焉 揚(yáng),魯令華,劉曉東,杜恒裔,邵 坤,王述柏*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島 266109)

生物活性肽是對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)有一定生理作用的肽類化合物,相對(duì)分子質(zhì)量小于6 000 D[1-2],其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不一[3],是一類介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的多肽[4]。1902年,英國(guó)科學(xué)家Bayliss等[5]首次發(fā)現(xiàn)了生物活性肽,自此國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)活性肽開(kāi)展了大量研究[6]?；钚噪母鶕?jù)生理功能可分為免疫調(diào)節(jié)肽、抗菌肽、血壓調(diào)節(jié)肽、神經(jīng)活性肽、呈味肽等[7-8],其中免疫調(diào)節(jié)肽因其獨(dú)特的免疫增強(qiáng)作用備受研究者關(guān)注[9-10]。Xu等[11]從中華小公魚(yú)胃蛋白酶產(chǎn)物中篩選出具有免疫調(diào)節(jié)活性的五肽YVMRF,研究發(fā)現(xiàn)這種肽能促進(jìn)小鼠RAW264.7細(xì)胞系分化,增加一氧化氮(NO)、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)量。葉盛旺等[12]從青蛤胃蛋白酶產(chǎn)物中篩選出的活性肽免疫調(diào)節(jié)活性高,能顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的吞噬能力、NO的分泌水平和細(xì)胞因子的分泌量。Li等[13]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚(yú)蛋白得到多肽ACNGR,發(fā)現(xiàn)這種肽能提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠的免疫器官指數(shù),促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖,增加與腸黏膜免疫相關(guān)的SIgA、IgA、IL-6、IL-10的分泌,從而增強(qiáng)小鼠腸道黏膜的免疫功能，可見(jiàn)免疫調(diào)節(jié)肽有望成為動(dòng)物抗生素類飼用添加劑的替代物。但是，對(duì)新型飼用添加劑開(kāi)展毒理學(xué)評(píng)價(jià)是其推廣應(yīng)用前必不可少的。符大勇等[14]研究了海洋生物表面活性肽(SPR)的急性毒性,試驗(yàn)期間小鼠無(wú)任何中毒癥狀、無(wú)死亡,經(jīng)大體病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)臟器無(wú)異常變化,因此確定SPR對(duì)小鼠無(wú)毒性。劉泳廷等[15]利用小鼠的急性毒性試驗(yàn)研究野生盔孢傘中鵝膏毒肽的毒性,結(jié)果顯示小鼠出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀,隨鵝膏毒肽劑量的增加肝細(xì)胞腫脹、壞死,伴有出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)的病變逐漸加重,確定小鼠半數(shù)致死量(LD50)為108 mg/kg。筆者以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究了一種新合成免疫調(diào)節(jié)肽的急性毒性,旨在為其安全性評(píng)價(jià)和推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料免疫調(diào)節(jié)肽:白色粉末,純度不低于98.5%，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室制備。小鼠配合飼料及墊料，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物54只體重相近(24～26 g)的清潔級(jí)ICR系小鼠,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.3 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)試驗(yàn)于2017年5月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室進(jìn)行。

1.4 試驗(yàn)方法采用急性毒性試驗(yàn)的限量法[16]進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),將54只小鼠飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)觀察、適應(yīng)5 d,在此期間自由采食飲水；確認(rèn)健康無(wú)病后,將小鼠隨機(jī)分為3組(Ⅰ、Ⅱ組為試驗(yàn)組,Ⅲ組為對(duì)照組),每組18只(雌雄各半),公母分籠飼養(yǎng)。所有小鼠飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料保持一致。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)室溫20～25 ℃,濕度50%～70%,通風(fēng)良好,并保持衛(wèi)生清潔。

