葉超群 黃會芝

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒期常見的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無論是足月兒還是早產(chǎn)兒，都有較高的死亡率；此外，HIBD 也是兒童嚴(yán)重神經(jīng)殘疾的主要原因。每年，全世界1.3 億新生兒中有400 萬嬰兒患有HIBD，其中有100 萬人死于腦損傷，存活下來的HIBD 嬰兒通常會遺留智力低下、腦癱、癲癇和其他功能障礙，嚴(yán)重影響了患兒的生活質(zhì)量。這無論是對于患兒家庭還是社會而言，都是嚴(yán)重的創(chuàng)傷[1-2]。然而，HIBD 發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，亞低溫是目前唯一公認(rèn)有效的治療方案，但對于中重度腦損傷患兒的療效有限，仍有相當(dāng)一部分患兒死亡或存在各種形式的后遺癥[3-5]，因此迫切需要新的治療策略。

缺氧誘導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)域蛋白-1a（hypoxia inducible gene domain family 1a，Higd 1a）又稱為HIG1 或HIMP1-a（hypoglycemia/hypoxia inducible mitochondrial protein 1）是一種存在于多種類型細(xì)胞線粒體的內(nèi)膜蛋白，在真核生物中廣泛表達(dá)，包括真菌和人類。Higd 1a 最初在人工培養(yǎng)的人宮頸上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，遂被證明可以在富含神經(jīng)元的原代培養(yǎng)基中被低氧誘導(dǎo)及在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中被鎳誘導(dǎo)[6-7]。近年來發(fā)現(xiàn)其在腦、心臟、結(jié)腸、腎和肝臟等組織中普遍表達(dá)，而在小鼠的小腦、額葉和皮質(zhì)中表達(dá)水平尤為明顯。Higd 1a 由93 個氨基酸組成，分子量為10.6 kDa，等電點(diǎn)為9.8，基因定位于8 號染色體8q32，基因庫序列編碼AY062253，基因序列全長527 bp。Higd 1a 具有兩個跨膜區(qū)，它的兩個選擇性剪接產(chǎn)物（HIMP1-a 和HIMP1b）各自形成一個跨膜環(huán)，“U”形穿過線粒體內(nèi)膜，并具有“N 端-C 端”方向，其N 端和C 端位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)。Higd 1a 受缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）調(diào)控，主要由缺氧和低糖誘導(dǎo)表達(dá)，參與應(yīng)激反應(yīng)中的抗凋亡過程，并與微環(huán)境應(yīng)激條件有關(guān)，其中也以缺氧最為多見。據(jù)報道，Higd 1a 具有調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)功能，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)功能，如能量的產(chǎn)生、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)及鈣穩(wěn)態(tài)、抗細(xì)胞凋亡等[8-9]。Higd 1a 在低氧條件下的抗細(xì)胞凋亡作用為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供了新的方向，故本文主要綜述Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的分子機(jī)制及Higd 1a 在缺氧缺血中的作用，并為Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的應(yīng)用提供更有力的證據(jù)，為進(jìn)一步探索腦缺氧缺血性損傷的治療提供新的靶向治療方案。

1 線粒體Higd 1a在缺氧缺血性腦損傷中的分子機(jī)制

缺氧缺血性腦損傷的具體機(jī)制尚不完全明確，興奮毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡機(jī)制共同參與并最終導(dǎo)致腦損傷，線粒體損傷則貫穿整個損傷過程，并成為新生兒缺氧應(yīng)激后的神經(jīng)退行性變中的關(guān)鍵階段，與隨后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通路有關(guān)，是缺氧缺血損傷的關(guān)鍵標(biāo)志[10-11]。當(dāng)缺氧缺血時，腦細(xì)胞線粒體在缺氧早期即發(fā)生一系列不可逆性損傷，腦作為體內(nèi)代謝最活躍的器官之一，較容易受到血氧供應(yīng)不足的損害[12]。腦缺氧缺血發(fā)生后，腦內(nèi)葡萄糖、糖原、三磷酸腺苷（ATP）和磷酸肌酸的濃度立即下降，并在缺血后10～12 min 幾乎完全耗盡。根據(jù)動物模型的缺氧缺血狀態(tài)的研究已證實(shí)，在缺氧缺血開始后的幾分鐘內(nèi)即已出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)元損傷[13]。線粒體的結(jié)構(gòu)、功能異常與腦缺氧缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，線粒體的損傷程度同時也提示了缺氧缺血性腦損傷的嚴(yán)重程度[14]。在缺氧缺血等應(yīng)激條件下，腦細(xì)胞對能量的需求尤為明顯，而線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心，在腦細(xì)胞缺氧缺血損傷的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的影響，故而線粒體成為神經(jīng)保護(hù)的主要目標(biāo)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，Higd 1a 可以保護(hù)細(xì)胞免受低血糖和低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞的存活時間，這提示Higd 1a 在線粒體應(yīng)激保護(hù)中發(fā)揮重要作用[16]，Higd 1a 的高表達(dá)則提示了腦損傷的良好預(yù)后。

