè)六妹羊肚菌菌株栽培出菇的子囊果和3個(gè)野生高羊肚菌的子囊果(共計(jì)22份樣品、24批次組織分離的348份分離物)的交配型基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其中151份分離物只檢測到1種交配型基因，整體交配型基因的缺失率為43.4%[11]。蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)交配型基因缺失會(huì)導(dǎo)致菌株生產(chǎn)性狀退化，造成不出菇[34]。當(dāng)前尚無有關(guān)羊肚菌菌株產(chǎn)量高低與交配型基因關(guān)系的研究報(bào)道。然而可以確定，將只含1種交配型的羊肚菌菌株直接用于生產(chǎn)存在風(fēng)險(xiǎn)。多孢分離是食用菌育種常用的技術(shù)手段。多孢分離物雖然能保證交配型基因的完整性，但發(fā)生減數(shù)分裂形成子囊孢子的萌發(fā)菌株的性狀分離明顯，將其作為育種材料是可行的，若直接用于生產(chǎn)則面臨性狀不一致的局面，不利于栽培的穩(wěn)定性[1]，因而建議仍采取組織分離技術(shù)獲得生產(chǎn)菌株。由于組織分離物存在較普遍的交配型缺失現(xiàn)象，因此必須對(duì)組織分離獲得的菌株(潛在生產(chǎn)菌株)進(jìn)行交配型基因測定，以確?；蛐偷耐暾?。

2.2 羊肚菌交配型基因測定方法

羊肚菌交配型基因的測定方法已有不少研究[26-29]，筆者主要闡述更適用于生產(chǎn)實(shí)踐的測定方法，即完成菌絲體培養(yǎng)和基因組DNA提取(見1.2)后，采用特異性引物擴(kuò)增交配型基因片段，從而確定菌株的交配型。

1)特異性引物。Mat1-1-1TF/R：AAAACGCTCTATCGCCACCA/TGCGAAGTTGCGTTTTCAGG；Mat1-2-1TF/R：ATGAAGGCTGTTCGCCAGAA/TGGTGCTCTCGTGCAGATTT。分別擴(kuò)增Mat1-1和Mat1-2基因，目的片段大小分別為412 bp和291 bp，可用于梯棱羊肚菌、七妹羊肚菌、六妹羊肚菌和Mel-21交配型基因的檢測。

2)PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同前文菌株身份識(shí)別方法中的PCR體系，或采用如下體系：PCR MIX 1×(包含dNTPs、Mg2+)，引物各0.25 μmol/L，模板DNA50 ng。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

3)電泳檢測和結(jié)果判斷。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，記錄擴(kuò)增條帶的有無和大小，若Mat1-1-1和Mat1-2-1片段大小正確且同時(shí)存在，則視為該菌株具有完整的基因型，否則視為某一種交配型缺失的菌株。

3 羊肚菌菌株老化和活力測定

3.1 羊肚菌菌株老化表現(xiàn)及菌株活力測定的必要性

相對(duì)于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和絲狀子囊菌鵝糞柄孢殼菌(Podosporaanserina)[35-37]，羊肚菌老化的相關(guān)研究較落后。筆者對(duì)高羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌和梯棱羊肚菌的老化進(jìn)行研究[12-13,38]發(fā)現(xiàn)，菌株老化是羊肚菌的普遍現(xiàn)象，但存在菌株特異性，多數(shù)菌株連續(xù)繼代培養(yǎng)20～30次(120 d以上)后，會(huì)表現(xiàn)出不可逆的老化死亡；但也存在極端情況，少數(shù)菌株連續(xù)繼代培養(yǎng)超過50次仍不死亡，也有少數(shù)菌株繼代培養(yǎng)5次以內(nèi)即發(fā)生老化死亡[38]。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，隨著老化程度的加劇，菌株的脂質(zhì)過氧化程度增強(qiáng)，菌核產(chǎn)生能力下降，色素形成嚴(yán)重，栽培產(chǎn)量持續(xù)下降，即老化菌株不可用于實(shí)際生產(chǎn)。羊肚菌老化菌株的整體表現(xiàn)一致：菌絲細(xì)弱，色素增強(qiáng)，線性生長速度下降，菌落邊緣不整齊；二級(jí)菌絲和主菌絲之間的夾角增大，菌核產(chǎn)生能力喪失，最終徹底死亡。羊肚菌菌株老化在麥粒-木屑-土壤栽培種培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)也會(huì)發(fā)生，在營養(yǎng)豐富的純麥粒培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)更為突出[12,38-40]。老化程度與菌絲多次傳代培養(yǎng)、不當(dāng)?shù)木昱囵B(yǎng)和保存條件、營養(yǎng)環(huán)境不匹配等有關(guān)[37]。雖然缺乏深入和系統(tǒng)研究，但目前的研究[38-40]表明羊肚菌菌株的老化機(jī)制與線粒體的活性密切相關(guān)。由于羊肚菌老化具有菌株依賴性，存在繼代培養(yǎng)數(shù)次即發(fā)生老化死亡的極端組織分離物，因此為避免易老化菌株用于生產(chǎn)帶來的嚴(yán)重產(chǎn)量損失，有必要對(duì)潛在生產(chǎn)菌株進(jìn)行活力測定。

