蘇瑩瑩，王 準，孫英旗，張雨佳，宋相偉

隨著全球人口老齡化現(xiàn)象愈加嚴重，老年疾病問題成為一大難題.最具有代表性的老年疾病阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）主要分為主觀認知下降（Subjective cognitive decline，SCD）、輕度認知障礙（Mild cognitive impairment，MCI）和癡呆幾個階段（Dementia of the Alzheimer type，DAT）［1］.AD 已經逐漸成為了老年人的頭號慢性殺手.AD 的發(fā)病機制學說中最為熱議的有以下2 種：β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β，Aβ）沉積及毒性作用和Tau 蛋白過度磷酸化（P-tau）或總Tau 蛋白（T-tau）神經原纖維纏結［2］.目前對于AD 的研究還在不斷地深入，但是還沒有找到有效的治療手段，因此更多的研究把重點轉移到早期診斷、預防，以及干預治療上.

早期AD 最常用的檢測方法有影像學診斷方法，如正電子發(fā)射型計算機斷層顯像技術（Positron emission computed tomography，PET）、磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、腦脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）檢測等，但影像學方法只能在AD 的中晚期才能檢測到，不能起到預防的作用，且費用昂貴，因此成像技術由于不能廣泛使用而逐漸被取代［3］.而CSF主要是針對AD 相關生物標志物的檢測如Aβ蛋白、Tau 蛋白、β 分泌酶、載脂蛋白，以及核酸水平非編碼RNA 等，此診斷技術是AD 早期診斷的重點之一，但CSF 中檢測的樣本需要腰椎穿刺，這種侵入性檢測方式可能會引起一定概率的并發(fā)癥，對患者也存在一定的風險［4］.相比之下，液體活檢—血液生物標志物檢測作為一種分子診斷技術，血液樣本的提取方便快捷、風險最小、成本也較低，一次只需少量血液即可檢測［5］.

本文主要給出幾種血液中的AD 蛋白生物標志物，包括Aβ 淀粉樣蛋白、Tau 蛋白、載脂蛋白E、神經絲輕鏈蛋白和外泌體等方面的研究進展，概述了血液檢測相對于PET 和CSF的優(yōu)勢所在，并與AD 的病理學特征相聯(lián)系，討論了將面臨的挑戰(zhàn)，以及未來展望.

1 β-淀粉樣蛋白（Amyloid-β，Aβ）

1.1 Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ1-40

AD 的主要病理學特征是β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑，β 淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）被β 分泌酶和γ 分泌酶水解產生Aβ，主要以Aβ1-40 和Aβ1-42 兩種形式存在［6］，但Aβ1-40 神經毒性遠遠小于Aβ1-42，且在AD 過程中幾乎無明顯變化，Aβ1-42 可在腦內聚集形成老年斑，損傷神經元等神經細胞［7］，因此以Aβ1-42/Aβ1-40 比值更能表現(xiàn)Aβ 總量在AD 過程中的變化趨勢.

研究顯示，AD患者血漿內的Aβ1-42/Aβ1-40有明顯的下降趨勢，且與腦脊液中的檢測結果有較高的相關性［8］.一項免疫沉淀結合質譜（Immunoprecipitation mass spectrometry，IP-MS）的研究結果發(fā)現(xiàn)，血漿中Aβ1-42 及Aβ1-40水平呈下降趨勢，此方法可以將高水平Aβ（Aβ+）和低水平Aβ（Aβ-）區(qū)分開來，且敏感性和特異性超過90%［9］.而采用單分子免疫列陣（Single-molecule array，Simoa）檢測發(fā)現(xiàn)血漿中Aβ 水平與腦脊液中Aβ 水平呈正相關，與對照組相比，AD 患者Aβ1-42 以及Aβ1-40 的含量均有下降趨勢，且Aβ1-42/Aβ1-40 在MCI患者血漿內有下降趨勢，AD 患者血漿內下降趨勢更明顯［10］.