線粒體是細(xì)胞生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，為機(jī)體提供95%以上的能量，對維持細(xì)胞正常生理功能起著重要作用。然而線粒體卻是對損傷極為敏感的細(xì)胞器，其腫脹可由多種損傷因子引起，其中最常見的即為缺氧。Higd 1a 的表達(dá)是由缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）誘導(dǎo)，Higd 1a 可能在線粒體呼吸鏈中發(fā)揮多效性作用。暴露在18%和5%氧氣中的細(xì)胞之間的Higd 1a 蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但在缺氧早期，Higd 1a 蛋白水平升高?？梢娋€粒體Higd 1a 在腦缺氧缺血性損傷中的作用主要與氧化呼吸鏈有關(guān)，包括正向調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C 氧化酶的產(chǎn)生及抑制氧氣消耗，降低細(xì)胞活性氧水平。近年來有研究發(fā)現(xiàn)中視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）、γ 分泌酶復(fù)合體與Higd 1a 在缺氧條件下的表達(dá)相關(guān)，可能成為Higd 1a 在腦缺氧缺血性損傷中不可缺少的部分。

1.1 Higd 1a 與細(xì)胞色素C 氧化酶 細(xì)胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，CcO）是線粒體電子傳遞系統(tǒng)的末端成分，同時也是呼吸電子傳遞鏈的第四個中心酶復(fù)合物，因此又被稱為復(fù)合物Ⅳ（complex Ⅳ），是細(xì)胞耗氧的主要部位，也是以ATP的化學(xué)形式產(chǎn)生有氧能量所必需的[17]。一方面，Higd 1a 參與復(fù)合體Ⅳ的組裝，以形成呼吸超復(fù)合體[18]。另一方面，細(xì)胞色素C 與Higd 1a 結(jié)合，使血紅蛋白的親和力下降，由于CcO 是體內(nèi)唯一一種可以利用氧氣進(jìn)行能量傳遞的酶，因此也有研究認(rèn)為CcO 的調(diào)節(jié)機(jī)制依賴于氧濃度[19]。Hayashi 等[20]在尋找一種由低氧驅(qū)動的CcO 調(diào)節(jié)因子的過程中發(fā)現(xiàn)Higd 1a 是CcO 的正調(diào)控因子，通過純化外源性Higd 1a 蛋白，建立ATP 敏感的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）探針檢測內(nèi)源性Higd 1a 蛋白的表達(dá)量，證明了通過內(nèi)源性誘導(dǎo)Higd 1a 的表達(dá)及外源性增加Higd 1a 蛋白都可提高CcO 的表達(dá)量。該研究發(fā)現(xiàn)在Higd 1a 缺氧早期被瞬時誘導(dǎo)，直接連接并整合到CcO 大分子復(fù)合體中，并使CcO 的活性中心—血紅素a 的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化磷酸化過程，使ATP 的產(chǎn)生增加，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺氧的影響。Higd 1a 是CcO的一個先前未知的調(diào)節(jié)成分，并且代表著與CcO 活性降低相關(guān)的疾病的治療靶點(diǎn)，為細(xì)胞的缺氧缺血性損傷提供新的治療方向。

1.2 Higd 1a 與活性氧（ROS）線粒體的關(guān)鍵功能是產(chǎn)生ATP，并作為細(xì)胞中的能量發(fā)生器，它們在需要高濃度ATP 的大腦和心臟組織中尤其重要。然而，高水平的ROS 是高ATP 產(chǎn)生的副產(chǎn)品。Li 等[21]研究發(fā)現(xiàn)在線粒體損傷時，高水平的ROS 可以通過上調(diào)PGC-1a 和HIF-1a 的表達(dá)來誘導(dǎo)Higd 1a 的表達(dá)，并通過幫助維持正常的線粒體功能來保護(hù)細(xì)胞免受缺氧的影響。另一方面，Higd 1a 基因敲除實(shí)驗(yàn)表明，即使在常氧條件下，Higd 1a 缺失也會增加活性氧的產(chǎn)生，并損害線粒體的跨膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Guo 等[22]證明了在豬的支持細(xì)胞中，過表達(dá)的Higd 1a 可抑制ROS 的水平。此外，在缺氧和缺血期間，ROS 的大量產(chǎn)生與腦損傷之間有直接關(guān)系，而且與其他器官相比，Higd 1a 在大腦和心臟中的表達(dá)水平非常高。這表明Higd 1a 可能會抑制這些腦組織中過量的ROS 產(chǎn)生，并保護(hù)它們免受氧化應(yīng)激的傷害。

