俞岑明 石佑萌 劉怡 邰國梅

復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）預(yù)后不良的主要原因，腦轉(zhuǎn)移是NSCLC 發(fā)生轉(zhuǎn)移的常見部位，發(fā)生率可達25%～35%，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因，早期診斷NSCLC 腦轉(zhuǎn)移對于治療與改善預(yù)后具有重要意義［1］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在調(diào)節(jié)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，LncRNA 通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，促進腫瘤生長與轉(zhuǎn)移［2］。LncRNA MALAT1在膀胱癌、乳腺癌、顱內(nèi)動脈瘤等腫瘤中高表達，且與顱內(nèi)動脈瘤血管內(nèi)治療后復(fù)發(fā)有關(guān)［3］。已有報道顯示，LncRNA MALAT1發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的患者肺癌組織中表達水平顯著高于沒有發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者的肺癌組織，且與患者預(yù)后有關(guān)，體外研究顯示，LncRNA MALAT1通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進肺癌的腦轉(zhuǎn)移［4］。病理學(xué)與影像學(xué)診斷NSCLC 的轉(zhuǎn)移具有一定的創(chuàng)傷性，血清標(biāo)志物可有效避免此項缺陷［5］。本研究探討血清LncRNA MALAT1對NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的診斷價值，以期為NSCLC 的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年6 月至2021 年9 月南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的100 例NSCLC 患者作為觀察對象，其中男58 例，女42 例，平均年齡（62.20±10.70）歲，其中發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者34 例（腦轉(zhuǎn)移組）與未發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者66 例（非腦轉(zhuǎn)移組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理診斷為原發(fā)性NSCLC；②初次確診；③患者臨床資料完整。腦轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：出現(xiàn)顱高壓癥狀如頭痛、惡心及嘔吐等，運動、感覺、視力及認(rèn)知功能障礙，局灶性無力、語言缺失、注意力下降等，有一種或同時出現(xiàn)幾個癥狀，經(jīng)頭部CT 或MRI 檢查提示腦轉(zhuǎn)移者，無癥狀者由2 名以上腫瘤?？漆t(yī)生根據(jù)CT 或MRI 確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其部位原發(fā)性惡性腫瘤患者；②合并支氣管擴張等其他呼吸系統(tǒng)疾病患者；③血液系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病患者；④妊娠哺乳期女性。選擇同期在本院健康體檢人員50 名作為對照組，其中男28名，女22 名，平均年齡（61.50±10.20）歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 研究方法

實時熒光定量PCR 法（Real-time quantification PCR，RT-qPCR）檢測血清LncRNA MALAT1表達：采集患者入院時空腹靜脈血5 mL，以3 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min 后（離心半徑10 cm），分離血清-80℃保存待測，采用qRT-PCR 實驗檢測血清LncRNA MALAT1表達水平，RNA 提取試劑（R0016，上海碧云天生物科技有限公司）提取血清總RNA，分析RNA 濃度與純度后，取2 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進行PCR 反應(yīng)，其中逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒（D7168M）、SYBR Green qPCR Mix 試劑（D7260）均購自上海碧云天生物科技有限公司，LncRNA MALAT1及GAPDH 引物購自上海生工生物工程有限公司，LncRNA MALAT1上游引物（5′-3′）：GACGGAGGTTGAGATGAAGC，下游引物（5′-3′）：ATTCGGGGCTCTGTAGTCCT；GAPDH 上游引物（5′-3′）：AACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAA，下游引物（5′-3′）GCATCAGCAGAGGG GGCAGAG。反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA MALAT1相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計分析；實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料使用n（%）表示，組間比較行卡方檢驗；ROC 曲線分析血清LncRNA MALAT1對NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值；Cox 回歸模型分析影響NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦轉(zhuǎn)移組與非腦轉(zhuǎn)移組NSCLC 患者臨床資料比較

腦轉(zhuǎn)移組有吸煙史、病理類型為腺癌、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ及有EGR突變的患者比例顯著高于非腦轉(zhuǎn)移組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移組患者年齡、性別、腫瘤直徑比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移組NSCLC 患者臨床資料比較［n（%）］Table 1 Comparison of clinical data of NSCLC patients with brain metastases and non-brain metastases［n（%）］

2.2 對照組、腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移NSCLC 患者血清LncRNA MALAT1 表達水平比較

與對照組比較，腦轉(zhuǎn)移組與非腦轉(zhuǎn)移組患者血清LncRNA MALAT1表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=30.912，、21.718，均P＜0.001）；與非腦轉(zhuǎn)移組比較，腦轉(zhuǎn)移組患者血清LncRNA MALAT1表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=30.912、21.718，均P＜0.001）。見表2。

