潘平安 張宏彬 黃永華 韓 廈 陳 威 李 錚

（1 上海交通大學(xué)制冷與低溫工程研究所 上海 200240；2 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科中心男科 男性健康評(píng)估中心 上海 200080）

生物樣本的低溫凍存是指通過降低溫度的方式抑制細(xì)胞代謝活動(dòng)，實(shí)現(xiàn)樣品長(zhǎng)期保存，并在需要時(shí)復(fù)溫解凍樣本，使其恢復(fù)到正常生理狀態(tài)的技術(shù)。低溫凍存技術(shù)的出現(xiàn)，消除了獲取和使用生物樣本之間的時(shí)間、空間差距[1-2]，緩解了生物樣本在輔助生殖、干細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的供需矛盾[3]，在推進(jìn)臨床醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)等學(xué)科發(fā)展的同時(shí)，也創(chuàng)造了可觀的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。以輔助生殖為例，精子、卵母細(xì)胞等人類配子的成功凍存成為不孕不育輔助生殖治療的重要手段，有效緩解了全球范圍內(nèi)因人類不孕率升高所帶來的各類社會(huì)問題[4]，其全球市場(chǎng)價(jià)值預(yù)計(jì)在2025年超過454億美元[5]。在細(xì)胞低溫凍存過程中，冰晶生長(zhǎng)被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡的主要影響因素之一[6]。冰晶生長(zhǎng)造成的冷凍損傷主要可分為兩類[7-9]：1）胞內(nèi)冰晶損傷，在快速降溫過程中，細(xì)胞外溶液生成的冰晶尖端刺破細(xì)胞膜造成機(jī)械損傷；2）溶質(zhì)損傷，在緩慢降溫過程中，由于細(xì)胞內(nèi)外溶液的凝固溫度不同，細(xì)胞外溶液因水分結(jié)晶濃度增大而產(chǎn)生較大的內(nèi)外滲透壓，使細(xì)胞膜發(fā)生破裂。因此，對(duì)細(xì)胞凍存技術(shù)而言，通過研究細(xì)胞內(nèi)外冰晶的生長(zhǎng)特性從而降低冷凍損傷尤為重要。

配子凍存操作通常將細(xì)胞置于冷凍保護(hù)劑溶液中，以液滴或冷凍麥管的形式進(jìn)行冷凍保存，因此必然涉及水、冷凍保護(hù)劑及細(xì)胞內(nèi)液的冰晶生長(zhǎng)過程。為深入研究冰晶生長(zhǎng)機(jī)制，研究者們利用各種類型的生物低溫顯微鏡系統(tǒng)，對(duì)不同細(xì)胞的冷凍過程進(jìn)行了可視化實(shí)驗(yàn)研究。K. R. Diller等[10-11]研制了早期的生物低溫顯微鏡系統(tǒng)，以低溫氮?dú)鉃槔湓?，樣品冷卻速率約達(dá)100 ℃/min；K. R. Diller等[12-14]還利用該系統(tǒng)觀察了兔腎皮質(zhì)細(xì)胞、人體紅細(xì)胞凍結(jié)過程中的胞內(nèi)結(jié)晶現(xiàn)象。孫仲秋等[15]開發(fā)了類似的系統(tǒng)并研究了降溫及復(fù)溫速率對(duì)奶牛胚胎存活率的影響。郝保同等[16]研制了用于觀察方向性冰晶的定向固化冷凍平臺(tái)，并用顯微鏡觀察了不同濃度MeSO2低溫保護(hù)劑在不同降溫速率下的冰晶生長(zhǎng)情況。T. Buttersack 等[17]利用聲波懸浮裝置，觀察了不同過冷度時(shí)純水液滴凍結(jié)時(shí)樹枝狀冰的生長(zhǎng)過程并對(duì)其進(jìn)行了參數(shù)化研究。A. A. Shibkov等[19]結(jié)合冰晶生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，研究了過冷純水薄層的冰晶生長(zhǎng)過程中冰晶尖端生長(zhǎng)速率、半徑等主要特征參數(shù)的變化情況。

上述研究中的冷卻速度通常無法達(dá)到大于等于1 000 ℃/min的快速冷凍條件，且在同等工況下，對(duì)某種冷凍保護(hù)劑與純水冰晶形成規(guī)律的對(duì)比研究較少。

