曾自珍 王利勝

1.廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院清遠市人民醫(yī)院藥學部，廣東清遠 511500；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州 510006

據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，川芎是十分常見的一種傘形科植物，根莖部分的藥用價值最高，且具有活血行氣，祛風止痛的作用，川芎嗪別名四甲基吡嗪[1]，它主要提取自川芎根莖部分，且是其中最核心的活性生物堿，在臨床中有擴張小動脈、改善微循環(huán)等藥理價值[2-3]，在心腦血管、呼吸科、泌尿科等多個科室治療中都能看到其身影，尤其適用于缺血性腦血管疾病的治療[4-6]，已逐漸成為現(xiàn)在臨床中藥制劑中最有效的藥物之一。冰片能通過人體局部對藥物的吸收，引藥上行，并穿透血腦屏障[7]，并能促進四甲基吡嗪在胃腸道的吸收[8]，多參與治療心腦血管疾病的過程中[9-10]，有一定療效。

為了使川芎嗪在腦血管疾病治療中的效果更佳，很多研究將其與其他藥物相互配合使用，進而能夠發(fā)揮更佳的開竅醒腦、穿透血腦屏障等作用[11]。芎冰滴丸是由川芎提取物、冰片和基質(zhì)按一定比例制成的滴丸制劑。將川芎和冰片配伍制成滴丸劑型能提高生物利用度，增加穩(wěn)定性和降低刺激性等優(yōu)點。其有效性決定其的應(yīng)用面廣，且心腦血管產(chǎn)品的市場巨大，因此也會吸引企業(yè)生產(chǎn)此藥，制定其標準是十分必要的。因此，選擇芎冰滴丸的質(zhì)量標準的研究作為課題，使其建立明確的質(zhì)量標準，提出量控指標，為企業(yè)的生產(chǎn)提供檢驗依據(jù)，從而達到有效控制其質(zhì)量的目的，實現(xiàn)此藥品的有效性與穩(wěn)定性的統(tǒng)一。

在此次研究過程中，利用薄層色譜對本品質(zhì)量進一步管理和識別，將阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）設(shè)定為質(zhì)量控制指標，利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法來測量和明確其在芎冰滴丸中的具體含量，然后進一步深化與升級對其的測量方法，以明確芎冰滴丸的質(zhì)量標準。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國DIONEX 公司，包括P680泵、TCC-100 柱溫箱、UVD17OU 紫外檢測器和Chromeleon 液相色譜工作站），Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHD-Ⅲ真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；TGL-16B 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；AUW120D 十萬分之一分析天平（日本島津）。

1.2 藥物與試劑

FA 對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：110773-200711，供含量測定用）；川芎對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號：120918-200703）；甲醇為分色譜級（天津賽孚瑞科技有限公司,批號：20090101 001）；硅膠G（青島海洋化工廠）、硅膠GF254（青島海洋化工廠）；石油醚、乙醚、環(huán)己烷、乙酸乙酯分析純；芎冰滴丸（由廣州中醫(yī)藥大學自制，規(guī)格：每丸重40 mg）

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 川芎對照品溶液 稱取1 g 川芎對照藥材，將其與50 ml 的石油醚相混合，利用超聲技術(shù)處理15 min，過濾，然后利用2 ml 的乙酸乙酯將殘渣進行溶解，得到川芎對照藥材溶液。

2.1.2 滴丸樣品溶液1 和陰性溶液 隨機選擇20 丸樣品，按照“2.1”項下方法制備得到滴丸樣品溶液1；結(jié)合處方工藝制備出不含川芎的陰性制劑，按照“2.1”項下方法制備得到陰性對照溶液。

2.1.3 冰片對照品溶液 稱取一定數(shù)量的冰片，乙醇溶解，得到每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，得到冰片對照藥材溶液。

