胡文龍，謝雨瑤，楊新霞，牛麗偉，楊新生，楊菁

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)；2.錦州衛(wèi)生學(xué)校外科教研室，遼寧 錦州 121000)

氧化苦參堿(OMT)為苦參和苦豆子的主要有效單體成分，在我國(guó)已有臨床應(yīng)用[1]。在臨床上，有關(guān)氧化苦參堿的應(yīng)用制劑主要為氧化苦參堿注射液、氧化苦參堿膠囊以及片劑，主要用于乙型肝炎及腫瘤的治療。近年來(lái)的研究證據(jù)表明，氧化苦參堿具有抑制炎癥、清除自由基、保護(hù)肝臟、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用，可能在改善代謝和老齡相關(guān)認(rèn)知功能退變等方面具有良好的臨床應(yīng)用前景[1]。OMT可以顯著緩解急性腦梗死大鼠腦水腫，抑制炎癥，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]。腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)的激活與炎癥密切相關(guān)[3]。而在細(xì)胞水平上，OMT是否可以調(diào)節(jié)AS炎癥因子釋放，卻未見(jiàn)報(bào)道。利用脂多糖(LPS)刺激AS，引起炎癥反應(yīng)[4]。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等重要的病理過(guò)程密切相關(guān)。本研究利用分離純化獲得AS，并采用LPS刺激該細(xì)胞制備損傷模型，通過(guò)此模型觀察OMT對(duì)炎癥因子釋放的影響；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)活性氧(ROS)含量及NF-κB激活狀態(tài)探討其作用機(jī)制，將OMT的作用機(jī)制引向深入。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑

24 h內(nèi)新生SD大鼠，購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。氧化苦參堿，純度>99.0%，購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)液，購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。脂多糖、D-Hank’s液、DAPI染液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；2'，7' -二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)探針、0.25%胰酶-EDTA，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、P-NF-κB p65、β-actin一抗購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)[5]。取新生24 h內(nèi)的SD大鼠，無(wú)菌取出雙側(cè)大腦皮質(zhì)。皮質(zhì)用D-Hank’s沖洗3次后，用眼科剪將皮質(zhì)剪成小塊。然后加0.25%胰蛋白酶溶液5 mL，10 min后等體積15%胎牛血清培養(yǎng)液?；旌虾筮^(guò)濾。細(xì)胞濾液加入無(wú)菌離心管中，1000×g離心5 min，棄上清液，試管中加入5 mL含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，吹打成懸液后轉(zhuǎn)移到25 cm2培養(yǎng)瓶中，放培養(yǎng)箱中4 h后，再將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液吸出，重新鋪入新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育。第2 d換1次液，以后每3 d換液1次。培養(yǎng)胞增殖至培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí)傳代。細(xì)胞培養(yǎng)到第三代時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞純度鑒定

第三代細(xì)胞接種于蓋玻片，4 d后用PBS緩沖液沖洗，行常規(guī)免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法，即蓋玻片細(xì)胞用多聚甲醛固定。然后0.5% TritonX-100室溫處理，血清封閉后加入小鼠抗GFAP單克隆一抗抗體，濕盒中4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS緩沖液漂洗，加羊抗小鼠FITC單克隆二抗抗體，然后PBS緩沖液洗滌3次。DAPI復(fù)染，PBS緩沖液沖洗，最后倒置熒光顯微鏡下觀察。選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。AS細(xì)胞GFAP 陽(yáng)性，顯綠色熒光，為含有的AS數(shù)量；DAPI染核，呈藍(lán)色，為細(xì)胞總數(shù)，其比值為細(xì)胞純度。

1.2.3 細(xì)胞分組和藥物處理

當(dāng)?shù)谌?xì)胞增殖到瓶底約80%時(shí)，利用無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化。同步化的細(xì)胞隨機(jī)被分為對(duì)照組、LPS組、LPS+OMT組(100、300、900 μg/mL)。對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；LPS 組則在培養(yǎng)液中加入終濃度為1 mg/L的 LPS后，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h[5]330-337；LPS+OMT組培養(yǎng)液中分別加入終濃度為 100、300、900 μg/mL 的OMT，1 h后再加入終濃度為 1 mg/L的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 MTT法檢測(cè)AS細(xì)胞存活率

