周家名，李彬彬，余宏宇

肝纖維化是一種復(fù)雜的損傷-應(yīng)答修復(fù)反應(yīng)，由各種慢性肝損傷觸發(fā)。竇周隙內(nèi)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的異?；罨透闻K細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過(guò)度沉積，是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵過(guò)程。進(jìn)行性肝纖維化最終將導(dǎo)致肝硬化，預(yù)后差，并伴較高的病死率。鑒于目前對(duì)肝纖維化尚無(wú)有效的早期診斷和治療手段，故亟需進(jìn)一步深入探討其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找具有臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的分子診療靶點(diǎn)。近年，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在肝纖維化中的調(diào)控作用逐漸被重視。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化組織中circRNA表達(dá)譜有顯著差異性改變，circRNA可能作為肝纖維化的新分子生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文對(duì)近年circRNA在肝纖維化中的調(diào)控機(jī)制及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并展望該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。

1 circRNA的生物學(xué)功能

2013年，Nature雜志上刊登了Memczak和Hansen等對(duì)circRNA的研究成果，從此揭開了circRNA的研究序曲[1-2]。Memczak等[1]在人、鼠和線蟲中分析得到數(shù)千種穩(wěn)定表達(dá)的circRNA，并發(fā)現(xiàn)circRNA似乎在細(xì)胞類型或發(fā)育階段特異性表達(dá)。circRNA一般來(lái)源于pre-mRNA的直接反向剪接或線性RNA拼接過(guò)程中形成的套索RNA中間體，以共價(jià)鍵形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)其來(lái)源和構(gòu)成，circRNA主要可分為外顯子環(huán)化的circRNA(exonic circRNA, ecircRNA)、內(nèi)含子環(huán)化的circRNA(intronic circRNA, ciRNA)和外顯子-內(nèi)含子共同環(huán)化的circRNA(exon-intron circRNA, EIciRNA)三種類型[3-4]。此外，近年一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)新的circRNA形式，如融合circRNA、轉(zhuǎn)錄讀取circRNA等[5-6]。circRNA的主要功能包括充當(dāng)miRNA海綿、蛋白支架、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和調(diào)控翻譯等[7-10]。其中，EIciRNA/ciRNA通常定位于胞核，并主要參與基因轉(zhuǎn)錄[11-12]。ecircRNA通常定位于胞質(zhì)，此類circRNA多具有顯著的“超級(jí)海綿”能力，可通過(guò)與miRNA的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合導(dǎo)致miRNA下游靶基因釋放，提高靶基因水平[13-14]。

2 肝纖維化的發(fā)生機(jī)制

肝纖維化實(shí)質(zhì)是肝內(nèi)慢性損傷后膠原纖維持續(xù)異常增多的病理過(guò)程[15]，存在于竇周隙內(nèi)的HSC是肝纖維化發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞。HSC激活是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵事件，其活化過(guò)程可分為啟動(dòng)階段和持續(xù)階段。啟動(dòng)階段中受損實(shí)質(zhì)細(xì)胞(如肝細(xì)胞)旁分泌或細(xì)胞損傷碎片刺激引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)HSC發(fā)生早期活化。啟動(dòng)階段刺激的維持會(huì)導(dǎo)致HSC進(jìn)入由自分泌和旁分泌，共同刺激調(diào)節(jié)的持續(xù)活化階段，出現(xiàn)增殖、趨化、纖維生成、收縮性、基質(zhì)降解和維生素A喪失等細(xì)胞的行為改變[16-17]?；罨蟮腍SC(即肌成纖維細(xì)胞)產(chǎn)生α-SMA，并大量分泌ECM，使竇周隙內(nèi)出現(xiàn)以膠原纖維為主的ECM異常沉積，引發(fā)肝纖維化。此外，肝纖維化也受到肝內(nèi)其他細(xì)胞和多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路的共同調(diào)節(jié)[18-19]。

3 肝纖維化領(lǐng)域circRNA的研究現(xiàn)狀及主要調(diào)控機(jī)制

近年，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展和研究手段的進(jìn)步，circRNA在HSC活化/肝纖維化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制研究不斷深入。文獻(xiàn)報(bào)道多數(shù)circRNA通過(guò)海綿吸附miRNA，調(diào)節(jié)肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平，直接參與肝纖維化調(diào)控(圖1)。這些circRNA通過(guò)控制早期炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞活化及調(diào)控ECM生成等方式，調(diào)控肝纖維化過(guò)程，有望成為肝纖維化的新生物學(xué)標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)(表1)。