2.1.4 滴丸樣品溶液2 溶液 選取樣品50 丸，10 ml 乙醇溶解過夜，濾紙過濾，濾液作為滴丸樣品溶液2 溶液。

2.1.5 供試品溶液的制備 取1 g 樣品，將其與蒸餾水共同置于錐形瓶里，利用超聲技術(shù)對其處理5 min，過濾，放在分液漏斗中，加入乙醚振搖提取3 次，每次0.5 h，合并3 次的乙醚液后用無水硫酸鈉脫水，揮干乙醚液，利用甲醇對殘渣進行溶解，并將其重新放置在25 ml 的量瓶內(nèi)，搖勻，利用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.1.6 對照品溶液的制備 精密稱量出10.60 mg 的FA，將其與甲醇混合共同放于50 ml 的量瓶內(nèi)，再次與甲醇結(jié)合，搖勻，得到濃度為0.212 mg/ml 的對照品溶液。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1 川芎的薄層鑒別 取川芎對照藥材溶液、滴丸樣品溶液1、川芎陰性溶液和空白基質(zhì)，采用薄層色譜法[12]進行識別，分別取以上溶液各2～5 μl，將其點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑展開，然后將其放置于紫外光燈（波長為365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照未見干擾（圖1）。

圖1 芎冰滴丸川芎薄層色譜圖

2.2.2 冰片薄層色譜鑒別 取冰片對照藥材溶液、滴丸樣品溶液2 和川芎對照藥材溶液，采用薄層色譜法[12]試驗，將以上溶液分別吸取10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，展開劑為石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯（17:3），展距8 cm。將其取出自然風干，噴上5%香草醛硫酸溶液，用熱風持續(xù)吹干，直到顯色清楚。在得出的供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點（圖2）。

圖2 芎冰滴丸冰片薄層色譜圖

2.3 含量測定的條件及優(yōu)選

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（50∶50）；檢測波長為323 nm；進樣量10 μl；柱溫35℃。

2.3.2 標準曲線的制備 分別精密吸取“2.1.6”項下的對照品溶液0.l、0.4、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 注入液相色譜儀測定峰面積，以FA 濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，得標準曲線。經(jīng)計算，得回歸方程為：A=0.8249C+0.5818，R2=0.9992。結(jié)果表明FA 在2.12～106.00 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（圖3）。當FA濃度分別為 2.12、8.48、25.44、42.40、63.60、84.80、106.00 μg/ml 時，峰面積平均積分值分別對應(yīng)1.989、6.980、21.877、35.499、54.374、71.277、86.626 mAUmin。

圖3 FA 標準曲線

2.3.3 專屬性實驗 結(jié)合處方工藝制備不包括川芎的陰性制劑，結(jié)合供試品溶液的操作流程來進行陰性樣品的制備，相同色譜條件下進樣，記錄色譜圖，在與FA 相應(yīng)的峰位處沒有吸收峰出現(xiàn)，結(jié)果為其他藥材對FA 的含量測定沒有影響，專屬性良好（圖4）。

圖4 芎冰滴丸的HPLC 圖譜

2.3.4 精密度試驗 精準吸取對照品溶液10 μl，將其放置于液相色譜儀內(nèi)，對其定峰面積進行測量，連重復操作5 次，最終得出RSD=1.78%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 精準稱量5 份樣品，每份重量為1 g，按照“2.1.1”項下方法制備得到供試品溶液，分別吸取10 μl，注入液相色譜儀進行測定，同樣對其面積進行測量，最終得出FA 的均量為0.975 mg/g，RSD=2.31%，重復性良好。

2.3.6 回收率試驗 取樣品5 份，按照“2.1.1”項下方法制備得到供試品溶液，利用加樣回收法，分別加入2 ml 的對照品溶液，精密吸取10 μl，將其注入高效液相色譜儀，計算回收率，結(jié)果RSD=2.27%。