本文研制了基于瞬態(tài)接觸法的快速冷凍新型低溫顯微成像系統(tǒng)，對(duì)純水、二甲基亞砜（DMSO）溶液分別以平板面自由液滴和模擬凍存管槽道內(nèi)冰晶生長(zhǎng)特征進(jìn)行了可視化研究，并對(duì)比了鼠生精小管在純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% DMSO溶液中的冰晶形成特性。

1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)及控溫方法

1.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

考慮到生殖細(xì)胞實(shí)際凍存過程中樣本通常以液滴和凍存管形式凍存，設(shè)計(jì)了圖1中的部件11薄片載物臺(tái)。該載物臺(tái)為藍(lán)寶石玻璃材質(zhì)，低溫下的導(dǎo)熱系數(shù)在600 W/（m·K）以上，上表面布置了直徑為2 mm和0.5 mm的兩條半圓管槽來模擬凍存管環(huán)境；另一個(gè)側(cè)邊槽用于嵌接熱電偶溫度計(jì)。載物臺(tái)密封壓接在環(huán)境艙底部中心處，其底面相比環(huán)境艙底面微凸0.1 mm，使得在接觸瞬間來自液氮熱沉的冷量可以集中傳遞到載物臺(tái)而不是環(huán)境倉底面。

1 氣浮隔震平臺(tái)；2 數(shù)據(jù)采集儀；3 控制計(jì)算機(jī)；4 相機(jī);5 金相顯微鏡；6 真空泵；7 步進(jìn)電機(jī)；8 真空腔體；9 環(huán)境艙;10 液氮熱沉；11 藍(lán)寶石載物臺(tái)。圖1 基于瞬態(tài)接觸法的新型低溫顯微成像系統(tǒng)Fig.1 A new cryomicroscopy system based on the instant contact method

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)主要由溫度測(cè)量系統(tǒng)、壓力測(cè)控系統(tǒng)和顯微成像系統(tǒng)組成。溫度測(cè)量系統(tǒng)主要包含精度為0.1 K的TT-36-T型熱電偶溫度傳感器（頭部直徑約為0.5 mm）、Keithley 2700六位半數(shù)據(jù)采集儀以及基于LabVIEW環(huán)境搭建的采集程序。壓力測(cè)控系統(tǒng)通過執(zhí)行機(jī)構(gòu)和設(shè)置的應(yīng)變片（位于圖1中部件7和部件9之間）形成負(fù)反饋PID控制載物臺(tái)與液氮熱沉之間的壓強(qiáng)。顯微成像系統(tǒng)主要包括光學(xué)顯微鏡和CCD相機(jī)兩部分，光學(xué)金相顯微鏡的最高放大倍率為50倍，高速工業(yè)相機(jī)有效像素為130萬，最高分辨率為1 280×1 024、幀率為211幀/s。

1.2 控溫方法

上述低溫顯微成像系統(tǒng)主要通過控制環(huán)境艙底部載物臺(tái)與液氮熱沉之間的壓強(qiáng)來控制樣品的降溫速率。不同壓強(qiáng)條件下載物臺(tái)的降溫曲線如圖2所示（對(duì)應(yīng)壓力分別為150、100、50 N）。在室溫220～300 K這一跨越液體結(jié)冰點(diǎn)的關(guān)鍵溫度區(qū)間內(nèi)，當(dāng)壓強(qiáng)超過3.2×105Pa時(shí)，載物臺(tái)的降溫速率平均約達(dá)1 600 K/min，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)流型相關(guān)設(shè)備或?qū)嶒?yàn)臺(tái)數(shù)據(jù)[19-23]，克服了對(duì)流型設(shè)備在冷卻初期液氮進(jìn)入載物臺(tái)前受熱汽化，攜帶冷量小的問題。而冷凍操作啟動(dòng)的最初幾秒時(shí)間正是影響冷卻效果最關(guān)鍵的部分。由圖2可知，載物臺(tái)在60 s內(nèi)溫度可降至約100 K；當(dāng)壓強(qiáng)減小后，載物臺(tái)的降溫速率減小。

圖2 不同壓強(qiáng)條件下載物臺(tái)的降溫曲線Fig.2 Cooling rates of the stage under different pressures

