徐聶，曾永軍

0 引言

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著治療手段的不斷增多，患者的生存時(shí)間得到了明顯延長，但腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥仍然是臨床工作中面臨的巨大難題。越來越多的證據(jù)表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和其微環(huán)境相互作用的結(jié)果，腸癌干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥和轉(zhuǎn)移的主要觸發(fā)因素[1]。深入了解腸癌干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制、異質(zhì)性、特異性標(biāo)志物、信號通路以及它們與腸道微環(huán)境組分的相互聯(lián)系是提高結(jié)直腸癌治療效果的必要條件。因此，根除腸癌干細(xì)胞可能是結(jié)直腸癌新的治療方向。

1 腸癌干細(xì)胞的特性及演變

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤內(nèi)少量的具有惡性表型特征的未分化致瘤細(xì)胞。20世紀(jì)90年代科學(xué)家證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在[2]。腫瘤干細(xì)胞不斷積累突變，具有干細(xì)胞性、多藥耐藥、放射耐藥、凋亡耐藥、DNA修復(fù)等各種能力。因其具有對上皮組織進(jìn)行自我更新和分化克隆等獨(dú)特特征，故具有明顯的異質(zhì)性。

在人類結(jié)腸的每個(gè)隱窩中，只有4～6個(gè)具有無限增殖能力且能長時(shí)間存活的腸道干細(xì)胞（intestinal stem cells，ISCs），分布在腸上皮細(xì)胞中的兩個(gè)不同的干細(xì)胞池：活躍的腸干細(xì)胞和儲備的腸干細(xì)胞。前者位于隱窩基底膜，在完整條件下負(fù)責(zé)維持上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)，而后者能促進(jìn)損傷后上皮再生。這兩個(gè)細(xì)胞池可以相互轉(zhuǎn)化，從而保持?jǐn)?shù)量平衡。

研究發(fā)現(xiàn)，腸道干細(xì)胞是啟動腸癌細(xì)胞重要的細(xì)胞來源?；钴S的腸道干細(xì)胞使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換，通常由以下信號通路介導(dǎo)：Wnt/β-連環(huán)蛋白[3]、Ras/Raf/Mek/Erk/MAPK、Notch和ΒMP/Smad。APC誘導(dǎo)的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活被認(rèn)為是腸道干細(xì)胞引發(fā)腸道畸形的第一步。隨著P53功能的喪失，異常的ISCs數(shù)量明顯增加，表現(xiàn)出較差的分化能力[4]。同時(shí)，當(dāng)Smad4和Kras發(fā)生突變[5]時(shí)，這些細(xì)胞具有明顯的侵襲性。異常的Wnt信號壓倒性地驅(qū)動了腸癌細(xì)胞的發(fā)病程序。由于這些級聯(lián)反應(yīng)，正常的腸干細(xì)胞便轉(zhuǎn)化為腸癌干細(xì)胞（cancer stem cells,CSCs）。

另一方面，結(jié)直腸黏膜的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的正常轉(zhuǎn)化（EMT）可以使結(jié)直腸癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特征[6]。在EMT期間，緊密排列的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)為高侵襲性和運(yùn)動性，在腫瘤的侵襲、進(jìn)展和治療中起著關(guān)鍵作用[7]。

2 腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物

CSCs可以從一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)中被識別出來，如CD133、CD44、CD24、CD166和Lgr5[8]等。目前報(bào)道的所有CSCs標(biāo)志物都在具有腫瘤起始能力[9]的結(jié)腸癌細(xì)胞上共表達(dá)。在人類前列腺、腎臟、肝細(xì)胞[10]、結(jié)腸和胰腺癌中，相比CD133-的細(xì)胞而言，少量的CD133+細(xì)胞被證明有更高的致瘤和克隆潛能。然而，大多數(shù)關(guān)于CSCs標(biāo)志物在人類腫瘤中表達(dá)的爭議都集中在這一最常用的標(biāo)志物上。研究發(fā)現(xiàn)CD133+和CD133-的細(xì)胞在免疫缺陷小鼠中均能促進(jìn)腫瘤生長，認(rèn)為CD133不能作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌CSCs的標(biāo)志物，但沒有證據(jù)證明CD133-群體在原發(fā)腫瘤中的腫瘤起始能力，不能表明CD133的表達(dá)在原發(fā)腫瘤中與腫瘤干細(xì)胞群體無關(guān)，有可能原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤的CSCs之間存在區(qū)別。因此，盡管CD133不是一個(gè)完美的標(biāo)志物，但它已經(jīng)是識別、富集和分離各種腫瘤CSCs的最成功的標(biāo)志物之一。然而，并非所有的CSCs都具有相同的基因圖譜。結(jié)直腸CSCs的一些亞群有自己的標(biāo)志物，如CD26、CD110和含cub結(jié)構(gòu)域的蛋白-1（CDCP-1）[11]。這些結(jié)果表明，結(jié)直腸CSCs具有不同的基因譜，這是一個(gè)反映CSCs異質(zhì)性[12]的證據(jù)。