以上研究結果皆表明Aβ 在MCI 患者血液內呈上升趨勢，而一旦進入癡呆晚期則會下降［8-10］，因此血液中Aβ 變化情況可作為診斷AD 的重要預測因子，并且在臨床應用上可能優(yōu)先于腦脊液或PET 檢測方法的使用.但目前有些研究結果還存在著矛盾，血漿中檢測到的Aβ 來源于外周組織，不能完全反映腦內Aβ 的變化，也可能與Aβ 的疏水性密切相關，使其與血漿蛋白結合，導致測量結果不準確［11］.因其在血液中的變化有著重要的意義，結合其他檢測方法能更好地完成AD 的早期預測與診斷.

1.2 Aβ 二級結構

AD 患者的β-淀粉樣蛋白（Aβ）肽的二級結構會從正常的無序狀態(tài)或α-螺旋改變?yōu)椤安±硇缘摹备缓?折疊（β-sheet）的二級結構.這種富含β-sheet 的結構聚集在一起，可以形成可溶性的有毒低聚物，最后形成肉眼可見的淀粉樣斑塊，這在臨床上通常被認為是導致AD 神經變性的原因，所以在臨床早期診斷出Aβ 二級結構的改變對檢測阿爾茨海默癥至關重要［12］.

NABERS 等人使用免疫紅外傳感器檢測發(fā)現(xiàn)，AD 患者血液中Aβ 的含量顯著下降，Aβ 錯誤折疊成了β-sheet 富集構象，且研究結果與CFS、PET 結果密切相關，血漿檢測Aβ二級結構的特異性和敏感性與腦脊液中Aβ二級結構的檢測結果十分接近，這表明Aβ 二級結構的改變可以作為AD 的血液生物標志物［12-13］，但由于Aβ 的結構不穩(wěn)定，可能在數(shù)小時內發(fā)生變化，該技術需要相對較高的技術，必須得到其他獨立研究的證實.

Aβ 在MCI 時期會有上升趨勢，隨著癡呆癥狀的嚴重，Aβ 就會過多地錯誤折疊成βsheet 富集構象，這也是造成AD 的主要原因之一（圖1），但對于Aβ 的錯誤折疊仍可能存在于非AD 患者中，而在一些AD 患者中不存在，因此會出現(xiàn)假陰性和假陽性的情況［14］，這也說明需要更多獨立臨床的研究去驗證其準確性與敏感性，使Aβ 二級結構的改變成為檢測AD 一個獨立的標志物.

圖1 Aβ 二級結構的形成

2 Tau 蛋白

Tau 是一種正常的、未展開的、高可溶性的蛋白，在AD 中，Tau 蛋白翻譯后修飾，特別是過度磷酸化被認為是影響微管組裝和誘導Tau 蛋白聚集的關鍵因素［15］.在Tau 蛋白過度磷酸化過程中，Tau 蛋白發(fā)生構象變化，Tau 蛋白單體轉化為Tau 低聚物誘導Tau 蛋白聚集成成對螺旋狀，導致腦細胞神經纖維纏結（NFTs）的形成（圖2）.科學證據(jù)表明，Tau 蛋白低聚物是導致AD 突觸損傷的毒性最大的蛋白形式［16］.

圖2 NFTs 的形成

Tau 磷酸位點與AD 密切相關，包括Ptau181、P-tau217 和P-tau231，其中P-tau181 在AD 的研究中最廣泛，準確度也最高.一項研究采用Simoa 和電化學發(fā)光MSD（Meso Scale Discovery，MSD）的方法對臨床患者，以及對照組血漿中的總Tau（T-tau）和P-tau181 水平進行檢測，結果顯示AD 患者血漿中T-tau 和Ptau181水平明顯高于健康人群［17］.BARTHELEMY等人采用質譜（MS）的分析方法發(fā)現(xiàn)，血漿中P-tau217 和P-tau181 與CSF 呈高度的正相關，腦脊液與血漿T-tau 蛋白水平和測量值之間無相關性，P-tau217 和P-tau181 對淀粉樣斑塊病理具有高度特異性［18］.此外還有學者采用Simoa 在四個臨床試驗中做出關于P-tau181 蛋白的評估，研究發(fā)現(xiàn)在驗證的所有個體中，認知未受損的老年人和年輕人P-tau181 蛋白水平明顯低于AD 組以及淀粉樣-β 陽性的MCI組，因此可通過血漿中P-tau181 水平來區(qū)分AD 和健康人群［19］.