表1 肝纖維化中circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控軸

圖1 circRNA調(diào)控肝纖維化的作用機(jī)制

3.1 對(duì)肝纖維化發(fā)揮保護(hù)性作用circRNA

3.1.1circMTO1 Wang等[20]發(fā)現(xiàn)血清circMTO1在慢性乙型肝炎患者中顯著下調(diào)，ROC曲線分析顯示，血清circMTO1可作為慢性乙型肝炎患者肝纖維化的診斷生物學(xué)標(biāo)志物，并與纖維化分期和HAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。circMTO1可通過(guò)海綿吸附miR-17-5p調(diào)控Smad7的表達(dá)。Smad7是TGF-β/Smad通路中的負(fù)調(diào)控因子[21]，circMTO1可通過(guò)吸附miR-17-5p促進(jìn)Smad7表達(dá)，抑制肝纖維化。

Jin等[22]報(bào)道circMTO1在肝硬化患者的肝臟中表達(dá)減少，在肝纖維化小鼠肝臟和激活的HSC中表達(dá)下調(diào)。circMTO1和miR-181b-5p共定位于細(xì)胞質(zhì)，miR-181b-5p可抑制PTEN的表達(dá)。PTEN是HSC活化的負(fù)調(diào)控因子[23]，該研究證實(shí)circMTO1至少部分通過(guò)吸附miR-181b-5p調(diào)控PTEN表達(dá)而抑制HSC活化。

3.1.2circ_0004018 Li等[24]發(fā)現(xiàn)circ_0004018在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中表達(dá)水平降低，并且circ_0004018可作為miR-660-3p的海綿，調(diào)節(jié)miR-660-3p靶基因TEP1的表達(dá)。TEP1是端粒酶的組成部分，可參與端粒的維持。circ_0004018可通過(guò)靶向miR-660-3p/TEP1軸抑制HSC細(xì)胞的增殖和激活。

3.1.3circ_0070963 Ji等[25]通過(guò)circRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)circ_0070963在肝纖維化過(guò)程中表達(dá)降低。研究證實(shí)circ_0070963是miR-223-3p海綿，可通過(guò)調(diào)控miR-223-3p/LEMD3軸抑制肝纖維化中HSC的激活。LEMD3含有LEM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在核膜內(nèi)具有拮抗TGF-β信號(hào)的功能[25]。circ_0070963可通過(guò)吸附miR-223-3p促進(jìn)LEMD3的表達(dá)。

3.1.4circCREBBP Yang等[26]發(fā)現(xiàn)circCREBBP在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中顯著低表達(dá)。在體內(nèi)使用AAV8-circCREBBP過(guò)表達(dá)circCREBBP，可通過(guò)降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天門氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量、肝臟羥脯氨酸水平、膠原沉積以及降低促纖維化基因和促炎細(xì)胞因子水平，預(yù)防CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化進(jìn)展。LEFTY2是TGF-β超家族蛋白的分泌配體，circCREBBP可以通過(guò)靶向miR-1291/LEFTY2軸減輕肝纖維化。

3.1.5circPSD3 Bu等[27]提取CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝組織和HSC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)circPSD3在肝組織和培養(yǎng)的HSC中明顯下調(diào)。此外，體外功能喪失和功能獲得實(shí)驗(yàn)表明，circPSD3抑制HSC的激活和增殖。circPSD3可作為miR-92b-3p的海綿，進(jìn)而促進(jìn)Smad7的表達(dá)。

3.1.6circFBXW4 Chen等[28]通過(guò)circRNA-seq獲得肝纖維化進(jìn)展和衰退小鼠HSC中circRNA、miRNA和mRNA的表達(dá)譜。他們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circFBXW4可抑制HSC的活化增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕小鼠肝纖維化損傷，并具有抗炎作用。circFBXW4可能通過(guò)靶向miR-18b-3p/FBXW7軸調(diào)節(jié)HSC激活和抑制纖維化；其下游靶點(diǎn)FBXW7可通過(guò)增加鐵死亡誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制，并有助于HSC細(xì)胞的自噬降解功能[29]。

3.2 具有促纖維化作用的circRNA

3.2.1circRNA-0067835 Zhu等[30]發(fā)現(xiàn)胸腺素-β4(thymosin, Tβ4)可通過(guò)circRNA-0067835/miR-155/FoxO3信號(hào)通路調(diào)控HSC激活，他們使用circRNA微列陣鑒定Tβ4相關(guān)circRNA，發(fā)現(xiàn)circRNA-0067835在Tβ4缺失的LX-2細(xì)胞中表達(dá)明顯增加。FoxO3所屬的FoxO家族，可通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)控HSC增殖[31-32]。circRNA-0067835可作為miR-155的海綿促進(jìn)FoxO3的表達(dá)，發(fā)揮促纖維化作用。

3.2.2circRNA-PWWP2A Liu等[33]發(fā)現(xiàn)TGF-β和脂多糖誘導(dǎo)的circRNA-PWWP2A，可通過(guò)海綿吸收miR-203和miR-223促進(jìn)肝纖維化。該研究結(jié)果表明，circ-PWWP2A是TGF-β和脂多糖在HSC激活過(guò)程中共同的下游反應(yīng)器，circRNA-PWWP2A通過(guò)海綿吸附miR-203、miR-223，并促進(jìn)其下游靶基因Fstl1、TLR4釋放，在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Fstl1和TLR4均為促纖維化因子，在HSC激活和促進(jìn)纖維生成中發(fā)揮重要作用[34-35]。