1.3 Higd 1a 與OPA1 OPA1 基因?qū)儆诤嘶?，編碼的蛋白是線粒體內(nèi)源發(fā)動蛋白，是線粒體塑形蛋白家族的成員。OPA1 蛋白有L 和S 兩種亞型，參與線粒體內(nèi)膜融合，對線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)有著重要的作用。OPA1 與呼吸作用復(fù)合物直接相關(guān)，作為呼吸鏈的一部分，保持呼吸鏈的完整性，參與呼吸作用和能量代謝，在細(xì)胞凋亡過程中則與早老素相關(guān)菱形樣（presenilin associated rhomboid like，PARL）蛋白以O(shè)PA1-PARL 復(fù)合體的形式發(fā)揮抗凋亡因子的作用。

An 等[23]實(shí)驗(yàn)證明，Higd 1a 的N 端與OPA1 結(jié)合，進(jìn)而保護(hù)OPA1 L 亞型免受誘導(dǎo)切割；Higd 1a沉默則導(dǎo)致L 亞型丟失，繼而線粒體脊裂解，線粒體DNA 丟失，細(xì)胞生長遲緩；然而，在細(xì)胞處于低氧條件（0.1%O2）下12 h，Higd 1a 過表達(dá)并延長OPA1 L 亞型的切割時長至6 h。由此可知，在正常條件下，Higd 1a 通過結(jié)構(gòu)性表達(dá)保持OPA1 的完整性，而在缺氧條件下，它的過表達(dá)雖不能完全阻止OPA1 的切割，但通過推遲OPA1 的切割來緩解細(xì)胞壓力，維持線粒體完整性，進(jìn)而幫助細(xì)胞抵抗缺氧損傷，這一研究發(fā)現(xiàn)為對抗缺氧性損傷提供了新的治療方向。

1.4 Higd 1a 與γ 分泌酶復(fù)合體 γ 分泌酶復(fù)合體是由四個亞單位組成的膜內(nèi)蛋白水解酶，包括早老素（presenilin，PS）包括PS1 和PS2，中前咽缺陷蛋白-1（Aph-1），早老蛋白增強(qiáng)子-2（Pen-2）和Nicastrin，主要參與β-淀粉樣蛋白前體（APP）和Notch 蛋白等重要跨膜蛋白的切割和水解過程。Hayashi 等[24]從對γ 分泌酶抑制基因的篩選中分離到Higd 1a，并發(fā)現(xiàn)Higd 1a 的過表達(dá)可抑制γ 分泌酶活性。Higd 1a 與線粒體膜上的γ 分泌酶成分（PS1、Nicastrin、Aph-1 和Pen-2）直接結(jié)合，降低γ-分泌酶活性，從而減少ROS 的產(chǎn)生和線粒體功能障礙，此外，Higd 1a 的缺失增加了γ 分泌酶的激活，增強(qiáng)了缺氧所致的線粒體功能障礙。綜上所述，Higd 1a 過表達(dá)可使缺氧誘導(dǎo)的線粒體膜γ 分泌酶活性減低并減少細(xì)胞內(nèi)β 淀粉樣蛋白的積聚，從而減輕缺氧引起的線粒體功能障礙，故Higd 1a是線粒體γ 分泌酶復(fù)合體的一種新的調(diào)節(jié)劑，并在維持正常線粒體功能方面發(fā)揮重要作用，是涉及線粒體損傷性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。

1.5 Higd 1a 與caspase caspase 是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。為了解缺氧和Higd 1a 過表達(dá)是否影響caspases 的激活，An 等[25]將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Higd 1a 的巨噬細(xì)胞（RAW）在缺氧條件下培養(yǎng)6 d，并在指定的時間進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Higd 1a 的巨噬細(xì)胞（RAW）在低氧條件下比模型轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活得更好，而將穩(wěn)定表達(dá)caspase的巨噬細(xì)胞在caspase 抑制劑下培養(yǎng)6 d 也明顯減少了細(xì)胞凋亡。這證明了caspase 活性是由Higd 1a 通過底物和caspase 抑制劑來調(diào)節(jié)的。降低caspases的活性參與了Higd 1a 細(xì)胞在缺氧條件下的存活效應(yīng)。