2 結(jié)果與分析

基于上述瞬態(tài)接觸法低溫顯微成像系統(tǒng)，開展了自由平板面和半圓管內(nèi)純水、DMSO溶液液滴在不同液滴直徑、液滴過冷度條件下的冰晶生長(zhǎng)過程特性可視化研究。

2.1 平板面純水及DMSO溶液過冷液滴冰晶生長(zhǎng)

純水液滴的凍結(jié)一般可分為兩個(gè)階段[24-26]，第一階段由于液體過冷狀態(tài)不穩(wěn)定，冰晶的凍結(jié)前端會(huì)產(chǎn)生一些小的隆起并不斷發(fā)展形成樹枝狀冰網(wǎng)，該階段持續(xù)時(shí)間非常短，當(dāng)冰網(wǎng)最終布滿整個(gè)液滴時(shí)進(jìn)入第二階段，第二階段中冰網(wǎng)間隙剩余的液態(tài)水繼續(xù)凍結(jié)，整個(gè)過程由相對(duì)穩(wěn)定的傳熱主導(dǎo)，可視為持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的準(zhǔn)等溫過程。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)捕捉到的一個(gè)直徑為2 mm純水（雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10 mg/kg）液滴的典型凍結(jié)過程如圖3所示。拍攝圖像中的亮斑是由于液滴凸面反射光源形成，通過對(duì)比0 ms和33 ms的瞬時(shí)圖像可知，液滴整體亮度瞬間發(fā)生顯著變化。這是由于樹枝狀冰網(wǎng)的產(chǎn)生改變了冰水混合物的折射率及密度，被樹枝狀冰網(wǎng)覆蓋的區(qū)域在視覺上呈現(xiàn)出變暗的特點(diǎn)，此時(shí)液滴內(nèi)已經(jīng)形成較為完整的樹枝狀冰網(wǎng)，而這一過程僅發(fā)生在33 ms內(nèi)。

圖3 直徑為2 mm純水液滴凍結(jié)過程Fig.3 Freezing process of a pure water droplet with 2 mm diameter

圖3中132 ms時(shí)已經(jīng)可以看到清晰的凍結(jié)前端由外向內(nèi)的推進(jìn)過程。該由外向內(nèi)的凍結(jié)過程指的并不僅是水平方向從液體邊緣到液體中心，事實(shí)上，由于局限于單一的俯視觀測(cè)方向，實(shí)驗(yàn)僅能觀察到液滴投影范圍內(nèi)的明暗變化，而實(shí)際是水平和垂直兩個(gè)維度的特征疊加。理論上，凍結(jié)過程應(yīng)該是由熱通量的負(fù)方向即液滴底面與載物臺(tái)接觸的部分開始向液滴頂部進(jìn)行。圖3中167 ms時(shí)凍結(jié)的第二階段已經(jīng)完成，從此角度觀察并未發(fā)現(xiàn)液體邊緣凍結(jié)前后的位移變化，故推測(cè)液滴凍結(jié)時(shí)體積的膨脹主要發(fā)生在垂直方向，期間液滴的表面張力起到了關(guān)鍵作用。

對(duì)3種不同直徑（2、3、4 mm）的純水液滴在不同過冷度條件下進(jìn)行了凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，冰晶生長(zhǎng)的平均速率（定義為單位時(shí)間內(nèi)冰晶邊緣移動(dòng)的位移）如圖4所示。由圖4可知，3個(gè)直徑規(guī)格的純水液滴冰晶平均生長(zhǎng)速率均隨過冷度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，且均在15～20 ℃的過冷度范圍內(nèi)達(dá)到最大值。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是由于純水的黏度隨溫度的降低而增加，在-15 ℃時(shí)其黏度已達(dá)到0 ℃時(shí)的3倍，黏度的增加在一定程度上阻礙了剩余水分子的移動(dòng)，從而導(dǎo)致冰晶生長(zhǎng)速率變緩。

圖4 純水液滴在不同過冷度條件下的冰晶生長(zhǎng)速率Fig.4 Ice formation rates of pure water droplets under different degree of subcooling conditions