通過(guò)預(yù)試期試驗(yàn)獲得小鼠適宜灌胃量為0.2 mL/只,根據(jù)實(shí)測(cè)體重計(jì)算每只小鼠免疫調(diào)節(jié)肽的使用量,準(zhǔn)確稱取待檢樣品并將其溶于蒸餾水中。試驗(yàn)組Ⅰ和Ⅱ分別灌胃劑量200和400 mg/kg 的免疫調(diào)節(jié)肽溶液0.2 mL,對(duì)照組灌胃等量蒸餾水。灌喂前禁食6 h,只供應(yīng)飲水,給予受試物后繼續(xù)禁食2 h。

1.4.1臨床觀察。試驗(yàn)期間,每天觀察小鼠皮膚、被毛、眼、黏膜組織以及呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官有無(wú)異常變化,記錄動(dòng)物發(fā)生異常變化的時(shí)間、程度以及持續(xù)時(shí)間,評(píng)估可能發(fā)生毒性作用的靶器官或組織,精確記錄死亡時(shí)間和死亡時(shí)體重。觀察試驗(yàn)期間各組織器官的異常變化，判定依據(jù)參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。連續(xù)觀察14 d。

1.4.2生長(zhǎng)性能測(cè)定。于試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)日和試驗(yàn)期末,準(zhǔn)確稱量試驗(yàn)小鼠體重,每日準(zhǔn)確記錄加料重、剩料重,計(jì)算每日采食量。最后，計(jì)算試驗(yàn)期間平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.3病理學(xué)檢查。所有小鼠(包括試驗(yàn)過(guò)程中死亡小鼠、試驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠)均進(jìn)行大體解剖，觀察并記錄小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胃、腸、睪丸或卵巢的病理學(xué)變化;大體解剖病理改變時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行病理組織學(xué)觀察;準(zhǔn)確稱量各器官重量,計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=臟器重量/體重。

1.4.4血液生理學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.4.1血樣采集。于試驗(yàn)期結(jié)束日(第14天),采用摘眼球采血法采集血樣,一部分用于檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo),另一部分離心分離血清,用于檢測(cè)血清生化指標(biāo)。

1.4.4.2血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)。使用全自動(dòng)流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè),檢測(cè)指標(biāo)包括白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞比率、中性粒細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差、血小板總數(shù)、平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板壓積。

1.4.4.3血清生化指標(biāo)檢測(cè)。采用全自動(dòng)生化分析儀和試劑盒檢測(cè),檢測(cè)指標(biāo)包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、堿性磷酸酶活性、谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶活性以及總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、膽固醇、尿素、肌酐和葡萄糖含量。試驗(yàn)所用試劑盒均購(gòu)自北京安普生化科技有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件初步整理后,使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析和Duncan法進(jìn)行組間差異顯著性比較。試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。結(jié)果分析參考文獻(xiàn)[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察結(jié)果試驗(yàn)期間各試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的眼部(圖1)、鼻孔(圖2)、母鼠的乳房(圖3)、母鼠的陰部(圖4)、公鼠的陰部(圖5)以及小鼠的被毛(圖6)均未出現(xiàn)異常變化,呈健康狀態(tài)。

圖1 小鼠的眼部變化

圖2 小鼠的鼻孔變化

圖3 母鼠的乳房變化

圖4 母鼠的陰部變化

圖5 公鼠的陰部變化

圖6 小鼠的被毛變化

2.2 大體解剖病理學(xué)檢查結(jié)果解剖觀察各組小鼠的內(nèi)臟器官(包括胃、腸、肝、脾、腎、心臟、睪丸、卵巢),發(fā)現(xiàn)均無(wú)臨床病理學(xué)變化(公鼠見(jiàn)圖7,母鼠見(jiàn)圖8),呈健康狀態(tài)。