3.2 羊肚菌菌株活力測定方法

目前，羊肚菌菌株活力評(píng)價(jià)的主要依據(jù)是培養(yǎng)特征。繼代培養(yǎng)是綜合評(píng)價(jià)羊肚菌菌株老化簡便、可靠的方法，能直觀反映初始菌株的壽命(總繼代培養(yǎng)時(shí)長和總生長距離)和活性狀態(tài)(菌絲長速、菌核、色素產(chǎn)生等)。

3.2.1 菌株繼代培養(yǎng)和培養(yǎng)特征觀察主要有如下幾方面。

1)培養(yǎng)基。CYM固體培養(yǎng)基。

2)大培養(yǎng)皿制作。將直徑為15 cm的大培養(yǎng)皿滅菌后，傾注40 mL CYM固體培養(yǎng)基，凝固備用。

3)接種與培養(yǎng)。在培養(yǎng)皿一側(cè)距邊緣1.5 cm處接種初始菌株菌絲塊，于23 ℃避光培養(yǎng)，每2 d在菌落前端劃線，記錄生長距離；當(dāng)菌落生長至距培養(yǎng)皿另一側(cè)約1 cm處時(shí)，用接種鉤或解剖刀取菌絲前端0.3 cm × 0.5 cm菌絲塊，按照菌絲生長方向置于新培養(yǎng)皿一側(cè)繼續(xù)第二輪培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，直至菌絲生長速度明顯下降或停止生長。每次轉(zhuǎn)接時(shí)保存一份斜面培養(yǎng)物用于后期形態(tài)觀察。以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，菌絲線性生長速度(mm/h)為縱坐標(biāo)，繪制菌株的菌絲生長曲線，計(jì)算菌株的總生長時(shí)長和總生長距離。

4)菌落形態(tài)和菌絲微觀特征觀察。將保存的不同世代菌株活化培養(yǎng)后接種于直徑9 cm、鋪有無菌玻璃紙的CYM培養(yǎng)皿中央，于23 ℃避光培養(yǎng)，記錄菌絲塊萌發(fā)時(shí)間，采用十字劃線法測量菌絲生長速度；培養(yǎng)3 d、7 d和14 d后分別記錄菌落形態(tài)、菌落邊緣整齊度、菌核數(shù)量、菌核形態(tài)、菌落顏色等培養(yǎng)特征；在培養(yǎng)3 d時(shí)使用體視顯微鏡直接觀察菌落前端菌絲的整齊程度，測量主菌絲與次菌絲分枝間的夾角。

3.2.2 菌株試驗(yàn)性栽培與常規(guī)食用菌不同，羊肚菌具有快速變異和老化的特性。在羊肚菌育種和菌株保藏技術(shù)完善前，對(duì)潛在生產(chǎn)菌株進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)性栽培是菌株活力評(píng)判的有效手段。試驗(yàn)性栽培多在規(guī)?；a(chǎn)前進(jìn)行，一般在溫控房、現(xiàn)代化菇房或高海拔低溫地區(qū)采用常規(guī)大田栽培、塑料盤或床架栽培方式進(jìn)行，每個(gè)菌株栽培面積不小于3 m2，且至少進(jìn)行3次隨機(jī)小區(qū)重復(fù)。試驗(yàn)性栽培技術(shù)和管理要求同規(guī)?；耘啵喘h(huán)境最高溫度低于20 ℃，光線可控，水分管理措施到位。觀察和記錄不同試驗(yàn)菌株的菌種萌發(fā)時(shí)間、菌絲蔓延情況、菌霜產(chǎn)生量、外源營養(yǎng)袋分解利用情況、抗雜能力、產(chǎn)生原基情況、原基分化程度、病蟲害發(fā)生情況等，比較各栽培菌株的綜合表現(xiàn)，挑選綜合表現(xiàn)理想的菌株用于規(guī)?；a(chǎn)。

3.2.3 健壯菌株的判別根據(jù)繼代培養(yǎng)和不同世代菌株的人工培養(yǎng)特征，健壯菌株的判別標(biāo)準(zhǔn)如下。

1)菌絲塊萌發(fā)早、菌絲生長速度快。菌絲塊一般在接種后6 h左右萌發(fā)；不同菌株的生長速度略有差異，23 ℃恒溫培養(yǎng)的菌株平均線性生長速度為0.5～0.7 mm/h。