2 Higd 1a在缺氧缺血性疾病中的研究前景

Higd 1a 被發(fā)現(xiàn)在心臟、腦和肝臟組織中高度表達(dá)，在腎臟和骨骼肌中低水平表達(dá)[24]。Kurosh 等[26]實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)源性Higd 1a 是體內(nèi)代謝應(yīng)激的潛在標(biāo)記物，常見于不同的病理狀態(tài)，如心肌梗死、缺氧缺血性腦損傷和不同類型的癌癥。可見Higd 1a在緩解缺氧缺血性組織損傷中有充分的理論證據(jù)。

外源Higd 1a 可以使低氧條件下斑馬魚線粒體中的呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ（C-Ⅳ）的活性增加，CcO 活性增加，同時增加ATP 的合成，提高心臟對于缺氧的耐受性，并發(fā)揮器官保護(hù)作用。在斑馬魚的缺氧模型中，通過測量線粒體ATP 濃度，可以證明Higd 1a 的組織保護(hù)作用。心臟特異性Higd 1a的過度表達(dá)緩解了低氧條件下線粒體ATP 的下降，并保護(hù)了斑馬魚的心功能[19]。這一結(jié)果表明，通過Higd 1a 模擬物可以增加CcO 活性，可能有治療線粒體疾病的潛力，為缺血性、代謝性和線粒體疾病的治療提供選擇。

Higd 1a 可對抗葡萄糖饑餓并通過減少細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長。Ameri 等[27]研究了Higd 1a 在多種人類癌細(xì)胞系中的調(diào)控模式，并發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血最明顯的腫瘤壞死區(qū)域，代謝應(yīng)激源觸發(fā)Higd 1a 的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。另一方面，Higd 1a抑制與乳腺癌治療后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，Higd 1a 抑制與乳腺癌治療后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，Higd 1a 會根據(jù)細(xì)胞在不同的應(yīng)激條件下進(jìn)而產(chǎn)生不同的效應(yīng)，當(dāng)嚴(yán)重缺氧的腫瘤細(xì)胞面臨葡萄糖剝奪時，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的活性被抑制，促進(jìn)Higd 1a 表達(dá)，對異常代謝環(huán)境適應(yīng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞休眠[28]。這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞在極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供了新的見解，Higd 1a可能在腫瘤休眠或復(fù)發(fā)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)缺氧腫瘤區(qū)域Higd 1a 活性可能有助于克服在抗血管生成或HIF 抑制所介導(dǎo)的腫瘤休眠。線粒體蛋白HIGD 家族的小分子調(diào)節(jié)劑為這一可能性提供了方向[29]。

Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性損傷時定位于細(xì)胞核。免疫熒光顯微鏡顯示，在對照的新生兒腦中，內(nèi)源性Higd 1a 主要在細(xì)胞核外少量表達(dá)；然而在缺氧缺血性腦損傷的新生兒腦內(nèi)，內(nèi)源性Higd 1a 的表達(dá)水平明顯升高[24]。Higd 1a 作為一種在應(yīng)激反應(yīng)中抗細(xì)胞凋亡的蛋白，在大鼠出生后的早期即廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其表達(dá)量在大腦中的分布不同并隨個體年齡的變化而變化。Higd 1a 在海馬、丘腦核、梨狀內(nèi)核和尾殼核高度表達(dá)，并隨著出生后年齡的增長，其表達(dá)量也逐漸增加。在嚴(yán)重應(yīng)激期間，即在缺血性心臟病、缺氧缺血性腦病和癌癥的背景下，Higd 1a 從胞漿池移位到細(xì)胞核，且Higd 1a的核定位與應(yīng)激的嚴(yán)重程度相關(guān)[30]。

綜上所述，Higd 1a 對于HIBI 后的線粒體損傷程度起到了明確的緩沖作用，Higd 1a 沉默會影響細(xì)胞融合。這些證據(jù)都提示了Higd 1a 的表達(dá)在HIBI中的研究價值，然而目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于Higd 1a靶向治療HIBI 的報道，外源性Higd 1a 靶向治療HIBI 的療效值得進(jìn)一步探究。