按 1.2.3細(xì)胞分組和藥物處理，按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[5]330-337。即繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后加入 20 μL MTT 溶液(5 g/L)，37 ℃培養(yǎng)4 h后 ，利用培養(yǎng)板離心機(jī)1000×g離心10 min后棄上清，然后每孔加入DMSO 150 μL后，震蕩破壞細(xì)胞膜后，于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)。以對(duì)照組的A值為100%，其它組與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。

1.2.5 DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)AS中ROS水平

按“1.2.3”細(xì)胞分組和藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，避光加入1 mL按一定比例稀釋的DCFH-DA探針(以1∶1000用不含血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)25 min。所有孔避光棄上清，加入1 mL 0.25%胰酶細(xì)胞消化液，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱消化，取出用顯微鏡觀察，待細(xì)胞呈圓形，加入等體積完全培養(yǎng)液終止消化，并吹下所有貼壁細(xì)胞，分別收集細(xì)胞至15 mL離心管，800×g離心3 min。避光棄上清，每管加入3 mL PBS重懸細(xì)胞，800×g再次離心3 min。避光棄上清，每管加入500 μL PBS重懸，并轉(zhuǎn)移到流式管內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.6 Western Blot法檢測(cè)P-NF-κB p65蛋白含量

培養(yǎng)細(xì)胞結(jié)束后用RIPA裂解液冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白。調(diào)整蛋白含量至1 mg/mL。加熱變形后利用10%的SDS-PAGE分離蛋白后再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜用5% BSA封閉液，然后用TBST洗，然后加入p-NF-κB p65或β-actin一抗4 ℃過(guò)夜。次日采用TBST洗后，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育。膜用TBST后用ECL顯影液顯影成像，用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Shapiro-Wilk 和 Levene’s tests先檢測(cè)所有數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布以及方差齊性。多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK方法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AS細(xì)胞純度鑒定

GFAP主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的AS中，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成，是AS鑒定的公認(rèn)標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，98%以上的細(xì)胞顯示綠色熒光，即表明培養(yǎng)的細(xì)胞純度為98%以上。能滿足實(shí)驗(yàn)的需要，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均采用該條件下分離純化后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)細(xì)胞純度鑒定(200×)

2.2 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

MTT檢測(cè)OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表1所示，LPS組細(xì)胞存活率降低至對(duì)照的49.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說(shuō)明LPS造成了細(xì)胞損傷。與LPS組比較，LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)組細(xì)胞存活率升高，分別為63.7%、77%、91.7%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，說(shuō)明OMT對(duì)LPS造成的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。從效果看，隨著濃度的升高，保護(hù)效果越強(qiáng)。

表1 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響

2.3 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的影響

為觀察OMT對(duì)AS細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，采用ELSA方法對(duì)培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α含量進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組AS培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平比對(duì)照組明顯升高(P<0.001)。當(dāng)培養(yǎng)液中加入100、300、900 μg/mL OMT后可以明顯抑制LPS引起的IL-1β和TNF-α釋放(P<0.001)，并且濃度越高抑制效果越明顯，見(jiàn)表2。

2.4 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平的影響

活性氧(ROS)是指氧的某些代謝產(chǎn)物和一些反應(yīng)的含氧產(chǎn)物，主要包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等[6]。ROS是導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要因素之一，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞中ROS水平[6]975-977，見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)LPS組AS中，ROS水平由對(duì)照組的19.80%，升高至55.60%(P<0.001)。與LPS組比較，LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)組細(xì)胞中ROS含量分別降低至44.90%、39.90%、32.20%，提示OMT可有效抑制LPS誘導(dǎo)的AS氧化損傷，見(jiàn)圖2。