2)菌絲長勢。菌落邊緣整齊，長勢強(qiáng)勁，有齊頭并進(jìn)之勢。

3)菌核產(chǎn)生。菌核產(chǎn)生均勻，初期為白色，培養(yǎng)14 d為輕微黃棕色；不產(chǎn)生菌核的菌株不宜用于規(guī)?；a(chǎn)[41]。

4)色素產(chǎn)生。菌落色素較輕或無色素；色素產(chǎn)生時(shí)間早且量大的菌株，老化程度較高，不宜用于生產(chǎn)。

5)菌絲微觀形態(tài)。主菌絲和二級(jí)菌絲分枝間的夾角小于30°。

6)總繼代培養(yǎng)時(shí)間?？偫^代培養(yǎng)時(shí)間大于100 d。

7)試驗(yàn)性栽培。菌種萌發(fā)快，在土壤中蔓延快，適度產(chǎn)生菌霜，外源營養(yǎng)袋分解利用徹底，抗雜能力強(qiáng)，能形成大量羊肚菌原基，部分原基有分化為幼菇的趨勢，對(duì)病蟲害抗性強(qiáng)。

4 實(shí)際應(yīng)用效果分析

應(yīng)用該評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)2019—2020產(chǎn)季6000余畝羊肚菌栽培菌株進(jìn)行了篩選和評(píng)估，結(jié)果顯示評(píng)估合格的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的原種和栽培種的質(zhì)量明顯提升，大田栽培67.6%的面積畝產(chǎn)超過150 kg(鮮菇，下同)，92%的面積畝產(chǎn)超過100 kg，只有小于2%的面積被判定為因菌種原因?qū)е庐€產(chǎn)不足50 kg。該評(píng)價(jià)體系在2020—2021產(chǎn)季應(yīng)用表現(xiàn)更加突出，大面積(約60%)畝產(chǎn)大于200 kg。與行業(yè)70%虧損的現(xiàn)狀相比，羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評(píng)價(jià)系統(tǒng)的應(yīng)用效果明顯，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

5 結(jié)論與展望

使用優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)菌株是羊肚菌栽培成功的關(guān)鍵。由于不同品種羊肚菌的生態(tài)習(xí)性不同，目前只有少數(shù)羊肚菌被成功馴化栽培。因此，在規(guī)模化生產(chǎn)推廣應(yīng)用前，應(yīng)采用ITS序列分析技術(shù)確定栽培菌株的分類地位，以確定是否屬于目前大規(guī)模推廣應(yīng)用的種類(如梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌)，不要盲目推廣應(yīng)用分類地位不明確的羊肚菌菌株。目前人工栽培的多數(shù)羊肚菌屬于異宗結(jié)合生活史類型，需要兩種不同交配型基因的細(xì)胞核共存才能完成完整的生活史。單孢分離物只包含1種交配型，且和多孢分離物一樣都存在性狀分離現(xiàn)象，可作為育種材料但不宜直接用于生產(chǎn)。獲得羊肚菌生產(chǎn)菌株還要以組織分離法為主。由于羊肚菌組織分離物存在一定比例的交配型丟失，因此要測定生產(chǎn)菌株的交配型，確保兩種交配型共存的菌株用于規(guī)?；a(chǎn)。羊肚菌菌株老化現(xiàn)象較突出，多數(shù)菌株在較短時(shí)間連續(xù)繼代培養(yǎng)即可發(fā)生不可逆的老化死亡，甚至存在繼代培養(yǎng)數(shù)代即老化死亡的極端組織分離物，因此有必要對(duì)擬推廣應(yīng)用的羊肚菌菌株進(jìn)行繼代培養(yǎng)試驗(yàn)，選擇不易老化和老化程度較弱的高活力菌株用于生產(chǎn)。本文基于多年的羊肚菌生物學(xué)研究和實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，提出了羊肚菌生產(chǎn)菌株栽培適宜性IMV評(píng)價(jià)系統(tǒng)，涉及菌株身份識(shí)別、交配型基因檢測、菌株活力測定等多項(xiàng)評(píng)價(jià)內(nèi)容，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用表現(xiàn)理想，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。今后應(yīng)強(qiáng)化羊肚菌老化檢測技術(shù)及老化分子機(jī)制研究，加強(qiáng)羊肚菌優(yōu)質(zhì)品種選育，規(guī)范和推廣菌株栽培適應(yīng)性評(píng)價(jià)技術(shù)應(yīng)用，以顯著提升羊肚菌人工栽培的穩(wěn)定性，促進(jìn)我國羊肚菌產(chǎn)業(yè)更好發(fā)展。