2.3.7 指標成分的選擇 作為方中君藥之一，其最關(guān)鍵的成分就是酚性成分FA、揮發(fā)油類藁本內(nèi)酯等。作為主要有效成分的FA 能明顯擴張冠脈，增加冠脈血流量，改善心肌供氧狀況；抑制大腦皮層活動，抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)等作用[13]。所以把FA 作為質(zhì)量控制的指標，采用HPLC 法對其含量進行測定。

2.3.8 供試品中FA 的含量測定 按照“2.1.5”項下方法制備3 批樣品的供試品溶液，精密吸取10 μl，注入液相色譜儀測定峰面積，計算3 批樣品中FA 的含量。由實驗結(jié)果暫定本品每丸含川芎以FA（C10H10O4）計，不得少于0.03 mg。

2.3.9 川芎藥材中FA 含量測定 根據(jù)趙奎君[6]的研究，因產(chǎn)地的不同，川芎質(zhì)量差異較大，為了有效控制原料質(zhì)量，同時避免盲目投料，經(jīng)對藥材的含量測定和比較，優(yōu)質(zhì)藥材中FA 含量均大于0.4 mg/g，所以暫定投料川芎藥材中FA 的含量限度為不低于0.4 mg/g。

3 討論

在最近幾年中，隨著藥理學的進步以及醫(yī)學研究的深入，使得中藥滴丸劑在原有的基質(zhì)與冷凝劑前提下進行了多次優(yōu)化與升級。聚乙二醇類聚合物（PEG類）自身是沒有任何生理作用的[14]，而且極易溶于水中，進而可以促進藥物更好融化，另外還能幫助患者進一步吸收。但是通過試驗后發(fā)現(xiàn)，盡管PEG4000 有極強的成型性，但是硬度有限，而PEG6000 則正好與之相反，所以在制備滴丸時將二者按一定比例混合共同作為滴丸劑的基質(zhì)。通過多次試驗后發(fā)現(xiàn)，將上述兩者根據(jù)1∶3 比例進行結(jié)合，來作為滴丸劑的基質(zhì)，其整體效果會更佳。

再進一步探討滴丸工藝的同時，計劃利用拖尾、黏連等相關(guān)指標對其展開評估。結(jié)果通過試驗發(fā)現(xiàn)不同滴制條件下滴丸的溶散時限相差不大，均在3～10 min，無顯著性差異，故只采用滴丸硬度、圓整度、拖尾、粘連為指標對其進行評價[15]。采用最有效的制備方式來對滴丸樣品評價，最終結(jié)果表明這些樣品的溶散時限都能達標，且溶散時限幾乎都在3～8 min，這就代表滴丸的質(zhì)量是可靠的；而滴丸外觀硬度、圓整度等同樣也可以為其質(zhì)量評估發(fā)揮重要作用。

方中FA 進行含量測定時，剛開始時未采用乙醚除雜，直接用乙醚提取有效成分，結(jié)果注入液相色譜儀后發(fā)現(xiàn)樣品中雜質(zhì)較多，F(xiàn)A 色譜峰有干擾，且基線漂移積分不準，故在提取有效成分用乙醚進行除雜處理，結(jié)果經(jīng)過除雜后，F(xiàn)A 色譜峰沒有干擾，陽性結(jié)果較好，基線平穩(wěn)，故采用乙醚萃取處理法處理。

當前，很多學者就川芎中涉及FA 成分等內(nèi)容進行過多次研究，且均使用的是HPLC、毛細管電泳法等[16-18]。筆者在本研究過程中，利用HPLC 對其含量進行了精準測定，并參考有關(guān)學術(shù)資料[19]流動相采用酸性溶劑時FA 的分離度好，參照文獻[20]經(jīng)實驗后表明，采用甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50）為流動相，對樣品中FA 分離度均較好，出峰時間大約為10 min。綜上所述，本實驗建立的薄層和含量測定方法，操作簡便，重現(xiàn)性好?？勺鳛檐罕瓮璧馁|(zhì)量控制標準。