3 腫瘤微環(huán)境與腸癌干細(xì)胞的關(guān)系

在腫瘤進(jìn)展過程中，基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換并共同發(fā)展。一方面腫瘤細(xì)胞改變基質(zhì)的組成及性質(zhì)，另一方面形成適應(yīng)腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境（tumor microenvironment,TME），還為腫瘤細(xì)胞提供保護(hù)。腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞和非細(xì)胞元素之間存在著復(fù)雜和動態(tài)的相互作用。

腫瘤微環(huán)境中包含癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated fibroblasts,CAFs）、間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）、內(nèi)皮細(xì)胞、炎性反應(yīng)免疫細(xì)胞和組織細(xì)胞。這些非腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為可以保護(hù)CSCs免受抗腫瘤治療的影響。另外，腫瘤微環(huán)境中的各種成分，如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞外囊泡和自由基均互相應(yīng)答，互相交叉，如TGF-β、NF-κΒ、IL-6、IL-8以及缺氧等因素均在調(diào)節(jié)腸癌干細(xì)胞功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]。同時(shí)，微環(huán)境中的不同成分在細(xì)胞可塑性中起著關(guān)鍵作用?？伤苄允荰ME影響腫瘤復(fù)發(fā)的一個(gè)主要特征，可導(dǎo)致致瘤細(xì)胞和非致瘤細(xì)胞之間的可逆轉(zhuǎn)變?？伤苄员徽J(rèn)為是單周期治療不足、僅消除活躍CSCs而治療效果不佳的一個(gè)原因[14]，也叫作腫瘤干細(xì)胞的自主耐藥性[15]。Garza-Trevi?o等[16]發(fā)現(xiàn)，與HCT116高密度單培養(yǎng)相比，在高密度微環(huán)境共培養(yǎng)中，HCT116干細(xì)胞標(biāo)志物（CD133）的表達(dá)顯著增加，說明腫瘤微環(huán)境是刺激和支持腫瘤干細(xì)胞形成的主導(dǎo)因素。

3.1 缺氧

缺氧，作為腫瘤微環(huán)境的一個(gè)組成部分，被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展的主調(diào)節(jié)因子和驅(qū)動力，也是CSCs/TME相互作用的主要標(biāo)志。腫瘤干細(xì)胞可能位于腫瘤微環(huán)境的缺氧區(qū)，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor,HIF）與腫瘤干細(xì)胞的存活有關(guān)[17]。miR210是抑制DNA修復(fù)的重要調(diào)控因子，其表達(dá)受到HIF1α的直接調(diào)控，并促進(jìn)常氧基因mRNA的降解。敲除miR210可抑制缺氧誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的自我更新能力和抗性。miR210和HIF1α在多種腫瘤中正相關(guān)，而miR126和HIF1α在結(jié)腸癌中顯著負(fù)相關(guān)，提示它們的表達(dá)可用于腫瘤的早期診斷和篩查[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，包括Wnt和Notch通路在內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞信號通路在缺氧的微環(huán)境中被激活[1]。此外，在微環(huán)境中，CSCs能表達(dá)高水平的程序性死亡配體1（programmed death ligand 1,PD-L1），該配體與程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1,PD-1）結(jié)合抑制T細(xì)胞的功能。腫瘤干細(xì)胞還能向TME分泌多種細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-4、IL-10和IL-13，對免疫細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，從而獲得免疫逃逸[10]。

3.2 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞

活化的成纖維細(xì)胞在腫瘤內(nèi)受細(xì)胞因子和趨化因子的刺激，被稱為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）[19]。CAFs是腫瘤微環(huán)境中顯示異質(zhì)性和復(fù)雜性的主要組成部分。在腫瘤微環(huán)境中，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞已被證明在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮多種作用[20]。研究表明，CAFs可分泌多種可溶性信號因子，誘導(dǎo)多種表型，如增強(qiáng)細(xì)胞增殖、改變代謝、增加細(xì)胞運(yùn)動性、上調(diào)鄰近腫瘤細(xì)胞的血管生成以及其他基質(zhì)細(xì)胞類型的調(diào)控[21]。

CAFs能激活Hedgehog（Hh）干細(xì)胞信號通路，Hh也是腫瘤干細(xì)胞在微環(huán)境中的另一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。特別是CD10+癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中[22]，CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞分別在體內(nèi)外與初級CD10成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)，與CD10-成纖維細(xì)胞相比，CD10+成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)顯著提高了CD133+細(xì)胞的致瘤能力和侵襲性。