表2 對照組、腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移NSCLC 患者血清LncRNA MALAT1 表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum LncRNA MALAT1 expression levels in control group，brain metastases and non-brain metastases NSCLC patients（±s）

表2 對照組、腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移NSCLC 患者血清LncRNA MALAT1 表達水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum LncRNA MALAT1 expression levels in control group，brain metastases and non-brain metastases NSCLC patients（±s）

注：與對照組比較，aP 均＜0.05；與非腦轉(zhuǎn)移組比較，bP＜0.05。

組別對照組非腦轉(zhuǎn)移組腦轉(zhuǎn)移組F 值P 值n 50 66 34 LncRNA MALAT1 1.01±0.15 1.97±0.32a 2.63±0.51ab 254.276 0.000

2.3 血清LncRNA MALAT1 對NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

血清LncRNA MALAT1預(yù)測NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.879（95%CI：0.826～0.921，P＜0.001），截斷值為2.28，敏感度為0.84，特異性為0.83。見圖1。

圖1 預(yù)測價值Figure 1 Predictive value

2.4 影響NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移Cox 回歸分析

以NSCLC 患者是否發(fā)生腦轉(zhuǎn)移為因變量（是=1，否=0），將表1 中有差異變量帶入Cox 回歸模型，賦值，吸煙史（有=1，無=0）、病理類型（腺癌=1，鱗癌=0）、TNM 分期（Ⅲ+Ⅳ期=1，Ⅰ+Ⅱ期=0）、EGR突變（是=1，否=0）、LncRNA MALAT1（≥2.28=1，＜2.28=0）Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示，病理類型為腺癌、TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期、EGR突變、LncRNA MALAT1≥2.28 是影響NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移Cox 回歸分析Table 3 Cox regression analysis of brain metastases affecting NSCLC patients

3 討論

發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者預(yù)后較差，尋找發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素對于改善患者預(yù)后具有重要意義［7］。研究表明，LncRNA 的異常表達與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，LncRNA 可在外周血、組織液中穩(wěn)定表達，成為腫瘤早期鑒別診斷、預(yù)后評估的標(biāo)志物［8］。LncRNA MALAT1與糖尿病、冠心病、肺動脈高壓、阿爾茨海默病、膿毒癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9］。研究證實，LncRNA MALAT1在NSCLC 細(xì)胞中表達水平升高，抑制LncRNA MALAT1表達可通過調(diào)控miR-125a-5p 及其靶基因Rab25 表達，抑制肺癌細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥能力［10］。肺癌細(xì)胞中，抑制LncRNA MALAT1表達可通過調(diào)控miR-205表達，抑制肺癌細(xì)胞的增殖與遷移，還可抑制肺癌荷瘤小鼠腫瘤的生長［11］。本研究檢測NSCLC 患者血清中LncRNA MALAT1表達，結(jié)果顯示，腦轉(zhuǎn)移組與非腦轉(zhuǎn)移組患者血清LncRNA MALAT1表達水平顯著高于對照組，且腦轉(zhuǎn)移組患者血清LncRNA MALAT1表達水平顯高于非腦轉(zhuǎn)移組，提示LncRNA MALAT1高表達與NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能成為預(yù)測NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。已有報道顯示，外周血LncRNA MALAT1對NSCLC 有一定診斷價值，血清中LncRNA MALAT1檢測綜合診斷效能高于血漿，且在肺鱗癌中的診斷效能優(yōu)于腺癌［12］。本研究通過ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA MALAT1預(yù)測NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.879，截斷值為2.28，敏感度為0.84，特異性為0.83，提示檢測血清LncRNA MALAT1水平在臨床上對NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的診斷具有一定指導(dǎo)意義。

肺腺癌是NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素，肺腺癌主要以浸潤式生長為主，發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性較大，已有研究顯示，腺癌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的概率較高［13］。EGFR 突變是NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的另一個危險因素，EGFR 在調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用，NSCLC患者腫瘤組織存在EGFR 突變，且多見于女性、無吸煙史、肺腺癌患者［14］。另有研究顯示，年齡、性別、吸煙史等也與NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移有關(guān)［15］。本研究經(jīng)Cox 多因素回歸分析結(jié)果顯示，病理類型為腺癌、TNM 分期Ⅲ+Ⅳ期、EGR突變是影響NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素，與以往報道結(jié)果類似。本研究經(jīng)Cox 回歸分析還顯示，LncRNA MALAT1≥2.28是影響NSCLC患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素，推測其可能的原因是LncRNA MALAT1調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移有關(guān)［16］。

綜上所述，NSCLC 發(fā)生腦轉(zhuǎn)移患者血清LncRNA MALAT1表達水平升高，是影響NSCLC 患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的危險因素，可能成為預(yù)測NSCLC患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的輔助標(biāo)志物，具有一定臨床應(yīng)用價值。