Tau 蛋白神經纖維纏結，以及磷酸化作為AD 的病理學研究的核心蛋白，其在血液中的檢測可作為區(qū)分認知未受損的正常人群和AD 患者的重要指標.盡管目前研究表明Tau蛋白在AD 中發(fā)揮著重要作用，但其特異性還有待研究，在許多其他老年疾病如中風、創(chuàng)傷性腦組織損傷等Tau 蛋白也會有上升的趨勢［17］，與之相比腦脊液中的Tau 蛋白的檢測結果特異性和準確性會更高些，因此在未來血液中對Tau 蛋白的檢測仍需發(fā)掘新技術和更多的數(shù)據(jù)去驗證其準確性.

3 載脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）

載脂蛋白E（ApoE）是一種廣泛表達于人體的35-kDa 糖蛋白，具有多態(tài)性和遺傳上的異質性，作為脂質轉運體ApoE 基因在群體中存在三個不同的蛋白亞型：ApoE2、ApoE3 和ApoE4，以及三種編碼基因：?2、?3 和?4，其中導致患AD 的主要是?4 等位基因，?3 是最常見的基因型但無致病性，?2 則有預防AD 發(fā)病的作用.大量研究表明ApoE4 亞型與AD 的主要病理特征，如Aβ 蛋白沉積、Tau 蛋白過度磷酸化及神經纖維纏結，以及該疾病的其他標志（包括炎癥和氧化應激）息息相關［20-21］.

TENG 等人采用多重免疫分析（MyriadRBM）的方法研究了參與者的血漿ApoE 水平和海馬體積磁共振成像指數(shù)之間的橫斷面關聯(lián).在認知正常組（NC 組）和MCI 組中，血漿中ApoE較低的個體海馬體積或海馬徑向距離也相對較小，且這些關聯(lián)都是在一個攜帶ApoEε-4 等位基因的攜帶者發(fā)現(xiàn)的，血漿ApoE 水平可能代表了非AD個體轉化為AD患者的外周標志［22］.另有研究采用蛋白免疫印跡（Western blot），以及免疫染色的方式檢測了受試者血漿中ApoE 的濃度，結果顯示晚期AD 患者血漿中ApoE 濃度明顯高于對照組，研究表明AD 患者血漿ApoE 水平的升高與Aβ 淀粉樣蛋白的增長趨勢呈正相關，為了闡明ApoE 亞型與Aβ 相互作用的性質和意義，并確定ApoE 的水平是否在AD 的發(fā)病機制中起著關鍵作用，還需要進一步的研究［23］.

ApoE 與AD 之間有著密不可分的關系，ApoE 蛋白的多態(tài)性會引起細胞毒性導致Aβ沉積從而完成MCI 到AD 的轉化，除以上研究以外，更有研究證明在腦脊液中ApoE4 與Tau蛋白之間也有著千絲萬縷的聯(lián)系［24］，這也說明ApoE4 可以通過多途徑增加患AD 的概率.而ApoE 作為血液中一種常見的蛋白，其特異性還有待研究，如果能有效地分離血漿中的ApoE，會大大地提高ApoE 作為診斷AD 的特異性和準確性.

4 神經絲輕鏈蛋白（neurofilaments，NfL）

神經絲輕鏈蛋白（NfL）是神經絲三聯(lián)蛋白的一個亞單位，NfL 的異常表達及人類的NfL 基因突變與多種疾病密切相關［25］.正常情況下，軸突會釋放少量的NfL，隨著年齡的增加，NfL 的釋放會逐漸增多，一些炎癥性和神經退行性疾病會導致中樞神經系統(tǒng)的軸突急速釋放大量的NfL［26］.

在一項橫斷面研究中，對受試者采集血清用ELISA 檢測NfL 水平，AD 患者和MCI 患者的NfL 水平明顯高于對照組，且MCI 組的結果最高，這些結果提示血清NfL 蛋白也許可以作為預測AD 早期的外周血生物標志物，為前期的診斷及早期治療提供依據(jù)［27］.MATTSSON等人采用Simoa 技術檢測結果發(fā)現(xiàn)血漿中NfL與腦脊液中NfL 檢測結果呈正相關，MCI 患者與AD 患者的血漿NfL 相比對照組升高，由此證明高血漿NfL 與認知不良和AD 相關萎縮（在基線和縱向上）及腦低代謝（縱向）相關［28］.