3.3 微環(huán)境中EMT介導(dǎo)的腸癌干細(xì)胞

腫瘤微環(huán)境中的各種因素能促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞形成，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是侵襲轉(zhuǎn)移的先導(dǎo)機(jī)制[23]。EMT能誘導(dǎo)癌細(xì)胞具有侵襲和轉(zhuǎn)移性，也被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞形成的觸發(fā)因素。其過程包括下調(diào)細(xì)胞黏附分子等鈣黏蛋白，同時(shí)促進(jìn)N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白、鋅指蛋白（SNAIL、Slug、ZEΒ）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更大的細(xì)胞流動性和惡性特征。

整個(gè)EMT過程主要受到TGF-β調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一種多功能多肽，在正常組織的分化、增殖和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。組織細(xì)胞合成并分泌TGF-β進(jìn)入微環(huán)境，與特定的受體結(jié)合，進(jìn)行旁分泌和自分泌信號傳遞。這種配體和受體復(fù)合物刺激細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)，包括典型的Smad2信號通路，它與Smad4形成復(fù)合物，在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄，并最終調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和組織修復(fù)[24]。

在口腔癌中，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化對于獲得干細(xì)胞特性至關(guān)重要。Zubeldia[25]等用TGF-β1轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌干細(xì)胞，顯示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有α-平滑肌肌動蛋白的強(qiáng)信號，該肌動蛋白是EMT表型的標(biāo)志物。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)TGF-β1能誘導(dǎo)結(jié)腸癌中Twist1的激活，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本中TGF-β1的表達(dá)較高，TGF-β1 mRNA的表達(dá)與Twist1正相關(guān)，而Twist正是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的調(diào)節(jié)因子，在乳腺癌、前列腺癌和皮膚癌中高表達(dá)。

3.4 炎性反應(yīng)免疫細(xì)胞

炎性反應(yīng)免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞成分。炎性反應(yīng)免疫細(xì)胞由CAFs和癌細(xì)胞分泌的趨化因子和細(xì)胞因子所招募。大量證據(jù)表明，阿司匹林（環(huán)氧化酶抑制劑）和其他傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥可以降低結(jié)腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[27]。炎性腸病與結(jié)腸癌的關(guān)系可能是微環(huán)境中炎性反應(yīng)對細(xì)胞的刺激作用所致[28]。炎性腸病中持續(xù)的黏膜炎性反應(yīng)和其他相關(guān)因素，如黏膜破裂和腸道微生物群，可促進(jìn)胃腸道的細(xì)胞變化為癌前細(xì)胞，并最終形成腸癌干細(xì)胞，其機(jī)制可能是COX酶通過抑制β-連環(huán)蛋白降解驅(qū)動前列腺素E2，并作為介導(dǎo)Wnt通路的信號。

3.5 微環(huán)境中的血管生成

CSCs的自我更新和腫瘤的啟動伴隨著促血管生成因子的分泌如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[29]來促進(jìn)血管生成。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)結(jié)腸癌干細(xì)胞預(yù)處理的SW480細(xì)胞培養(yǎng)后，能增強(qiáng)HUVEC管的形成，VEGFA表達(dá)明顯升高[30]。使用TGF-β1干預(yù)結(jié)腸癌干細(xì)胞在體外顯示出更高的血管密度，而小鼠轉(zhuǎn)染這些TGF-β1陽性細(xì)胞導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞高表達(dá)，表明TGF-β1誘導(dǎo)血管生成[31]。這些證據(jù)表明，TGF-β在結(jié)腸癌干細(xì)胞血管生成的起始過程中起著關(guān)鍵作用。

4 腫瘤微環(huán)境靶向治療策略

目前腸癌干細(xì)胞被認(rèn)為是治療耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因，了解腫瘤微環(huán)境中腫瘤干細(xì)胞和其他成分之間的聯(lián)系，可能是抑制CSCs生長潛能的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。因此，為了制定新的腸癌治療策略，有必要更詳細(xì)地研究腸癌干細(xì)胞與微環(huán)境中各個(gè)成分的相互作用，以闡明其發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)機(jī)制。