不同直徑純水液滴的冰晶平均生長(zhǎng)速率差異顯著，總體上在一定直徑范圍內(nèi)冰晶生長(zhǎng)速率隨液滴直徑的減小顯著提升。從傳熱學(xué)角度分析可得：當(dāng)液滴直徑較小時(shí)，凍結(jié)過程由導(dǎo)熱主導(dǎo)，可近似于一維固化過程。當(dāng)忽略液滴與周圍氣體的自然對(duì)流換熱時(shí)，冰晶生長(zhǎng)速率較大程度上取決于液體的熱擴(kuò)散系數(shù)及與載物臺(tái)的換熱量[16]。其中換熱量與液滴底面積即液滴直徑的平方成正比，液滴凍結(jié)所需的冷量又與液滴體積即液滴直徑的三次方成正比，即冰晶的平均生長(zhǎng)速率與液滴直徑成反比。因此，選用直徑較小的液滴在約20 ℃過冷度條件下進(jìn)行細(xì)胞冷凍可獲得較高的冷凍速率從而減少細(xì)胞損傷。

對(duì)3種不同直徑（2、3、4 mm）的DMSO溶液液滴也進(jìn)行了類似冷凍實(shí)驗(yàn)，不同過冷度條件下的冰晶生長(zhǎng)速率如圖5所示。由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)過冷度范圍內(nèi)，3個(gè)尺度的DMSO溶液液滴冰晶生長(zhǎng)速率與過冷度的依變關(guān)系無明確的規(guī)律，且存在同一直徑的液滴，在相近的過冷度范圍內(nèi)冰晶生長(zhǎng)速率也具有顯著差異的現(xiàn)象。但與純水相比，DMSO溶液的冰晶生長(zhǎng)速率顯著低于純水。因此，若要達(dá)到相同級(jí)別的冰晶生長(zhǎng)速率，DMSO溶液總體趨勢(shì)上需要更大的過冷度。

在1970年代，美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局首先使用先進(jìn)的測(cè)量技術(shù)來測(cè)定圣安德烈斯斷層系上應(yīng)變積累的位置和速率。今天，許多研究小組每年使用足夠精確的全球衛(wèi)星定位接收器進(jìn)行幾個(gè)月的連續(xù)觀測(cè)來采集應(yīng)變數(shù)據(jù)，以便確定每年幾厘米的長(zhǎng)期水平應(yīng)變積累速率。

圖5 DMSO溶液液滴在不同過冷度條件下的冰晶生長(zhǎng)速率Fig.5 Ice formation rates of DMSO solution droplets under different undercooling conditions

通過對(duì)比直徑為2 mm的DMSO溶液在過冷度為7～8 ℃范圍內(nèi)冰晶的生長(zhǎng)過程可知，該冰晶生長(zhǎng)速率的巨大差異是由DMSO溶液液滴獨(dú)特的結(jié)晶方式引起的。圖6和圖7所示分別為液滴在過冷度為7.8、7.5 ℃兩個(gè)非常接近工況下的凍結(jié)過程。不同于純水液滴的結(jié)晶方式，DMSO溶液液滴結(jié)晶不再由液滴底部均勻開始，而是在液滴整體區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)位置發(fā)生。由圖6可知，過冷度為7.8 ℃工況下，29 ms時(shí)液滴區(qū)域內(nèi)首次出現(xiàn)點(diǎn)狀晶核，隨后冰晶不斷擴(kuò)散生長(zhǎng)，496 ms時(shí)在另一位置出現(xiàn)晶核，隨后兩者進(jìn)入同步并行生長(zhǎng)過程。由圖7可知，過冷度為7.5 ℃工況下，點(diǎn)狀晶核出現(xiàn)在液滴中心位置附近，并向四周擴(kuò)散推進(jìn)，并在251 ms已基本處于生長(zhǎng)末期。

圖6 過冷度為7.8 ℃，直徑為2 mm DMSO溶液液滴的凍結(jié)過程Fig.6 Freezing process of DMSO solution droplet with 2 mm diameter when degree of subcooling is 7.8 ℃

圖7 過冷度為7.5 ℃，直徑為2 mm DMSO溶液液滴的凍結(jié)過程Fig.7 Freezing process of DMSO solution droplet with 2 mm diameter when degree of subcooling is 7.5 ℃