隨著有關血漿中NfL 的研究逐漸深入，可發(fā)現(xiàn)血漿中NfL 濃度似乎反映了神經元的損傷程度，且與AD 相關蛋白Aβ、Tau 蛋白等息息相關.另有研究表明血液中NfL 的濃度與年齡也呈高度正相關，隨著年齡的增長，血漿中NfL 也逐漸增加［29］，因此對于血漿中NfL 濃度與衰老機制的關系還不夠明確，還需進一步研究，使血漿中NfL 的檢測成為診斷早期AD的一個重要的生物標志物.

5 外泌體中的蛋白標志物

外泌體（Exosomes）是大腦中神經元細胞、小膠質細胞和星膠質細胞等分泌在細胞外的囊泡結構，其內攜帶功能性信使RNA、非編碼RNA、蛋白質（Aβ、Tau 等）、脂類、DNA 等來源細胞的生物活性物質（圖3），在大腦中，外泌體參與細胞通信來調節(jié)細胞功能［30］，而且通過CSF 在全腦廣泛傳播，因此，外泌體及其組分主要在AD、帕金森病和亨廷頓病等神經退行性疾病中發(fā)揮作用.目前對AD 外泌體的研究主要是通過檢測AD 相關蛋白（Aβ、Tau、突觸蛋白等）和miRNA［31］.

圖3 血液中的外泌體

對血液外泌體樣本中Aβ、Tau、P-tau181蛋白進行了ELISA 檢測，發(fā)現(xiàn)早期AD 患者血液外泌體中的Aβ、Tau、P-tau181 水平明顯升高［32］.另一項研究則采用Western blot 對血液外泌體進行了分析，結果顯示AD 組外泌體中的Aβ、T-tau 和P-tau181 濃度均高于MCI 組和對照組，每個外泌體生物標志物的水平與腦脊液中的水平呈高度相關［33］.血液外泌體的檢測可以預測到MCI 向AD 的轉化，因此從血液檢測外泌體中的特定毒性蛋白有望成為診斷早期AD 的一種方法［34］.

除此之外，血清外泌體ATP 結合盒轉運體A1（ABCA1）蛋白，是一種在外泌體生成過程中被裝載到外泌體膜上的蛋白，研究表明ABCA1 蛋白參與AD 的發(fā)展過程［35］.采用ELISA 和MS 的檢測方法分別對小鼠和臨床患者做了兩組實驗，研究結果發(fā)現(xiàn)高濃度ABCA1外泌體可通過血腦屏障到達外周血而被有效檢測，隨著AD 的進展程度，血清中外泌體ABCA1 蛋白會逐漸升高，但在主觀認知下降（SCD）組上升得并不顯著，因此對于血清中外泌體ABCA1 蛋白的檢測或許可以成為診斷AD 的一個新的外泌體蛋白標志物［36］.

外泌體是由磷脂雙分子層構成，因此可通過胞吞作用跨越血腦屏障.但由于血漿的高黏度，外泌體的分離純化變得復雜，許多研究開始通過富集和純化血液來檢測和分析神經源性外泌體中的蛋白質［37］.如果能從血液中成功提純神經源性外泌體，將會更快地實現(xiàn)AD 的血液外泌體檢測和診斷.

6 結語

根據(jù)血液中蛋白標志物的變化趨勢能夠在AD 早期進行診斷，且與CSF 和PET 的檢測方法相比較，血液檢測更具有靈敏性、便捷性.但由于血液中AD 相關蛋白的含量較低，導致檢測結果存在一定的差異性與局限性，還需大量的重復實驗才可投入到臨床應用.總而言之，關于AD 蛋白標志物的研究還需要回歸到AD 病理機制的問題進行研究，且隨著檢測技術的不斷發(fā)展，有關血液中新的蛋白標志物在不斷地挖掘，其敏感性與特異性也會在研究中不斷提高，未來液體活檢技術將會成為最具潛力的一種檢測方式.