圖7 公鼠的腸、脾、心臟、胃、腎、睪丸和肝

圖8 母鼠的脾、肝、卵巢、心臟、胃、腎和腸

2.3 免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響由表1可知，試驗(yàn)組Ⅱ公鼠末重和平均日增重略高于對(duì)照組和試驗(yàn)組 Ⅰ(P>0.05),料重比分別較對(duì)照組和試驗(yàn)組 Ⅰ低0.77和0.40,但各組公鼠始重和末重?zé)o顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)期間各組公鼠的平均日采食量和料重比亦無(wú)顯著差異(P>0.05)。由表2可知，各組母鼠始重?zé)o顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ的母鼠末重、平均日增重均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),各組平均日采食量和料重比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。觀察期間，各組公鼠和母鼠均無(wú)死亡。

表1 各組公鼠生長(zhǎng)性能的比較

表2 各組母鼠生長(zhǎng)性能的比較

2.4 免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響由表3可知,各組小鼠的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞比率、中性粒細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中性粒細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差、血小板總數(shù)、平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板壓積均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較

2.5 免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響由表4可知,各組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、堿性磷酸酶活性和谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性無(wú)顯著差異(P>0.05),各組血清總蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、膽固醇、尿素、肌酐和葡萄糖含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4 各組小鼠血清生化指標(biāo)的比較

續(xù)表4

2.6 免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影由表5可知,各組公鼠、母鼠的臟器系數(shù)(包括肝、脾、腎、心臟、胃、腸)均差異不顯著(P>0.05),各組母鼠的卵巢系數(shù)及公鼠的睪丸系數(shù)亦無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 各組小鼠臟器系數(shù)的比較

3 討論

急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB 15193—2014規(guī)定:無(wú)毒或毒性微小的受試物適合采用限量法試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16]。生物活性肽屬于此類受試物[18-19],因此該試驗(yàn)采用限量法試驗(yàn)設(shè)計(jì)檢測(cè)免疫調(diào)節(jié)肽的急性毒性作用。周雯等[20]研究了一種生物活性肽粉對(duì)小鼠的急性毒性,結(jié)果顯示經(jīng)口急性毒性LD50大于10 000 mg/ kg。徐軍等[21]通過(guò)急性毒性試驗(yàn)研究了芽孢菌肽的毒性,觀察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡時(shí)間，并進(jìn)行毒性判斷,雌、雄小鼠的經(jīng)口急性毒性LD50分別為5 010和7 940 mg/kg。李函頻[22]以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,研究了融合肽hEGF-AWRK6的急性毒性,結(jié)果顯示觀察期間小鼠無(wú)死亡,給藥組的臟器系數(shù)、精子畸形率、血常規(guī)指標(biāo)與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異,因此認(rèn)為融合肽hEGF-AWRK6無(wú)急性毒性。宋淑敏等[23]研究了漢麻籽多肽粉的急性毒性,發(fā)現(xiàn)連續(xù)14 d的觀察期內(nèi)試驗(yàn)小鼠未見(jiàn)任何中毒癥狀,亦無(wú)死亡發(fā)生；對(duì)小鼠進(jìn)行大體病理學(xué)觀察,未見(jiàn)臟器異常改變,因此確定漢麻籽多肽粉對(duì)小鼠的經(jīng)口急性毒性LD50大于20 000 mg/kg。該試驗(yàn)結(jié)果表明,受試小鼠臨床觀察發(fā)現(xiàn)各組織器官無(wú)任何異常變化,受試物免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)公鼠生長(zhǎng)性能無(wú)不良影響,可顯著提高母鼠體重增長(zhǎng),受試小鼠血常規(guī)指標(biāo)及血清生化指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)顯著差異；大體解剖觀察發(fā)現(xiàn)，受試小鼠內(nèi)臟器官發(fā)育正常,無(wú)病理變化,與對(duì)照組相一致。該試驗(yàn)結(jié)果表明免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠未產(chǎn)生急性毒性作用,與上述報(bào)道結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)所用免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)小鼠無(wú)急性毒性作用,最大耐受劑量(MTD)大于5 000 mg/kg。