綜上所述，DMSO溶液液滴中冰晶的生長(zhǎng)過程相比純水液滴具有誘發(fā)點(diǎn)隨機(jī)性強(qiáng)的特點(diǎn)。冰晶生長(zhǎng)初期，晶核在DMSO溶液液滴底部溫度最低處隨機(jī)生成，隨后呈輻射狀向三維空間內(nèi)生長(zhǎng)，在此過程中有可能與其他位置的冰晶發(fā)生交匯，導(dǎo)致相同情況下的DMSO溶液液滴中冰晶生長(zhǎng)速率差異較大。此外，DMSO溶液液滴中冰晶的生長(zhǎng)速率顯著低于純水液滴，表明采用DMSO保護(hù)劑有助于減小冰晶對(duì)溶液中細(xì)胞的損傷。

2.2 半圓槽道內(nèi)純水冰晶生長(zhǎng)

臨床應(yīng)用中的精子樣本通常置于冷凍管載體中進(jìn)行凍存，因此有必要進(jìn)行液體在圓管內(nèi)的冷凍實(shí)驗(yàn)。為消除細(xì)管自身的透明度及對(duì)光學(xué)觀察的影響，本實(shí)驗(yàn)采用半圓槽道的載體進(jìn)行液體裝載。圖8所示為直徑為2 mm半圓槽道（圖1部件11）內(nèi)純水在不同過冷度條件下的冰晶生長(zhǎng)速率。由圖8可知，過冷度在0～10 ℃時(shí)，冰晶生長(zhǎng)速率基本與過冷度呈線性相關(guān)，但冰晶生長(zhǎng)較慢。主要原因是槽內(nèi)純水沿槽道方向也有分布，其體積和熱容遠(yuǎn)大于上述液滴，結(jié)晶前端推進(jìn)單位長(zhǎng)度所需的冷量一般是液滴的數(shù)倍。同時(shí)圓形槽道壁面也對(duì)冰晶在水平方向的擴(kuò)展起到限制作用。

圖8 不同過冷度條件下半圓槽道內(nèi)純水的冰晶生長(zhǎng)速率Fig.8 Ice formation rates of pure water in groove under different degree of subcooling conditions

槽道內(nèi)純水的冰晶生長(zhǎng)一般由壁面開始。圖9～圖11所示為在不同過冷度條件下，冰晶生長(zhǎng)的形貌變化。過冷度在0～4 ℃時(shí)，凍結(jié)前端呈現(xiàn)寬大圓潤(rùn)的無分叉冰枝形態(tài)，冰晶生長(zhǎng)平均速率為24 μm/s。單個(gè)冰枝的形態(tài)寬度和生長(zhǎng)方向均無顯著規(guī)律，該結(jié)論與A. A. Shibkov等[19]在薄層水凍結(jié)實(shí)驗(yàn)中觀察到凍結(jié)尖端的分裂即分叉的樹枝狀冰晶現(xiàn)象不同。當(dāng)過冷度進(jìn)一步升至4～6 ℃時(shí)，冰枝尖端顯著變尖且整體變窄，冰枝的分布更均勻，冰晶生長(zhǎng)的平均速率為86 μm/s；當(dāng)過冷度超過6 ℃時(shí)，冰枝已經(jīng)形成極窄的細(xì)針狀，在一定范圍內(nèi)具有一致的生長(zhǎng)方向。無論從冰晶生長(zhǎng)速率還是冰枝形態(tài)來看，低過冷度下純水的冰晶生長(zhǎng)過程較溫和，而高過冷度條件下冰晶生長(zhǎng)不僅具有更大的動(dòng)量，且其尖端更鋒利，應(yīng)力更集中，更容易穿透細(xì)胞膜并對(duì)細(xì)胞造成損傷，此時(shí)冰晶生長(zhǎng)平均速率已達(dá)到240 μm/s。因此，推測(cè)A. A. Shibkov等[19]的測(cè)試結(jié)果可能是在過冷度較大的條件下獲得。

圖9 0.5 ℃過冷度條件下槽道內(nèi)純水凍結(jié)過程Fig.9 Freezing process of pure water in groove when degree of subcooling is 0.5 ℃

圖10 4.3 ℃過冷度條件下槽道內(nèi)純水凍結(jié)過程Fig.10 Freezing process of pure water in groove when degree of subcooling is 4.3 ℃