4.1 上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的阻斷

EMT不僅能誘導(dǎo)癌細(xì)胞獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性，還能使癌細(xì)胞獲得耐藥性，使治療方法復(fù)雜化。其根本機(jī)制是觸發(fā)了結(jié)腸癌干細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)，或使休眠干細(xì)胞轉(zhuǎn)為活躍，這可能就是EMT、CSCs和耐藥性之間的關(guān)聯(lián)。靶向EMT通路可能是一種很有前途的治療策略。Qi等[32]已經(jīng)證明了Dickkopf-1（Dkk1）可以作為一種Wnt信號抑制劑逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌中的EMT。在217例結(jié)腸癌患者中，發(fā)現(xiàn)Dkk1的表達(dá)與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)負(fù)相關(guān)；Dkk1陽性樣本比陰性樣本能更高地表達(dá)上皮標(biāo)記E-鈣黏蛋白，降低間充質(zhì)標(biāo)記波形蛋白和細(xì)胞質(zhì)分布，表明Dkk1在結(jié)腸癌可能減少間充質(zhì)化，能使EMT過程逆轉(zhuǎn)，因此可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

4.2 調(diào)控癌相關(guān)成纖維細(xì)胞

TGF-β、Hh等多個(gè)信號通路參與不同來源細(xì)胞的CAF激活，靶向這些信號通路可能是調(diào)控癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的重要途徑。TGF-β被認(rèn)為是CAF分化、激活和擴(kuò)張的主要中介物。TGF-β及其家族成員激活TGF-βR1受體，而TGF-βR1受體進(jìn)而磷酸化Smad2/3，形成核易位的Smad2/3/4復(fù)合物，這些復(fù)合物通過與轉(zhuǎn)錄因子、共激活因子等信號通路合作，負(fù)責(zé)靶基因的表達(dá)。另外，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞不僅可以分泌多種細(xì)胞因子或代謝產(chǎn)物抑制免疫細(xì)胞的功能，還能塑造腫瘤外基質(zhì)，形成藥物或免疫細(xì)胞滲透屏障，阻止藥物和免疫細(xì)胞向腫瘤組織滲透。Colangelo等[33]報(bào)道使用抗纖維化藥物或多靶向藥物可使CAFs逆轉(zhuǎn)為正常成纖維細(xì)胞。通過調(diào)控癌相關(guān)成纖維細(xì)胞或克服其屏障作用可能是腫瘤治療的新手段。

4.3 微環(huán)境中血管生成的干預(yù)

證據(jù)表明，腸癌干細(xì)胞可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而產(chǎn)生腫瘤所需的血管系統(tǒng)。異常的血管系統(tǒng)能夠阻礙腫瘤的免疫反應(yīng)以及氧氣和化療藥物的運(yùn)輸和分配，這種惡劣的腫瘤微環(huán)境也可以導(dǎo)致對放化療耐藥[34]。另一方面，抗血管生成藥物易誘導(dǎo)腫瘤缺氧，使CSCs存活和傳播，從而推動腫瘤進(jìn)展，所以目前臨床上使用的VEGF靶向藥物對腫瘤患者的生存獲益有限。由于CSCs是微環(huán)境中VEGF的主要來源，因此特異性地靶向CSCs或干細(xì)胞來源的VEGF可能是有效的?？梢?，更好地了解CSCs與腫瘤血管生成之間的關(guān)系是研究血管生成靶向藥物的新途徑。

4.4 天然植物化學(xué)物質(zhì)作為CSCs靶向的抗癌藥物

近年來，一些天然植物化學(xué)物質(zhì)，比如姜黃素、白藜蘆醇、環(huán)巴胺、胡椒堿等均被報(bào)道能針對腸癌干細(xì)胞的活性。Sankpal等[35]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過影響核因子κΒ（NF-κΒ）進(jìn)入細(xì)胞核，抑制微環(huán)境中成纖維細(xì)胞和結(jié)腸CSCs之間的連接，并使腸癌干細(xì)胞對5-Fu敏感。白藜蘆醇是一種多酚類化合物，存在于許多植物物種中，如葡萄、花生和漿果中[36]，研究發(fā)現(xiàn)其對胰腺癌干細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化均有潛在的抑制作用。因此，開發(fā)天然植物化學(xué)物質(zhì)并探討其作用機(jī)制，是針對腫瘤干細(xì)胞治療的另一重要途徑。

5 結(jié)語

結(jié)直腸癌的生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移可能取決于腫瘤干細(xì)胞及其微環(huán)境，腫瘤干細(xì)胞需要與微環(huán)境相互作用才能生存，微環(huán)境的組成可能影響患者對治療的反應(yīng)，因此，結(jié)直腸癌的治療不僅要針對腸癌干細(xì)胞，還需要針對腫瘤微環(huán)境及其成分，但腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞和非細(xì)胞成分間存在著復(fù)雜的動態(tài)平衡，深入了解其作用機(jī)制，尋找合適的生物標(biāo)志物，如何通過精準(zhǔn)靶向來提高結(jié)直腸癌的療效是我們面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。