3.2.3circRSF1 Chen等[36]發(fā)現(xiàn)circRSF1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-146a-5p/RAC1促進(jìn)受輻射HSC的炎癥和纖維化表型。輻射后的人HSC細(xì)胞系LX-2中RAC1表達(dá)升高，并可促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖和α-SMA表達(dá)，而這些促進(jìn)過(guò)程均被miR-146a-5p模擬物阻斷。RAC1是一種GTPase，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)circRSF1可通過(guò)吸附miR-146a-5p增加RAC1的表達(dá)，并促進(jìn)輻射后LX-2細(xì)胞的炎癥和纖維化表型。circRSF1為放射性肝損傷(radiation-inducedliverdisease, RILD)提供有吸引力的治療靶點(diǎn)。

3.2.4circUbe2k Zhu等[37]發(fā)現(xiàn)，circUbe2k可通過(guò)調(diào)控miR-149-5p/TGF-β2促進(jìn)肝纖維化。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠和受TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中，circUbe2k表達(dá)增強(qiáng)并可調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)展。抑制circUbe2k表達(dá)可降低HSC的激活和增殖，抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠和TGF-β1刺激的LX-2細(xì)胞中α-SMA和I型膠原alpha 1鏈(collagen type I alpha 1 chain， Col1a1)的表達(dá)。circUbe2k可以通過(guò)吸附miR-149-5p，從而導(dǎo)致TGF-β2升高。

4 circRNA對(duì)肝纖維化的間接調(diào)控

4.1 circRNA可能通過(guò)細(xì)胞間串?dāng)_調(diào)控肝纖維化Zhu等[38]研究證明，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stromal cell, ADSC)分泌的外泌體可以用來(lái)傳遞circRNA治療肝纖維化。他們發(fā)現(xiàn)mmu_circ_0000623在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠中表達(dá)下調(diào)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，ADSC分泌的外泌體，尤其是來(lái)自mmu_circ_0000623修飾的ADSC分泌的外泌體，可通過(guò)促進(jìn)自噬激活顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

4.2 circRNA在肝內(nèi)其他肝纖維化相關(guān)疾病中的研究近年，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)逐漸成為肝纖維化/肝硬化發(fā)生的重要誘因。Day和James提出NAFLD/NASH發(fā)生過(guò)程中的“兩擊”假說(shuō)(“two-hit” hypothesis)，即第一次攻擊導(dǎo)致肝臟脂肪堆積，第二次攻擊導(dǎo)致炎癥和纖維化。一些研究發(fā)現(xiàn)circRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激參與調(diào)控NAFLD的發(fā)病機(jī)制。例如circRNA_0046367可通過(guò)內(nèi)源性調(diào)控miR-34a表達(dá)，消除脂肪變性中的脂質(zhì)過(guò)氧化、凋亡和線粒體功能障礙，并消除miR-34a對(duì)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor α, PPARα)的抑制作用。circScd1可通過(guò)JAK2/STAT5途徑在NAFLD中增加肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，從而促進(jìn)脂肪肝疾病。

5 總結(jié)與展望

肝纖維化的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，肝慢性損傷后的早期炎癥反應(yīng)、HSC活化和ECM異常沉積，是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵級(jí)聯(lián)事件。越來(lái)越多的證據(jù)表明，肝纖維化發(fā)生過(guò)程中circRNA呈現(xiàn)出顯著差異性表達(dá)。這些circRNA可海綿吸附miRNA，引起miRNA下游肝纖維化相關(guān)靶基因釋放，通過(guò)調(diào)節(jié)HSC增殖和ECM沉積、調(diào)控HSC細(xì)胞的自噬降解、調(diào)節(jié)膠原基因的表達(dá)及調(diào)節(jié)促炎因子水平等，直接調(diào)控肝纖維化過(guò)程。此外，某些circRNA可能通過(guò)細(xì)胞間串?dāng)_，以及通過(guò)調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂質(zhì)代謝、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等方式對(duì)肝纖維化產(chǎn)生間接調(diào)控。

目前，circRNA在肝纖維化中的具體調(diào)控機(jī)制的研究仍處于早期階段，大量circRNA的功能尚未明確。現(xiàn)有的circRNA功能機(jī)制研究仍較為局限，且處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，尚未有臨床轉(zhuǎn)化的相關(guān)報(bào)道。因此，circRNA在HSC活化/肝纖維化發(fā)生過(guò)程中的功能機(jī)制仍有待分析，具有臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的circRNA仍有待于進(jìn)一步挖掘。