張美智子，陳永良，郭佳雯，吳梓萱，薛 晶

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，最新統(tǒng)計(jì)的全球乳腺癌新發(fā)病例為226萬(wàn)，而死亡人數(shù)為68萬(wàn)[1]。中國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化，新發(fā)病例位居全球首位，患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也逐年加重[1-2]。目前，乳腺癌主要以手術(shù)治療為主，并結(jié)合輔助治療手段[3-4]。腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor, CREPT)也稱(chēng)RPRD1B，是新發(fā)現(xiàn)的位于人類(lèi)20號(hào)染色體的基因，在多種腫瘤中呈高表達(dá)[5]。現(xiàn)階段對(duì)于CREPT的研究較多，最新觀點(diǎn)認(rèn)為CREPT/RPRD1B以p300依賴(lài)的方式，通過(guò)STAT3驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[6]，但尚未有文獻(xiàn)闡明CREPT在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系。本文著重探討CREPT在乳腺癌中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，以提高臨床與病理醫(yī)師的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年11月～2021年6月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的乳腺癌術(shù)后癌組織石蠟標(biāo)本132例，患者年齡26～73歲，中位年齡49歲；癌旁組織石蠟標(biāo)本52例，患者年齡30～56歲，中位年齡48歲，隨訪時(shí)間為270個(gè)月。另收集12對(duì)新鮮乳腺癌與癌旁配對(duì)組織標(biāo)本，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?；颊咝g(shù)前均未行放、化療等輔助治療，病理分級(jí)按WHO(2019)乳腺腫瘤分類(lèi)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫(kù) UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// ualcan.path.uab.edu/)包括31種癌癥類(lèi)型，通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)可利用TCGA轉(zhuǎn)錄組和臨床患者數(shù)據(jù)，對(duì)CREPT基因表達(dá)進(jìn)行深入分析[7]。GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/analysis)包括9 736個(gè)腫瘤和8 587個(gè)正常樣本，可有效進(jìn)行癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站[8]，分析CREPT基因的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。

1.2.2Western blot法 取適量置于-80 ℃冰箱凍存的乳腺癌及配對(duì)癌旁組織，加入蛋白酶抑制劑和裂解液(稀釋比1 ∶100，上海碧云天生物公司)，置于冰上操作，充分研磨靜置后放入離心機(jī)中，離心3 000 r/min，5 min；使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整樣品濃度；加入Loading Buffer煮沸10 min。Western blot檢測(cè)：配膠，轉(zhuǎn)膜，裁膜封閉，加入一抗(CE10稀釋比1 ∶500)，TBST洗膜，加入二抗(稀釋比1 ∶1 000)；室溫孵育1 h；洗膜后顯影。Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.3qRT-PCR法 取適量置于-80 ℃冰箱凍存的乳腺癌及配對(duì)癌旁組織，按照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取總RNA，評(píng)價(jià)RNA純度，根據(jù)FastQuant試劑盒(天跟生化公司)說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。PCR引物由上海生物工程公司合成，其中CREPT引物序列：上游5′-TGTCCCTTTGGCTCATCCAC-3′，下游5′-CATCTGCCTCTCTGGCAACA-3′。GAPDH引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGACAGTGGA-3′。

1.2.4免疫組化 采用免疫組化EnVision兩步法染色，室溫下經(jīng)石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，蒸餾水洗3次各3 min，PBS沖洗3次，各5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入檸檬酸緩沖液中煮沸，持續(xù)20 min；室溫冷卻。PBS沖洗3次，各5 min；加入3%H2O210 min；用PBS沖洗3次各5 min；倒去封閉液，用PBS沖洗3次各5 min，滴加一抗鼠抗CREPT單克隆抗體(3E10，1 ∶100)(由清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院常智杰教授贈(zèng)與)，置于4 ℃過(guò)夜，用PBS清洗3次，各5 min；加入二抗(DAKO公司)，室溫下靜置45 min；PBS清洗3次，各5 min；DAB顯色試劑盒(DAKO公司)；蘇木精復(fù)染，脫水封固。CREPT染色結(jié)果以半定量方法評(píng)估，免疫反應(yīng)性評(píng)分(immunoreactivity score, IRS)：低表達(dá)組(IRS為0～6分)和高表達(dá)組(6～12分)。