圖11 9.5 ℃過冷度條件下槽道內(nèi)純水凍結(jié)過程Fig.11 Freezing process of pure water in groove when degree of subcooling is 9.5 ℃

2.3 生精小管的冰晶生長(zhǎng)

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展了鼠生精小管的冷凍實(shí)驗(yàn)，過冷度設(shè)定為20 ℃。鼠生精小管在純水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% DMSO溶液中的凍結(jié)過程如圖12、圖13所示。由圖12和圖13可知，純水中生精小管的凍結(jié)分為小管內(nèi)外兩部分，管外的純水冰晶呈細(xì)針狀快速生長(zhǎng)，在達(dá)到管壁后，管內(nèi)靠近壁面部分也開始結(jié)晶，呈現(xiàn)零散的黑色點(diǎn)狀區(qū)域。在管內(nèi)冰晶生長(zhǎng)的同時(shí)，管壁的另一側(cè)也觀察到細(xì)針狀冰晶從管壁處開始生長(zhǎng)。但在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%DMSO溶液中，水分子通過與DMSO的作用使溶液黏性增加，冰點(diǎn)降低，顯著弱化了管外的冰晶生長(zhǎng)，使其不再具有窄長(zhǎng)細(xì)針狀的形態(tài)，降低了其對(duì)生精小管的機(jī)械損傷風(fēng)險(xiǎn)，使生精小管得以維持較完好的生理形態(tài)。

圖12 生精小管在純水中冷凍實(shí)驗(yàn)Fig.12 Freezing process of seminiferous tubules in pure water

圖13 生精小管在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%DMSO溶液中冷凍實(shí)驗(yàn)Fig.13 Freezing process of seminiferous tubules in 10% DMSO solution

3 結(jié)論

本文研制了一套基于瞬態(tài)接觸冷卻方法的新型低溫顯微成像系統(tǒng)，觀察了平板面和圓形槽道內(nèi)純水、DMSO溶液及鼠生精小管的冰晶形成現(xiàn)象，分析了水和冷凍保護(hù)劑在不同過冷度條件下的冰晶生長(zhǎng)特征，得到結(jié)論如下：

1）在平板面上的液滴冷凍實(shí)驗(yàn)中，冰晶由純水液滴的熱通量負(fù)方向開始較均勻地生長(zhǎng)，而DMSO溶液液滴內(nèi)的冰晶生長(zhǎng)則呈現(xiàn)隨機(jī)性多點(diǎn)生長(zhǎng)特征；DMSO溶液液滴內(nèi)的冰晶生長(zhǎng)速率顯著低于純水，表明采用DMSO保護(hù)劑有助于減小冰晶對(duì)溶液中細(xì)胞的損傷。

2）在槽道內(nèi)的液滴冷凍實(shí)驗(yàn)中，純水冰晶生長(zhǎng)速率隨過冷度增加近似呈線性增長(zhǎng)，生長(zhǎng)形態(tài)總體上為無分叉的樹枝狀冰晶，但其幾何形貌隨過冷度不同而呈現(xiàn)顯著差異。低過冷度時(shí)，冰枝尖端圓潤(rùn)且間隔較寬，高過冷度時(shí)，冰枝呈細(xì)針狀。

3）在生精小管冷凍實(shí)驗(yàn)中，由于水分子與DMSO作用弱化了冰晶生長(zhǎng)，鼠生精小管外的冰晶即使在大過冷度下也未出現(xiàn)在純水實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)針狀形態(tài)，降低了冰晶對(duì)生精小管的機(jī)械損傷風(fēng)險(xiǎn)，使生精小管得以維持更為完好的生理形態(tài)。

本文受上海市科委創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃（20S31903400）、上海市申康促進(jìn)創(chuàng)新能力三年行動(dòng)計(jì)劃 （SHDC2020CR3077B）和上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金（YG2021QN86）項(xiàng)目資助。（The project was supported by Innovation Action Plan of Shanghai Science and Technology Commission（No.20S31903400）, Three-year Action Plan of Shanghai Shenkang to Promote Innovation Ability（No.SHDC2020CR3077B） and Biomedical Engineering Interdisciplinary Fund of Shanghai Jiao Tong University （No.YG2021QN86）.）