表2 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的影響

A:對(duì)照組；B：LPS組；C：LPS+OMT 100 μg/mL；D:LPS+OMT 300 μg/mL；E：LPS+OMT 900 μg/mL；F:各組ROS含量，與LPS組相比，** P<0.001圖2 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平的影響

2.5 OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白的影響

OMT對(duì)LPS引起的胰島內(nèi)皮細(xì)胞P-NF-κB p65升高具有抑制作用[7]，因此推測(cè)OMT也可能通過(guò)同樣的機(jī)制在AS細(xì)胞中揮作用。結(jié)果顯示，LPS組AS中P-NF-κB p65蛋白表達(dá)量是對(duì)照組的2.2倍。LPS+OMT(100、300、900 μg/mL)P-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，其中又以900 μg/mL OMT組最明顯，見(jiàn)圖3。

與LPS組相比，**P<0.001圖3 Western Blot法檢測(cè)OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞中P-NF-κB p65蛋白的影響

3 討 論

缺血性腦卒中是造成患者腦功能障礙的常見(jiàn)疾病。在腦缺血等病理情況下，AS出現(xiàn)活化，缺血區(qū)周?chē)写罅緼S的聚集，對(duì)于恢復(fù)腦功能具有積極作用。但過(guò)度的AS聚集活化引起的炎癥對(duì)神經(jīng)元卻又有不利影響[8-9]。在分離的大鼠皮層細(xì)胞中，有神經(jīng)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本實(shí)驗(yàn)選用差速貼壁技術(shù)、傳代等技術(shù)，獲得了純度98%以上的AS細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。LPS由類脂 A、核心多糖和O-多糖側(cè)鏈組成，常在體外研究中刺激誘導(dǎo)AS活化，引起炎癥，是常用的刺激物[10]。作者選通用的1 mg/L LPS對(duì)AS進(jìn)行刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AS細(xì)胞IL-1β和TNF-α釋放水平升高接近對(duì)照組的3倍，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。再此基礎(chǔ)上，對(duì)OMT的抗炎效果進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明100、300、900 μg/mL OMT對(duì)與LPS刺激釋放的IL-1β和TNF-α均具有抑制作用，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

氧化應(yīng)激損傷是由ROS生成能力與消除能力失衡導(dǎo)致。AS細(xì)胞激活后，可以通過(guò)提高GSH生成、增強(qiáng)過(guò)氧化物酶等發(fā)揮抗氧化作用，但過(guò)度升高可造成細(xì)胞損傷[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS可以引起AS細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高，而OMT對(duì)ROS的升高具有抑制作用，說(shuō)明OMT的抗炎作用可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

細(xì)胞內(nèi)的ROS升高會(huì)觸發(fā)一系列信號(hào)通路，包括激活NF-κB[12]。NF-κB有p50和p65兩個(gè)亞基，它是轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)IL-1β和TNF-α的釋放引發(fā)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用，但過(guò)度激活也可以IL-1β和TNF-α的過(guò)度釋放，反而造成細(xì)胞損傷[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)主要通過(guò)NF-κB p65亞基發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。未刺激時(shí)，NF-κB p65與NF-κB抑制蛋白結(jié)合在胞漿中。當(dāng)受刺激后，NF-κB p65被磷酸化激活，引起變構(gòu)，脫離抑制蛋白后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[14]，促炎癥因子表達(dá)及釋放。NF-κB p65的磷酸化是該過(guò)程的關(guān)鍵[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS導(dǎo)致AS的P-NF-κB p65含量明顯升高，而OMT對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化具有抑制作用，因此有理由推測(cè)OMT可能是通過(guò)抑制κB p65磷酸化，進(jìn)而減少炎癥因子IL-1β和TNF-α的釋放。

綜上所述，OMT可抑制LPS引起的AS損傷及炎癥因子的釋放，其機(jī)制可能與其清除ROS、抑制NF-κB p65磷酸化來(lái)發(fā)揮作用。但同時(shí)也意識(shí)到，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)中參與炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞，而OMT對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞及其與AS細(xì)胞的相互影響仍需進(jìn)一步研究。