2 結(jié)果

2.1 GEPIA2及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析利用GEPIA2和UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，CREPT在1 097例乳腺癌、114例正常乳腺組織中的表達(dá)差異有顯著性，且CREPT在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常乳腺組織(P<0.01，圖1A)。在乳腺癌的臨床病理因素中，CREPT在乳腺癌的各個(gè)分期均有表達(dá)且分期越高，其表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。檢索UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，CREPT基因高表達(dá)組乳腺癌患者總生存期明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032，圖1C)；在不同種族的乳腺癌患者中，CREPT高表達(dá)組患者總生存期明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034，圖1D)。

圖1 GEPIA2及UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析CREPT在乳腺癌中的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系：A.正常乳腺組織與乳腺癌組織中CREPT的表達(dá)；B.正常乳腺組織與不同臨床分期的乳腺癌組織中CREPT的表達(dá)；C.CREPT的表達(dá)對(duì)患者生存期的影響；D.CREPT表達(dá)在不同種族的乳腺癌患者中的比較

2.2 Western blot法檢測(cè)CREPT蛋白表達(dá)采用Western blot法檢測(cè)顯示：乳腺癌組織中CREPT蛋白表達(dá)水平明顯升高(圖2A)；CREPT蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)量(0.30±0.01)明顯高于癌旁乳腺組織(0.08±0.07)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2B)。

圖2 Western blot法檢測(cè)乳腺癌及癌旁組織中CREPT蛋白表達(dá)：A.電泳圖；B.直方圖

2.3 qRT-PCR法檢測(cè)CREPT相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用相對(duì)定量法通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算，檢測(cè)乳腺癌組織中CREPT mRNA相對(duì)表達(dá)量(6.321±0.543)明顯高于癌旁組織(1.032±0.32)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 乳腺癌及癌旁組織中CREPT mRNA表達(dá)水平

2.4 免疫組化法檢測(cè)石蠟切片中CREPT的表達(dá)CREPT表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。132例乳腺癌標(biāo)本中，CREPT表達(dá)者132例(圖4A)，其中高表達(dá)76例，低表達(dá)56例，而在癌旁組織中表達(dá)者52例(圖4B)，均為低表達(dá)；兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=51.008，P<0.01)。CREPT的高表達(dá)與TNM分期有關(guān)及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。采用Kaplan-Meier法分析105例患者生存狀態(tài)，Log-rank檢驗(yàn)CREPT高表達(dá)的乳腺癌患者總生存期較短(P<0.05，圖5)。

AB

圖5 CREPT表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

表1 乳腺癌組織中CREPT表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

含核前mRNA結(jié)構(gòu)域蛋白(regulation of nuclear pre-mRNA-domain-containing RPRD)家族主要成員有p15RS(RPRD1A)、CREPT(RPRD1B)和RPRD2。RPRD家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含C末端結(jié)構(gòu)域(carboxy-terminal domain，CTD)，與CTD相互作用的效應(yīng)蛋白是CTD相互作用域(RNA Pol II CTD interacting domain，CID)[9]。

CID存在于眾多調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、終止和加工RNA的蛋白質(zhì)中，介導(dǎo)與RNA聚合酶II(RNAPII)的最大亞單位Rpb1含有CTD的關(guān)聯(lián)，并在高效合成成熟的mRNA中發(fā)揮重要作用。2012年常智杰教授新發(fā)現(xiàn)了CREPT基因，表達(dá)于大部分人體細(xì)胞和組織中，其定位于20號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)1帶[10]。在結(jié)構(gòu)上CREPT除了有RPR結(jié)構(gòu)域外，還有一個(gè)卷曲螺旋末端結(jié)構(gòu)域，可以幫助其形成二聚體，進(jìn)一步加強(qiáng)CID與CTD的相互作用[11]。在功能上包括有促進(jìn)DNA的修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，沉默CREPT的乳腺癌細(xì)胞會(huì)降低CDK1的表達(dá)，而CDK1是同源重組(homologous recombination, HR)方式中的關(guān)鍵效應(yīng)子。因此，CREPT可能以間接的方式參與HR過(guò)程，但存在細(xì)胞類(lèi)型的差異，其具體發(fā)生過(guò)程仍有待于進(jìn)一步研究[12]。Yang等[13]發(fā)現(xiàn)CREPT缺失的腸上皮細(xì)胞在損傷后無(wú)法再生的現(xiàn)象，說(shuō)明CREPT可以調(diào)節(jié)小鼠腸道干細(xì)胞分化分裂相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)腸道再生對(duì)腸上皮細(xì)胞的恢復(fù)與更新至關(guān)重要。

目前，已經(jīng)在多種類(lèi)型的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)CREPT的異常過(guò)表達(dá)，并且其在調(diào)控細(xì)胞周期和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)方面也發(fā)揮巨大作用[9]。

有學(xué)者發(fā)布最新研究指出，CREPT首先與p300形成復(fù)合物，然后通過(guò)其RPR結(jié)構(gòu)域與STAT3結(jié)合，充當(dāng)p300與STAT3溝通的橋梁，從而增強(qiáng)STAT3轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)揮其致癌作用[14]。在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，CREPT與p300協(xié)同作用，增強(qiáng)p300與β-catenin的乙?；饔?，并激活Wnt/β-catenin通路，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[15]。此外，細(xì)胞周期的失調(diào)也是腫瘤發(fā)生的共同特點(diǎn)之一。CREPT調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白和周期蛋白依賴(lài)性激酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期。其主要是通過(guò)增強(qiáng)RNA聚合酶Ⅱ與啟動(dòng)子的結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因成環(huán)實(shí)現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道CREPT可以促進(jìn)Cyclin D1、Cyclin E、CDK4、CDK2和CDK6轉(zhuǎn)錄，即其主要作用集中于G1/S期的過(guò)渡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中CREPT經(jīng)極光激酶B(Aurora B)磷酸化S145位點(diǎn)后，使其RPR域與RNA聚合酶Ⅱ作用，促進(jìn)Cyclin B1轉(zhuǎn)錄進(jìn)而加速G2/M期轉(zhuǎn)換[16]。

在CRC[15]、胃癌[16]、食管癌[17]、非小細(xì)胞肺癌[18]、黑素細(xì)胞瘤[19]等15種癌組織中[20]，CREPT的表達(dá)含量均高于其癌旁組織。在腎癌組織中，CREPT的表達(dá)水平與TNM分期、分級(jí)預(yù)后緊密相關(guān)[21]。在CRC組織中，CREPT高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增長(zhǎng)；與良性組織相比，CREPT細(xì)胞在CRC組織中大量表達(dá)且與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)[22]，提示CREPT參與多種癌癥發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)癌癥的轉(zhuǎn)移和侵襲。Ma等[23]設(shè)計(jì)了一種細(xì)胞可滲透性肽的PROTAC，可在胰腺癌細(xì)胞中降解CREPT；當(dāng)CREPT被降解，腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移能力大幅減弱，提示CREPT可能成為解決腫瘤防治問(wèn)題的新方向。

目前，CREPT在乳腺癌中的作用尚不清楚。近年我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率及病死率逐年攀升，且發(fā)病年齡有低齡化的趨勢(shì)，已嚴(yán)重危害女性身體健康[24-25]。因此，本實(shí)驗(yàn)分析CREPT在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，通過(guò)Western blot法及免疫組化EnVision兩步法檢測(cè)CREPT在乳腺癌組織中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌中CREPT的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且乳腺癌患者的臨床分期越高，CREPT的表達(dá)水平也不斷提高。CREPT高表達(dá)患者的總生存期明顯低于低表達(dá)患者，CREPT的表達(dá)水平與乳腺癌分型及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)。

總之，CREPT可作為新的原癌基因，參與調(diào)控乳腺癌發(fā)生、發(fā)展，促使乳腺癌向惡性發(fā)展。CREPT有望成為乳腺癌分型相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物及治療的新靶點(diǎn)，有助于早期的癌癥篩查和靶向治療。